張鈞 張路 孔瑩瑩

成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及CRISPR 相關(guān)基因（CRISPR-associated，Cas）系統(tǒng)，即CRISPR/Cas 系統(tǒng)，通常由一組特征性CRISPR 陣列和CRISPR 相關(guān)基因組成，CRISPR 陣列包含重復(fù)序列和間隔序列，重復(fù)序列分散在可變的間隔序列之間。CRISPR 相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄翻譯為Cas 蛋白，具有核酸酶活性[1]。

CRISPR/Cas 系統(tǒng)是遍布于古菌和細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，其防御過程通常包括3 個階段：適應(yīng)、表達和干擾。當(dāng)噬菌體等外源基因入侵時，細(xì)菌表達Cas蛋白形成復(fù)合物，通過識別外源基因中稱為原間隔鄰近基序（protospacer-adjacent motif，PAM）的特定短序列結(jié)合外源基因，并切割部分外源序列插入自身重復(fù)序列之間，形成CRISPR 陣列，此階段稱為適應(yīng)階段。當(dāng)噬菌體等外源基因再次入侵，古菌和細(xì)菌中CRISPR 陣列經(jīng)轉(zhuǎn)錄加工成前CRISPR RNA（precrRNA），并進一步加工成更成熟的CRISPR RNA（crRNA），每個RNA 包含間隔序列和部分側(cè)翼重復(fù)序列，此階段稱為表達階段。接著，crRNA 與Cas 蛋白復(fù)合物結(jié)合形成有活性的復(fù)合體，在crRNA 引導(dǎo)下，Cas 蛋白復(fù)合體識別外源基因中的PAM 序列并在上游3 nt 位置切割降解外源核酸，此階段稱為干擾階段[1]。目前CRISPR/Cas 系統(tǒng)已被用作強大的RNA 引導(dǎo)DNA/RNA 靶向平臺，用于基因組編輯[2-4]、轉(zhuǎn)錄干擾[5-6]、表觀遺傳調(diào)控[7]、靶標(biāo)檢測[8]等。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種CRISPR/Cas 系統(tǒng)，不同系統(tǒng)中Cas 蛋白序列、基因組成和基因組位點結(jié)構(gòu)顯示出較大多樣性。根據(jù)上述基因序列的進化關(guān)系，將CRISPR/Cas 分為6 型（Ⅰ～Ⅵ）[9]。按照各系統(tǒng)發(fā)揮作用的不同方式又將這6 型分為兩大類[9-10]，這兩類系統(tǒng)在crRNA 加工和干擾相關(guān)效應(yīng)模塊的體系結(jié)構(gòu)方面存在根本差異。Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型屬于經(jīng)典的1 類CRISPR/Cas 系統(tǒng)，由多個Cas 蛋白組成的效應(yīng)模塊介導(dǎo)pre-crRNA 加工和干擾。相比之下，2 類系統(tǒng)由單一多結(jié)構(gòu)域的Cas 蛋白發(fā)揮作用，它結(jié)合了干擾所需的所有活動，更適合用于開發(fā)基因編輯和靶標(biāo)檢測平臺[11-14]。2 類系統(tǒng)主要包括Ⅱ、Ⅴ和Ⅵ類系統(tǒng)，其中，Cas9、Cas12 和Cas13 分別代表Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型系統(tǒng)的效應(yīng)器。

核酸是分子診斷技術(shù)檢測感染性疾病、抗生素耐藥性基因、癌癥或遺傳疾病發(fā)展相關(guān)的突變、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）和生物標(biāo)志物的重要目標(biāo)。當(dāng)前核酸檢測技術(shù)主要基于PCR，需要專業(yè)的設(shè)備，且需高溫打開雙鏈以啟動后續(xù)擴增循環(huán)，極大限制了其在實驗室外場景中的應(yīng)用。CRISPR/Cas 系統(tǒng)具有在溫和環(huán)境下對靶標(biāo)進行高效特異識別和切割的優(yōu)勢，將其應(yīng)用于核酸檢測將是開發(fā)高靈敏度和高特異度的快速、便攜、低廉的床旁檢測方向，本文就這一領(lǐng)域的最新發(fā)展方向作一述評。

1 各種CRISPR/Cas 系統(tǒng)的基本原理

1.1 Cas9 Cas9 作為Ⅱ型系統(tǒng)的標(biāo)志蛋白，CRISPR/Cas9 是最早發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于基因編輯的經(jīng)典系統(tǒng)。該系統(tǒng)由Jinek 等[15]于2012 年首次發(fā)現(xiàn)，已在體外證明其可切割雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）。不久，Cong 等[2]利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在大腸桿菌中實施基因組編輯，Pardee 等[16]利用CRISPR/Cas9 的PAM 特異識別切割特性，與核酸序列擴增（nuclear acid sequence-based amplification，NASBA）結(jié)合，以單堿基分辨率區(qū)分Zika 菌株。

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是RNA 引導(dǎo)的dsDNA 靶向平臺，包含Cas9 蛋白、crRNA 和反式激活crRNA（transactivating crRNA，tracrRNA）三部分[17]。其中，Cas9 蛋白為雙葉結(jié)構(gòu)，具有RuvC、HNH 核酸酶結(jié)構(gòu)域等多個參與靶DNA 切割的亞結(jié)構(gòu)域（圖1A）[18-19]。crRNA 和tracrRNA 通過互補序列結(jié)合形成雙鏈向?qū)NA（small guide RNA，sgRNA）[20]?？梢愿鶕?jù)靶DNA 及上下游序列設(shè)計合適的sgRNA，其中crRNA 部分與目標(biāo)序列互補而結(jié)合到目標(biāo)序列上，該過程起到了招募和引導(dǎo)功能，同時引起整個sgRNA 結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，激活與之結(jié)合的Cas9 蛋白。Cas9 蛋白被激活后識別靶DNA 上的PAM 位點，即形式為5'-NGG-3'（N 代表任意堿基）的短DNA 序列，并在PAM 位點上游3 nt 位置進行特異性切割[2-3]。一般情況下，Cas9 蛋白需要與sgRNA（或crRNA 和tracrRNA）進行預(yù)孵育，形成Cas9 sgRNA 復(fù)合物，該復(fù)合物能精確定位于原間隔序列的PAM 靶位點，以實現(xiàn)對dsDNA 的精確特異切割功能，這種切割方式稱為順式切割。CRISPR/Cas9 的特異識別和順式切割特性是其用于開發(fā)核酸檢測系統(tǒng)的主要原理。

圖1 CRISPR/Cas 的結(jié)構(gòu)和裂解活性示意圖[18]

1.2 Cas12 和Cas14 Cas12a（以前稱為Cpf1）是V 型系統(tǒng)的標(biāo)志蛋白。由Zetsche 等[21]在2015 年發(fā)現(xiàn)第1個用于基因組編輯的Cas12 核酸酶。與Cas9 相似，Cas12a 可介導(dǎo)順式切割，即識別和切割目標(biāo)dsDNA 中PAM（“TTTN”，N 代表任意堿基）附近的靶序列。不同之處在于Cas12a 只有唯一的催化結(jié)構(gòu)域RuvC，且介導(dǎo)其自身crRNA 的成熟，無需tracrRNA 和額外的核酸酶來處理crRNA（圖1B）[18]。此外Cas12a-crRNA 復(fù)合物還具有非特異性反式切割活性，即一旦Cas12a 完成對目標(biāo)dsDNA 的順式切割，RuvC 的活性位點就會空出，供任何單鏈DNA（single strand DNA，ssDNA）進入并被切割[22-24]。Cas12a 的反式切割活性裂解報告熒光探針是其用于開發(fā)核酸檢測系統(tǒng)的重要原理。

CRISPR/Cas12b（也稱為C2c1）作為一種獨特的VB 型系統(tǒng)，是一種雙RNA 引導(dǎo)的DNA 核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)[25]。與Cas12a 不同，crRNA 和tracrRNA 與Cas12b 的結(jié)合對于引導(dǎo)鏈和靶鏈之間的配對至關(guān)重要。值得注意的是，Cas12b 的反式切割特性對單核苷酸錯配極為敏感，這對于開發(fā)單核苷酸分辨率的檢測系統(tǒng)具有極大的優(yōu)勢[26]。另外，Cas12b 的體積比Cas9 和Cas12a小，在與病毒載體一起遞送細(xì)胞時具有優(yōu)勢[27]。

Cas14a 也屬于Ⅴ型系統(tǒng)，具有對ssDNA 的特異順式切割活性和非特異反式切割活性（圖1C）[18]。Cas14（也稱為Cas12f）是一個非常緊湊的RNA 引導(dǎo)核酸酶家族，大小為400～700 個氨基酸，是目前已知的Ⅱ類CRISPR/Cas 的一半，在與病毒載體一起遞送細(xì)胞時特別有吸引力。另外，Cas14 可以在tracrRNA 和crRNA（或sgRNA）的引導(dǎo)下特異性結(jié)合和切割靶ssDNA，而不需要PAM 位點的限制，具有較大的靈活性[28-30]。

1.3 Cas13 Ⅵ型系統(tǒng)的典型代表Cas13a（也被命名為C2c2），由Shmakov 等[13]于2015 年發(fā)現(xiàn)，具有高級真核生物和原核生物核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（nucleotidebinding，HEPN）（圖1D）。Cas13a 是一種RNA 引導(dǎo)的RNA 靶向平臺，即利用crRNA 作為向?qū)碜R別和切割靶RNA[13]。研究證實，Cas13a 既能特異性識別和剪切靶向RNA 片段，也能不加選擇地切割任意RNA序列（類似于Cas12a）[31-32]。特異順式切割靶RNA 以及非特異反式切割報告熒光探針是Cas13a 用于建立核酸檢測的兩個主要特性。利用這些特性，Gootenberg 等[8]建立了首個基于CRISPR/Cas13 的核酸檢測系統(tǒng)SHERLOCK（specific high sensitivity enzymatic reporter unlock），實現(xiàn)單堿基分辨率檢測DNA 和RNA 靶標(biāo)。

總的來說，諸如對dsDNA/ssDNA/RNA 的特異性識別和順式切割、對ssDNA/RNA 的非特異性反式切割以及僅使用crRNA 的引導(dǎo)等特性，已經(jīng)引起了CRISPR/Cas 在核酸檢測應(yīng)用的關(guān)注。

2 CRISPR/Cas 系統(tǒng)在核酸靶標(biāo)檢測的應(yīng)用

CRISPR/Cas 系統(tǒng)對核酸的特異性識別為核酸檢測提供了獨特的優(yōu)勢。通常情況下，由于靶標(biāo)檢測濃度較低，需要將CRISPR/Cas 系統(tǒng)與核酸擴增技術(shù)相結(jié)合進行檢測。近年來，基于CRISPR/Cas 系統(tǒng)的無預(yù)擴增核酸檢測系統(tǒng)也在陸續(xù)開發(fā)中。無預(yù)擴增核酸檢測系統(tǒng)主要通過兩種方案放大信號：第一，利用Cas12a、Cas13a 和Cas14 蛋白靶向結(jié)合后激活的反式裂解活性，可以在一定程度上實現(xiàn)對原始信號的擴增。第二，利用多種Cas 效應(yīng)蛋白作為高度特異性的序列識別元件，結(jié)合電化學(xué)、比色法和熒光等多種信號輸出方法，開發(fā)無擴增系統(tǒng)，實現(xiàn)核酸的高靈敏度和高特異度檢測。

2.1 結(jié)合靶標(biāo)預(yù)擴增的CRISPR/Cas 核酸檢測系統(tǒng)

2.1.1 基于順式切割原理的核酸靶標(biāo)檢測

2.1.1.1 CUT-PCR Lee 等[33]基于CRISPR 內(nèi)切酶活性結(jié)合PCR 方法開發(fā)了一種新方法，即CUT-PCR（CRISPR-mediated ultrasensitive detection of target DNA）。該方法可以利用CRISPR/Cas 內(nèi)切酶切割野生型序列，減少背景DNA 信號，并通過PCR 擴增豐富癌癥特異性突變體DNA 信號。CUT-PCR 方法尤其適合去除血液中大量的野生型片段，極大提高循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor deoxyribonucleic acid，ctDNA）的檢測靈敏度。CUT-PCR 還可以結(jié)合靶向深度測序檢測廣泛的癌基因，具有較高的靈敏度（＜0.01%）和準(zhǔn)確性，優(yōu)于傳統(tǒng)的靶向深度測序。

2.1.1.2 CRISPR/Cas9 觸發(fā)的等溫指數(shù)擴增反應(yīng)（CRISPR/Cas9 triggered isothermal exponential amplification reaction，CAS-EXPAR） Huang 等[34]結(jié)合CRISPR/Cas9 位點特異性切割的優(yōu)勢和等溫指數(shù)擴增技術(shù)的動力學(xué)優(yōu)勢構(gòu)建的檢測系統(tǒng)稱為CAS-EXPAR，該方法具有快速、位點特異性核酸檢測的功能。該方法的主要原理是利用CRISPR/Cas9 的特異識別和切割特性從長鏈DNA 或RNA 產(chǎn)生特異性EXPAR 觸發(fā)器，觸發(fā)指數(shù)擴增，既利用了EXPAR 優(yōu)越的擴增動力學(xué)，又采用CRISPR/Cas9 彌補傳統(tǒng)EXPAR 只適用于檢測短序列的局限，見圖2。結(jié)果表明，該方法對單堿基錯配具有良好的特異性，檢出限為0.82 amol，且可以在1 h內(nèi)檢測到DNA。通過將單堿基甲基化轉(zhuǎn)化為單堿基突變，CAS-EXPAR 還能夠?qū)崿F(xiàn)位點特異性DNA 甲基化檢測，這對于監(jiān)測腫瘤的診斷和預(yù)后至關(guān)重要。

圖2 CAS-EXPAR 的機制示意圖[34]

2.1.1.3 CRISDA 檢測系統(tǒng) 雖然PCR 是最廣泛使用的DNA 擴增方法，但熱循環(huán)的要求限制了其非實驗室應(yīng)用。因此，等溫DNA 擴增技術(shù)在代替?zhèn)鹘y(tǒng)PCR 的現(xiàn)場診斷應(yīng)用中具有價值。鏈置換擴增（strand displacement amplification，SDA）具有較高的擴增效率，采用在引物上引入限制性內(nèi)切酶識別序列而使擴增反應(yīng)可在恒溫條件下進行，但第一步仍然需要高溫打開雙鏈，并未達到真正的“恒溫”。Zhou 等[35]利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在天然DNA 分子中引入單鏈斷裂或缺口，恒溫條件下從天然雙鏈DNA 生成大量單鏈DNA，啟動SDA，建立了稱為CRISDA（a CRISPR-Cas9-triggered nicking endonuclease mediated strand displacement amplification method）的檢測系統(tǒng)，具體原理見圖3。整個過程在25～40 ℃的恒定溫度下進行，真正實現(xiàn)了恒溫擴增。結(jié)合肽核酸侵襲介導(dǎo)的終點測量，該方法在復(fù)雜樣品背景下檢測各種DNA 靶標(biāo)時具有aM 靈敏度和單核苷酸特異性。CRISDA 是一種強大的等溫工具，用于超靈敏和特異性的核酸檢測，尤其適用于即時診斷和現(xiàn)場分析。

圖3 CRISDA 的反應(yīng)機制示意圖[35]

2.1.1.4 RACE 檢測系統(tǒng) 細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）衍生的miRNA 譜在疾病診斷和預(yù)后評估中具有重要價值。但直接和可靠地檢測EV 衍生的多個miRNA 仍然具有挑戰(zhàn)性，因為大約19～23 個核苷酸的小尺寸很難設(shè)計用于傳統(tǒng)PCR 反應(yīng)的引物[36-37]。Wang 等[38]整合CRISPR/Cas9 高度特異識別切割和方便快捷的優(yōu)點以及滾環(huán)擴增（rolling circular amplifification，RCA）高靈敏度和高特異度的優(yōu)勢建立了稱為RACE（RCA-assisted CRISPR/Cas9 cleavage）的檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)通過在RCA 循環(huán)中引入PAM 位點，設(shè)計帶有PAM 且與RCA 產(chǎn)物中特異性靶標(biāo)互補的熒光探針，CRISPR/Cas9 特異識別和切割RCA 產(chǎn)物中PAM 附近的靶標(biāo)序列和熒光探針，釋放熒光，見圖4。釋放的CRISPR/Cas9 復(fù)合體觸發(fā)新一輪的識別和切割，通過這一過程可以實現(xiàn)循環(huán)切割，直到所有靶標(biāo)都被切割。通過設(shè)計多對RCA 的掛鎖探針和熒光探針，并改變熒光探針的熒光基團即可實現(xiàn)多重miRNA 的檢測。RACE 在檢測培養(yǎng)癌細(xì)胞和臨床肺癌患者與RT-qPCR顯示出高度一致性，驗證了其穩(wěn)健性，單重檢測可以達到90 fM 的靈敏度，揭示了其在疾病的篩查、診斷和預(yù)后方面的潛力?？傊琑ACE 具有高靈敏度和高特異度，可實現(xiàn)多重檢測的方便快捷檢測系統(tǒng)，用于即時診斷和現(xiàn)場分析。

圖4 RACE 的反應(yīng)機制示意圖[38]

2.1.2 基于反式切割原理的核酸靶標(biāo)檢測

2.1.2.1 DETECTR 檢測系統(tǒng) 一旦CRISPR/Cas12a 與crRNA 和靶DNA 形成復(fù)合體，該系統(tǒng)的反式切割活性就能有效裂解系統(tǒng)中的任何ssDNA。Chen 等[24]充分利用了這一特點，將重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）與Cas12a 結(jié)合建立了DETECTR（DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter）的檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括Cas12a、crRNA 和熒光團猝滅劑標(biāo)記的報告基因，一旦Cas12a 檢測到并切割目標(biāo)DNA 序列，就會激活反式切割活性，切割帶有熒光團猝滅劑標(biāo)記的TaqMan 探針，釋放熒光。通過監(jiān)測熒光信號可以準(zhǔn)確地定量靶DNA 的存在。結(jié)果表明，DETECTR 系統(tǒng)可以準(zhǔn)確地從臨床樣本中檢測出16 型和18 型以外的HPV 類型。Harrington 等[28]將DETECTR 的原理與Cas14a 的高特異性結(jié)合靶標(biāo)特性相結(jié)合，開發(fā)出Cas14a-DETECTR，可實現(xiàn)高保真SNP基因組分型。

2.1.2.2 HOLMES Li 等[39]利用Cas12a 在熒光標(biāo)記的ssDNA上的反式切割功能，開發(fā)了HOLMES（an one-hour low-cost multipurpose highly efficient system）。HOLMES與DETECTR 系統(tǒng)的不同之處在于，HOLMES 借助PCR對實驗?zāi)０暹M行擴增。在目標(biāo)DNA 存在的情況下，Cas12a-crRNA 與目標(biāo)DNA 形成三元復(fù)合物，并反式切割ssDNA，產(chǎn)生熒光信號。SNP 是人類最常見的遺傳變異，與疾病的易感性和發(fā)病率密切相關(guān)。HOLMES平臺通過在引物中引入相關(guān)的PAM 序列，能夠檢測SNP 位點的存在。

2.1.2.3 CDetection Teng 等[40]發(fā)現(xiàn)從嗜酸乳桿菌Cas12b（Alicyclobacillus acidophilus Cas12b，AaCas12b）中提取的Cas12b 系統(tǒng)對dsDNA 敏感。該團隊基于AaCas12b-sgRNA-dsDNA 激活劑系統(tǒng)設(shè)計基于Cas12b的DNA 檢測（CDetection）平臺[41]。當(dāng)激活劑濃度超過10 nM 時，CDetection 不僅可以檢測HPV，還可以區(qū)分HPV16 和HPV18。若引入調(diào)諧向?qū)NA（tune guide RNA，tgRNA），CDetection 可以在單堿基水平上區(qū)分差異，并以較高的準(zhǔn)確性確定ABO 血型。

2.1.2.4 SHERLOCK 不同于Cas12 的crRNA 引導(dǎo)的dsDNA 識別和切割活性，Cas13 是一種crRNA 引導(dǎo)識別和切割靶RNA 的核酸酶活性[13]，特別適合用于開發(fā)RNA 靶標(biāo)檢測。張峰團隊首次利用Cas13 對RNA 特異識別和非特異反式切割活性，結(jié)合RPA 擴增靶標(biāo)，開發(fā)了SHERLOCK（specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking），提供了具有aM 靈敏度和單堿基錯配特異性的快速DNA 或RNA 檢測[8]。隨后，多個團隊在SHERLOCK 的基礎(chǔ)上修改完善補充，開發(fā)了多個高靈敏高特異方便快捷的檢測系統(tǒng)[42-45]。

2.2 無靶標(biāo)預(yù)擴增的CRISPR/Cas 核酸檢測系統(tǒng) 為了達到較好的靈敏度和特異度，目前的CRISPR 系統(tǒng)經(jīng)常與擴增技術(shù)相結(jié)合，以實現(xiàn)靶富集和信號擴增。而無擴增核酸檢測的優(yōu)點主要包括原始信號檢測提高保真性、避免潛在的氣溶膠污染和縮短檢測時間等。利用無擴增系統(tǒng)是CRISPR/Cas 檢測的大趨勢。構(gòu)建無擴增系統(tǒng)的策略主要包括CRISPR/Cas 產(chǎn)生的反式裂解活性增強，以及提高信號檢測器的靈敏度兩個方面。

第一，基于CRISPR/Cas 產(chǎn)生的反式裂解活性增強的無擴增系統(tǒng)。Fozouni 等[46]基于CRISPR/Cas13a 開發(fā)了一種可在30 min 內(nèi)以100 拷貝/μL 的靈敏度檢出鼻拭子樣品中新型冠狀病毒的無擴增精密檢測方法。該方法將多個crRNA 連接起來以提高CRISPR 診斷的檢測靈敏度，并利用酶動力學(xué)參數(shù)來量化病毒載量。Liu 等[47]利用多個crRNA 探針進行串聯(lián)，建立了靈敏度高達30 拷貝/μL 的無擴增靶RNA 檢測方法。該方法通過靶RNA 觸發(fā)Cas13a/crRNA 的反式裂解活性，裂解ssRNA 探針，激活Csm6 蛋白的RNA 內(nèi)切酶活性來剪切熒光分子，使分子爆裂放大信號。該系統(tǒng)中將8 個crRNA 探針串聯(lián)，檢測靈敏度再次從1 000 拷貝/μL 提高到31 拷貝/μL。Tian 等[48]采用微滴法，通過減少CRISPR 反應(yīng)的體積，使其達到Cas13a 蛋白所需的最小濃度，從而提高靶核酸的濃度，在單分子水平上實現(xiàn)無擴增檢測，將濃度提高到pM 水平。

第二，通過提高信號檢測器的靈敏度構(gòu)建CRISPR/Cas 無擴增檢測系統(tǒng)。Dai 等[49]建立了以CRISPRCas12a 為基礎(chǔ)的電化學(xué)生物傳感器（E-CRISPR）系統(tǒng)，在靶核酸存在的情況下，Cas12a 的反式裂解被激活，亞甲基藍修飾的ssDNA 偶聯(lián)在金電極上被裂解，導(dǎo)致亞甲基藍的脫離和電導(dǎo)率的轉(zhuǎn)變，通過電流值的變化來監(jiān)測目標(biāo)核酸，可以達到pmol 的靈敏度。該團隊還嘗試?yán)肊-CRISPR 結(jié)合核酸適配體檢測非核酸靶標(biāo)。Xu 等[50]通過將CRISPR 裂解活性引入E-DNA 傳感器，構(gòu)建了Cas9/Cas12a 增強的E-DNA 傳感器，該檢測系統(tǒng)可以在無擴增的情況下檢測到pmol 水平的核酸。Hajian 等[51]整合CRISPR/Cas9 和基于石墨烯的場效應(yīng)晶體管技術(shù)，開發(fā)了石墨烯場效應(yīng)晶體管技術(shù)，稱為CRISPR-chip。該檢測系統(tǒng)可以在15 min 內(nèi)以高達1.7 fM 的靈敏度實現(xiàn)無擴增直接檢測目標(biāo)DNA。

3 CRISPR/Cas 檢測非核酸靶標(biāo)

多項研究正在嘗試?yán)肅RISPR/Cas 構(gòu)建非核酸靶標(biāo)如蛋白質(zhì)、小分子、細(xì)胞等的檢測系統(tǒng)。通過生物祖體（包括適體、DNAzymes 和抗原-抗體反應(yīng)）特異性識別靶物質(zhì)實現(xiàn)非核酸信號轉(zhuǎn)換為核酸信號，將實現(xiàn)基于CRISPR/Cas 的非核酸物質(zhì)檢測系統(tǒng)[18]。如核酸適體是一種短的寡核苷酸序列，能以高親和力和高特異性與相應(yīng)的配體結(jié)合，常被稱為“化學(xué)抗體”[52]。適體在溶液中主要表現(xiàn)為非結(jié)構(gòu)化。一旦適體與其配體結(jié)合，它們就折疊成分子結(jié)構(gòu)，配體就成為核酸結(jié)構(gòu)的固有部分。適配體-配體結(jié)合的特異性通常依賴于平面部分的精確堆疊、特定的氫鍵和分子形狀的互補性[53-54]。因此，結(jié)合適體已經(jīng)開發(fā)了許多基于CRISPR/Cas 的非核酸檢測系統(tǒng)，用于檢測蛋白質(zhì)、小分子、細(xì)胞等。隨著技術(shù)的進步，基于CRISPR/Cas 系統(tǒng)構(gòu)建非核酸靶標(biāo)檢測系統(tǒng)將越來越成熟，有巨大的應(yīng)用潛力。

4 討論

CRISPR/Cas 系統(tǒng)在基因編輯中的應(yīng)用且已取得極大的突破[2-3，55]，除了其強大的基因編輯能力，CRISPR/Cas 系統(tǒng)中Cas 蛋白的特性，如序列特異性識別、特異性核酸內(nèi)切酶活性以及Cas12、Cas13 和Cas14 的反式裂解活性，以及CRISPR 可編程特性等激發(fā)了人們對開發(fā)新型檢測工具的極大興趣。本文旨在介紹CRISPR/Cas 系統(tǒng)在檢驗中的檢測原理以及在核酸檢測應(yīng)用中的現(xiàn)狀，以期掌握CRISPR/Cas 系統(tǒng)的發(fā)展方向，為臨床疾病診斷帶來積極的影響。

CRISPR/Cas 系統(tǒng)對核酸的特異性識別為核酸檢測提供了獨特的優(yōu)勢，目標(biāo)中痕量原始濃度的信號轉(zhuǎn)換和放大是分析系統(tǒng)的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。解決的方案主要包括：（1）將CRISPR/Cas 系統(tǒng)與核酸擴增技術(shù)，如PCR[56]以及SDA[57-58]、RCA[59]、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增[60]等恒溫擴增技術(shù)相結(jié)合，提高核酸檢測靈敏度。（2）利用Cas12、Cas13 和Cas14 等的反式裂解活性，即特異識別激活后裂解非特異性核酸探針，使信號明顯放大[13]。該策略實現(xiàn)無靶標(biāo)預(yù)擴增的核酸檢測，便于現(xiàn)場及時檢測；實現(xiàn)原始信號的放大，避免了預(yù)擴增中引入的錯誤，大大提高特異度和靈敏度。（3）利用多種Cas 效應(yīng)蛋白作為高特異度的序列識別元件，結(jié)合電化學(xué)、比色法和熒光等多種信號輸出方法，開發(fā)了一系列無擴增系統(tǒng)，實現(xiàn)了核酸的高靈敏度和選擇性檢測[49]。

基于CRISPR/Cas 系統(tǒng)對非核酸靶標(biāo)的檢測仍處于起步探索階段[18]。CRISPR/Cas 系統(tǒng)檢測非核酸靶標(biāo)面臨的挑戰(zhàn)是如何進行將非核酸信號轉(zhuǎn)化為核酸信號。核酸適體、DNAzymes 和抗原抗體等具有特異性結(jié)合靶蛋白的能力，可以有效地完成非核酸信號的轉(zhuǎn)化和輸出。

盡管CRISPR/Cas 系統(tǒng)在生物傳感方面已經(jīng)突出了各種優(yōu)勢，但仍有一些挑戰(zhàn)需要克服。首先，由于目標(biāo)預(yù)擴增過程容易出現(xiàn)錯誤，因此開發(fā)基于CRISPR/Cas 的檢測方法，在不進行預(yù)擴增的情況下達到預(yù)期靈敏度是非常關(guān)鍵的。最近，多種crRNA 組合的策略被設(shè)計用來提高靈敏度和特異度，從而可以直接定量分析病毒載量。此外，延長crRNA 的3'或5'端可以提高Cas12a 的側(cè)支裂解活性和識別特異性。其次，Cas 蛋白存在一定的背景活性，不同批次的背景活性不同，導(dǎo)致樣品檢測結(jié)果存在差異。第三，crRNA 和ssDNA/ssRNA 信號報告序列在臨床復(fù)雜樣品中仍然存在降解的風(fēng)險。添加RNase 抑制劑和重新設(shè)計報告基因可以避免不必要的降解。

綜上所述，由于CRISPR/Cas 系統(tǒng)具有模塊化和可編程的特點，可以與擴增技術(shù)相結(jié)合，實現(xiàn)對超低濃度樣品的精確、靈敏檢測。此外，通過將CRISPR/Cas系統(tǒng)與其他設(shè)備如基于紙張的橫向流動分析、場效應(yīng)晶體管和微流體設(shè)備耦合，可以實現(xiàn)高靈敏度和特異度的即時檢測。目前，結(jié)合特異性適配體，CRISPR/Cas 系統(tǒng)已成功用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞、蛋白質(zhì)和金屬離子等非核酸檢測，同時已經(jīng)實現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)的基因編輯，也將成為細(xì)胞內(nèi)檢測的有力工具。

（本文由浙江省醫(yī)學(xué)會推薦）