吳承燕，何愛明，張焦南，胡兵，陳文韜*

（1.福建技術(shù)師范學(xué)院，福建 福清 350300；2.福建省特種水產(chǎn)配合飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福清 350300）

我國家禽養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模迅速擴(kuò)大，廢棄羽毛數(shù)量也隨之增加[1]。禽類羽毛往往由富含二硫鍵的角蛋白組成，蛋白含量高達(dá)85%～90%，但是羽毛韌性高且機(jī)械強(qiáng)度大，表面覆蓋脂質(zhì)降低了角蛋白的親水性，很難被常見的蛋白酶水解[2,3]。羽毛直接丟棄填埋也很難被土壤微生物分解，同時(shí)會(huì)對水體、空氣等環(huán)境造成污染，甚至滋生有害細(xì)菌及病毒，危及人體健康[4]。作為家禽加工的副產(chǎn)品，羽毛資源的開發(fā)利用具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，前景廣闊，可以作為新型的食品原輔料應(yīng)用到食品加工行業(yè)中，對促進(jìn)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和環(huán)境的保護(hù)都具有很大的意義。

常用的羽毛肽提取方法包括酸解法、堿解法及酶解法，一般均需先破碎形成羽毛漿，之后制備羽毛粉，步驟繁瑣[5-7]。本研究利用堿解法制備可溶性羽毛肽，先將廢棄雞羽毛蓬松打碎，增大與提取液直接接觸面積，并通過單因素及正交實(shí)驗(yàn)，探究氫氧化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、水解時(shí)間、水解溫度、料液比對提取率的影響，以期為廢棄雞羽毛的高值化應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞羽毛：市售；氫氧化鈉、茚三酮、氯化亞錫、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；濃鹽酸（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平（BS224S）：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-2）：國華電器有限公司；紫外分光光度計(jì)（UV754N）：上海佑科儀器儀表有限公司；精密pH計(jì)（PHS-3C）：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；萬能高速粉碎機(jī)（DE-400）：浙江紅景天工貿(mào)有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（GZX-GF101-3-BS-Ⅱ）：上海躍進(jìn)理療機(jī)械有限公司；電子調(diào)溫萬用電爐（DK-98-Ⅱ）：天津市泰斯特儀器有限公司；凱氏定氮儀（K8940）：濟(jì)南海能儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 羽毛肽的制備與測定

預(yù)處理：將雞羽毛洗凈，于45 ℃下烘干，放入粉碎機(jī)粉碎，收集蓬松的羽毛絨，置于干燥處備用。

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將0.2000 g賴氨酸溶于去離子水中，定容至100.00 mL。吸取10.00 mL賴氨酸溶液稀釋至100.00 mL，得200 μg/mL的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，各加入茚三酮溶液和磷酸鹽緩沖溶液1 mL，混合均勻后置于沸水浴中加熱15 min，取出后置于冷水中降至室溫，定容至25.00 mL，靜置15 min后在570 nm下測定吸光度值。以所含氨基酸質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 氨基酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

羽毛肽制備與測定：取羽毛絨置于一定量氫氧化鈉溶液中，加熱堿解，堿解液旋蒸2 h后得濃縮堿解液。取10 mL濃縮堿解液加入50 mL去離子水及5 g活性炭脫色，加熱至沸并保持30 s。過濾后濾液用水定容至100.00 mL。加入茚三酮溶液和磷酸鹽緩沖溶液各1 mL，混合均勻后置于沸水浴中加熱15 min，冷至室溫，定容至25.00 mL，靜置15 min后在570 nm下測定吸光度值。利用茚三酮測量氨基酸法雞羽毛水解液中的氨基酸含量, 計(jì)算公式如式⑴所示。

式⑴中，c為氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線上查的的氨基酸含量，μg/mL；K為樣品稀釋倍數(shù)；V為測定時(shí)取樣體積，mL。

1.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

分別選取氫氧化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)（2%、4%、6%、8%、10%）、料液比（1∶3、1∶6、1∶9、1∶12、1∶14）、水解時(shí)間（2、4、6、8、10 h）、水解溫度（50、60、70、80、90 ℃）進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。水解后將pH值調(diào)至6.8～7.2，考查各因素對羽毛肽制備的影響。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。

1.3.3 正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)置水解溫度(A)、水解時(shí)間(B)、氫氧化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)(C)和料液比(D)為主要影響因子，每個(gè)影響因素各取3個(gè)水平進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平如表1所示。

表1 水解因素水平表

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin和SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 氫氧化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對羽毛水解的影響

氫氧化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對羽毛水解的影響如圖2所示。由圖2可知，羽毛水解后的氨基酸含量隨氫氧化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，這是因?yàn)闅溲趸c溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí)水解不完全，過高時(shí)則會(huì)破壞氨基酸結(jié)構(gòu)，為4%時(shí)氨基酸含量最高，表明此時(shí)水解程度最大，因此水解羽毛的較佳氫氧化鈉溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%。

圖2 氫氧化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對羽毛水解的影響

2.1.2 料液比對羽毛水解的影響

料液比對羽毛水解的影響如圖3所示。由圖3可知，隨著料液比的降低，水解羽毛所得的氨基酸含量呈快速上升趨勢，在料液比為1∶12時(shí)達(dá)到最大值。這是因?yàn)殡S著液體體積的增加，羽毛與氫氧化鈉接觸碰撞的機(jī)會(huì)降低，從而減慢反應(yīng)速率，且體積的增大增加了處理成本。綜合考慮水解羽毛的較佳料液比為1∶12。

圖3 料液比對羽毛水解的影響

2.1.3 時(shí)間對羽毛水解的影響

時(shí)間對羽毛水解的影響如圖4所示。由圖4可知，前8 h羽毛水解出的氨基酸含量不斷升高，且反應(yīng)速率較快，但8 h后水解速率增加放緩，可能是因?yàn)? h時(shí)羽毛與氫氧化鈉添加量之間達(dá)到平衡。因此水解羽毛的較佳時(shí)間為8 h。

圖4 時(shí)間對羽毛水解的影響

2.1.4 溫度對羽毛水解的影響

溫度對羽毛水解的影響如圖5所示。由圖5可知，隨著溫度的升高，羽毛水解出的氨基酸含量也隨之增多。在低于70 ℃時(shí)，水解速率較快，這是因?yàn)樯郎乜商嵘鹈c氫氧化鈉之間的碰撞頻率，在溫度高于70 ℃后，水解速率增加明顯放緩，因此水解羽毛的較佳溫度為70 ℃。

圖5 溫度對羽毛水解的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。由表2可知，以氨基酸含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，最佳水解工藝為A3B3C3D2，即氫氧化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、料液比1∶12、水解時(shí)間9 h、水解溫度75 ℃。由表2數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示，A、B、C、D均有顯著意義。按優(yōu)選出的條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，平行3組，測得氨基酸含量分別為949.91、948.98及952.22 μg/g，平均含量為950.37 μg/g，RSD為0.18%，驗(yàn)證中氨基酸含量均高于正交最高，具有較好重現(xiàn)性，表明此水解工藝條件穩(wěn)定可行。

表2 羽毛水解工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果

表3 多因素方差分析表

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以羽毛為原料，通過酶解法制備羽毛肽，通過單因素實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn)對氫氧化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比、水解時(shí)間和水解溫度這4個(gè)因子進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝條件：氫氧化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、料液比1∶12、水解時(shí)間9 h、水解溫度75 ℃。按最佳水解工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，穩(wěn)定性好，證明了該水解工藝的可行性，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。