徐錦 張臘紅 劉曉婷 孟憲梅 姚心怡 許寧沁 陳兆軍

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性感染性疾病[1]。根據(jù)《2023 全球結(jié)核病報(bào)告》顯示，全球范圍預(yù)估上一年度結(jié)核病新發(fā)病例為1 060 萬(wàn)，約130 萬(wàn)人死于結(jié)核[2]。耐藥結(jié)核病包括單耐藥結(jié)核病、多耐藥結(jié)核病、耐多藥結(jié)核病、準(zhǔn)廣泛耐藥結(jié)核病、廣泛耐藥結(jié)核病以及利福平耐藥結(jié)核病[3]。最新數(shù)據(jù)表明，全球耐多藥/利福平耐藥結(jié)核病的患者數(shù)量約為41 萬(wàn)，我國(guó)耐藥結(jié)核病患者報(bào)告病例數(shù)大致是1.24萬(wàn)（總數(shù)預(yù)估為3 萬(wàn)多），僅有40%左右患者確診，而其中得到有效治療的耐藥結(jié)核病患者約占80%[2]。耐藥結(jié)核病數(shù)量的增加，對(duì)當(dāng)前結(jié)核病防治工作帶來(lái)了極大挑戰(zhàn)。已有文獻(xiàn)報(bào)道，耐藥結(jié)核病與非耐藥結(jié)核病患者有免疫反應(yīng)的差異[4]。目前大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道集中在耐藥和耐多藥結(jié)核病患者的T 淋巴細(xì)胞表達(dá)水平方面[5-7]，但鮮有報(bào)道耐藥結(jié)核病患者外周血指標(biāo)表達(dá)情況的報(bào)道。因此，本研究檢測(cè)了耐藥結(jié)核病患者外周血中補(bǔ)體3（complement3，C3）、C4、IgA、IgM、IgG、轉(zhuǎn)鐵蛋白、總蛋白、白蛋白、球蛋白、白蛋白/球蛋白、纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)ib）及D-二聚體（D-dimer，D-D）的表達(dá)情況并進(jìn)行分析，以期發(fā)現(xiàn)耐藥結(jié)核病的特異性實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2018 年1 月至2023 年6 月于杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院收治的386 例非耐藥結(jié)核病患者，男207 例，女179 例，年齡18～78（52±22）歲；118 例耐藥結(jié)核病患者，男66 例，女52 例，年齡18～79（46±20）歲；選取同期同院體檢健康者76 名作為健康組，男35名，女41 名，年齡18～75（42±13）歲；各項(xiàng)體檢指標(biāo)及影像學(xué)檢查均正常。3 組對(duì)象性別（χ2=2.370，P=0.379）和年齡（F=1.825，P=0.162）比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)核病的診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS 288-2017）和結(jié)核病分類標(biāo)準(zhǔn)（WS 196-2017）。非耐藥結(jié)核病患者納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）低熱、咳嗽、咳痰、咯血等明顯的臨床癥狀；（2）胸部X線或CT 檢查考慮結(jié)核，且為初次治療；（3）痰涂片抗酸桿菌陽(yáng)性及痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性；（4）結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。耐藥結(jié)核病患者納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）有明顯臨床癥狀，胸部X線或CT 檢查考慮結(jié)核；（2）痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性；（3）結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明,至少對(duì)1 種及以上一線抗結(jié)核藥物耐藥。所有對(duì)象均排除使用糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑以及艾滋病、惡性腫瘤、糖尿病、血液系統(tǒng)疾病、非結(jié)核分枝桿菌感染的肺部疾病、妊娠或哺乳期婦女等。本研究經(jīng)杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)[批準(zhǔn)文號(hào)：2023（E2）-KS-059]，患者或家屬均知情同意。

1.2 標(biāo)本采集與檢測(cè)方法 于清晨空腹抽取所有研究對(duì)象的外周靜脈血2 管（枸櫞酸鈉抗凝管、含促凝劑管）各5 mL，3 000 r/min 離心10 min（離心半徑15 cm）分離血漿或血清備用。血清檢測(cè)C3、C4、IgA、IgM、IgG、轉(zhuǎn)鐵蛋白、總蛋白、白蛋白、球蛋白以及白蛋白/球蛋白，血漿檢測(cè)Fib 及D-D。血清C3、C4 和IgA、IgM、IgG 及轉(zhuǎn)鐵蛋白的檢測(cè)用免疫散射比濁法測(cè)定，使用貝克曼IMMAGE800 特定蛋白分析儀及配套試劑操作；血清總蛋白檢測(cè)采用雙縮脲法，白蛋白檢測(cè)采用溴甲酚綠法，球蛋白及白蛋白/球蛋白檢測(cè)采用計(jì)算法，使用貝克曼AU5800 全自動(dòng)生化儀及配套試劑操作；血漿Fib 檢測(cè)采用凝固法，血漿D-D 檢測(cè)采用膠乳免疫比濁法，使用SYSMEX CS5100 全自動(dòng)凝血分析儀及配套試劑操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布計(jì)量資料則用M（P25，P75）表示，多組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)，組間比較用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

結(jié)果表明，3 組對(duì)象C3、C4、IgA、IgG、轉(zhuǎn)鐵蛋白、Fib、D-D、總蛋白、白蛋白及白蛋白/球蛋白比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；耐藥組C3明顯低于非耐藥組和健康組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；非耐藥組C4 高于耐藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；非耐藥組IgA、IgG 均高于健康組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；耐藥組與非耐藥組Fib、D-D 均高于健康組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；耐藥組與非耐藥組總蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白及轉(zhuǎn)鐵蛋白均低于健康組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 3組對(duì)象外周血指標(biāo)結(jié)果的比較

3 討論

結(jié)核分枝桿菌為兼性胞內(nèi)寄生菌，寄生于宿主細(xì)胞內(nèi)。結(jié)核分枝桿菌的各種免疫逃逸機(jī)制使之可以在宿主中長(zhǎng)期生存繁殖[8]。結(jié)核病患者的細(xì)胞免疫和體液免疫功能均受到不同程度的損害[9]，機(jī)體自身的免疫水平與結(jié)核病進(jìn)展也有著密切聯(lián)系[10-13]。而耐藥結(jié)核病相比于非耐藥結(jié)核病其免疫系統(tǒng)受到更嚴(yán)重的損害[14-15]。

通過(guò)對(duì)耐藥結(jié)核病和非耐藥結(jié)核病患者外周血指標(biāo)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，結(jié)核病患者（耐藥/非耐藥）與健康組相比，D-D 和Fib 升高，總蛋白、白蛋白、白球比、轉(zhuǎn)鐵蛋白下降；這說(shuō)明耐藥結(jié)核病和非耐藥結(jié)核病患者有著基本相似的免疫反應(yīng)：肝臟損傷（總蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白及轉(zhuǎn)鐵蛋白下降），凝血指標(biāo)異常（Fib、DD 升高）。在耐藥結(jié)核組中C4 低于非耐藥結(jié)核組，但與健康組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；耐藥結(jié)核組與非耐藥結(jié)核組、健康組均有差異性的外周血指標(biāo)只有C3。

C3 是補(bǔ)體系統(tǒng)中最重要的組成成分。補(bǔ)體系統(tǒng)屬于體液免疫，是抵御病原菌的首要防線[16]，由絲氨酸蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)組成，通過(guò)補(bǔ)體蛋白的連續(xù)裂解，最終導(dǎo)致膜攻擊復(fù)合物的形成，其目的是清除和遏制感染，但是補(bǔ)體系統(tǒng)不平衡也會(huì)影響宿主細(xì)胞，使細(xì)菌持續(xù)存在并逃避免疫系統(tǒng)的清除[17-18]。補(bǔ)體受體（complement receptor，CR）協(xié)助結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入吞噬性巨噬細(xì)胞，并通過(guò)各種適應(yīng)性防御在其胞內(nèi)成功增殖從而導(dǎo)致疾病[19]。Wang 等[20]通過(guò)iTRAQ-2D LC-MS/MS 技術(shù)聯(lián)合Solexa 測(cè)序發(fā)現(xiàn)耐多藥肺結(jié)核和非耐藥肺結(jié)核患者組間有50 多種差異表達(dá)蛋白大多有補(bǔ)體途徑參與。有研究實(shí)驗(yàn)表明結(jié)核分枝桿菌生物膜修飾了其細(xì)胞壁碳水化合物使補(bǔ)體沉積減少，即補(bǔ)體系統(tǒng)活化減少[21]。在結(jié)核感染中補(bǔ)體具有至關(guān)重要的作用[22]。補(bǔ)體系統(tǒng)中C3 為參與增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌的黏附和攝取人血清中的主要成分，并且能夠調(diào)理結(jié)核分枝桿菌表面，通過(guò)CR1 和CR3 被巨噬細(xì)胞識(shí)別[23]。Naranjo 等[24]對(duì)野豬和牛分枝桿菌之間分子相互作用的表征表明，編碼補(bǔ)體成分C3 和其他先天性及適應(yīng)性免疫反應(yīng)蛋白的基因在淋巴結(jié)和扁桃體中的上調(diào)與對(duì)天然分枝桿菌感染的抗性相關(guān)。更高的C3 水平可能允許增加的調(diào)理吞噬作用和有效的細(xì)菌清除，同時(shí)干擾CR3 介導(dǎo)的分枝桿菌的聲波和非聲波吞噬作用[25]。有回顧性研究表明低水平的C3 在結(jié)核性腦膜炎感染中有較高的死亡率[26]。耐藥結(jié)核病患者中較低的C3 水平，進(jìn)一步說(shuō)明耐藥結(jié)核桿菌在感染宿主時(shí)，因補(bǔ)體系統(tǒng)功能嚴(yán)重紊亂不能很好的清除結(jié)核分枝桿菌，從而導(dǎo)致單核巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的附著和吞噬能力減弱，病原菌清除受限，繼而促進(jìn)了病原菌在宿主的進(jìn)一步生長(zhǎng)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)C3 在耐藥組中低于非耐藥組和健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說(shuō)明C3 在耐藥結(jié)核病患者中表達(dá)水平的降低對(duì)于臨床有一定應(yīng)用價(jià)值，但是否能作為耐藥結(jié)核病的特異性指標(biāo)，有待于進(jìn)一步深入研究探討。

綜上所述，外周血中C3 在耐藥結(jié)核病患者中的表達(dá)差異，提示耐藥結(jié)核病患者補(bǔ)體系統(tǒng)失衡，體液免疫功能受損。