李赟 張如峰 吳文英

(西寧市第一人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫血液科,青海 西寧 810000)

痛風(fēng)疼痛是最嚴(yán)重的疼痛癥狀之一,會嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。因此,開發(fā)減輕痛風(fēng)疼痛的有效止痛方法具有重要的臨床意義。當(dāng)前減輕痛風(fēng)疼痛的治療方法仍限于秋水仙堿、非甾體抗炎藥和皮質(zhì)類固醇。然而,使用這些藥物常常會導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng),例如胃腸道不良反應(yīng)、慢性腎功能不全、煩躁不安和免疫抑制[2-3]。電針(Electroacupuncture,EA)是一種將傳統(tǒng)針灸和現(xiàn)代電療相結(jié)合的技術(shù),它可以在許多急性和慢性疼痛條件下產(chǎn)生令人滿意的鎮(zhèn)痛作用,并且?guī)缀鯖]有副作用[4]。動物研究表明,EA在多種炎癥性疼痛模型中均能抑制疼痛反應(yīng),包括完全弗氏佐劑引起的炎癥性疼痛,膠原蛋白引起的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疼痛,皮膚切開后疼痛和纖維肌痛[5-6]。在臨床上,據(jù)報道EA可以改善急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者的視覺模擬量表評分[7]。然而,直到現(xiàn)在,尚不清楚EA在減輕急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動物模型中疼痛反應(yīng)的潛在機制。香草酸(TRPV)是瞬時受體電位(TRP)家族的六個跨膜結(jié)構(gòu)域之一,其中香草酸亞型1(TRPV1)是周圍感覺神經(jīng)元的傷害感受器,可以識別來自周圍神經(jīng)末梢的感覺輸入,并在尿酸單鈉鹽誘導(dǎo)的傷害感受和炎癥中起相關(guān)作用,表明它是治療急性痛風(fēng)發(fā)作的潛在靶點[8]。因此,本研究通過將尿酸鈉注射至踝關(guān)節(jié)建立急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型,觀察EA治療是否有助于降低該模型的疼痛反應(yīng)以及對外周背根神經(jīng)節(jié)與中樞脊髓背角中TRPV1及其相關(guān)下游分子表達情況的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 使用SPF級雄性SD大鼠60只,購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司(合格證編號:SCXK 2016-0005),體重180～240 g。在可控溫度和光/暗周期為12 h的環(huán)境下,每只籠子飼養(yǎng)6只大鼠。自由攝取食物和水。本研究涉及的動物實驗方案經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)同意(倫理號:2019025)。

1.2 材料與儀器 尿酸鈉購自美國Sigma-alorich公司;蛋白酶抑制劑混合物的裂解緩沖液購自美國Amresco公司;抗TRPV1購自以色列Alomone公司;S100B、GFAP、RAGE購自美國Millipore公司;辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗購自美國Santa Cruz Biotechnology公司;ECL Western印跡檢測試劑購自美國Thermo Fisher Scientific公司。LH-202H韓氏穴位神經(jīng)刺激儀購自河北潤連機械設(shè)備有限公司;von Frey細(xì)絲購自意大利UGO Basile公司;37450動態(tài)足底觸覺儀購自意大利Ugo Basile公司;Quantity One軟件購自美國Bio-Rad實驗室。

1.3 方法

1.3.1 急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型建立 60只大鼠分為4組,即對照組、模型組(尿酸鈉誘導(dǎo)的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型)、假EA治療組(Sham EA,尿酸鈉誘導(dǎo)的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型+假性EA治療)和EA治療組(尿酸鈉誘導(dǎo)的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型+EA治療),每組15只。將尿酸鈉懸浮在無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。在手術(shù)前,先用70%的酒精對腳踝區(qū)域進行消毒。對照組接受50 μL PBS注射。進行小切口后,通過一根21號針頭將1.25 mg尿酸鈉(50 μL)注射到大鼠踝關(guān)節(jié)中,該針頭恰好位于脛骨前肌腱的內(nèi)側(cè),其尖端傾斜成45°。注射后4～6 h,觀察到明顯的踝關(guān)節(jié)腫脹和機械痛覺過敏視為痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型成功建立。模型組、假EA治療組和EA治療組所有大鼠均成功建立急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型。

1.3.2 EA治療 EA治療組分別在模型建立后第8、24和48 h進行EA治療。具體操作為:將大鼠松散固定,將四根直徑0.25 mm的不銹鋼灸針以5 mm的深度插入雙側(cè)足三里(ST36,脛骨前小結(jié)外側(cè)5 mm)和昆侖(BL60,在踝關(guān)節(jié)水平、外踝尖和跟骨之間)穴位。針頭與LH-202H韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(河北潤連機械設(shè)備有限公司)連接。輸出2/100Hz疏密波(2Hz刺激的脈沖寬度:0.6 ms,100Hz刺激的脈沖寬度:0.2 ms,每種頻率持續(xù)3 s)和強度范圍為1～2 mA(開始時為1 mA持續(xù)15 min,然后切換為2 mA持續(xù)15 min),每次治療30 min。對于假EA治療組,將針頭皮下插入ST36和BL60,但沒有放電。

1.3.3 踝關(guān)節(jié)水腫的測定 水腫是通過數(shù)字卡尺測量的踝關(guān)節(jié)直徑增加而觀察到的,其計算公式為基礎(chǔ)值與測試值之間的差異(在關(guān)節(jié)內(nèi)注射尿酸鈉或PBS后的不同時間點觀察結(jié)果)。

1.3.4 持續(xù)疼痛評分評估 將大鼠分別置于透明的有機玻璃室中并適應(yīng)30 min,然后每只大鼠觀察5 min。在玻璃室中,以45°角放置一面鏡子,觀察大鼠的腳。根據(jù)以下等級評估并分類大鼠愿意放在注射肢體后爪上的重量(爪壓):0=正常爪壓,兩個后爪相等的重量;1=爪子壓力輕微降低(腳掌完全在地板上,但腳趾沒有散開);2=足爪壓力適度降低(腳卷曲,僅腳的某些部分輕輕接觸地面);3=爪子壓力嚴(yán)重降低(腳完全抬起)。

1.3.5 機械性疼痛測定 將大鼠分別置于高架網(wǎng)地板上的透明有機玻璃室內(nèi),并在測試前使其適應(yīng)30 min。機械性痛覺超敏癥是通過一系列經(jīng)校準(zhǔn)的von Frey細(xì)絲(意大利UGO Basile公司)垂直于后爪的足底中部表面施加足夠的力,使細(xì)絲輕微彎曲3～5 s來確定。爪子突然縮回、舔以及對刺激的強烈震動被認(rèn)為是疼痛樣反應(yīng)。通過非參數(shù)Dixon測試計算出50%的爪退縮閾(PWT)。在正式測試之前,連續(xù)3 d每天進行PWT的基線測試,以使大鼠適應(yīng)環(huán)境并確保各組之間沒有差異。

1.3.6 熱痛覺過敏的測定 使用37450動態(tài)足底觸覺儀(意大利Ugo Basile公司)評估對熱刺激(熱痛覺過敏)的超敏反應(yīng)。在測試前使大鼠適應(yīng)30 min。將燈泡產(chǎn)生的輻射光束導(dǎo)入右后爪,以確定爪縮回潛伏期(從刺激中移出爪所需的時間)。設(shè)置20 s的截止閾值,以避免過熱導(dǎo)致傷害。爪縮回潛伏期的明顯減少認(rèn)為熱痛覺過敏。

1.3.7 踝關(guān)節(jié)的組織病理學(xué)評價 在注射尿酸鈉后8 h處死大鼠,解剖踝關(guān)節(jié),去除關(guān)節(jié)周圍組織。將踝關(guān)節(jié)固定在10%福爾馬林中,并使用10% EDTA脫鈣。然后通過在不同等級的乙醇/氯仿混合物中進行處理將其脫水,并包埋在石蠟中。將切片切成6 μm的厚度,并用蘇木精和曙紅染色以在光學(xué)顯微鏡下進行病理檢查。

1.3.8 免疫印跡(Western blot)測定 在完成動物行為測試后,立即切除大鼠外周背根神經(jīng)節(jié)與中樞脊髓背角以提取蛋白質(zhì)。通過在含有50 mM Tris-HCl pH 7.4、250 mM NaCl,1%NP-40、5 mM EDTA,50 mM NaF,1 mM Na3VO4、0.02%NaN3和1x蛋白酶抑制劑混合物的裂解緩沖液(美國Amresco公司)中勻漿組織來制備總蛋白。將提取的蛋白質(zhì)通過8%SDS-Tris甘氨酸凝膠電泳,然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶在TBS-T緩沖液(10 mM Tris pH 7.5,100 mM NaCl,0.1%Tween 20)中封閉膜,并與抗TRPV1(～95 kDa,1∶1 000,以色列Alomone公司),S100B(～51 kDa,1∶1 000,美國Millipore公司),GFAP(～125 kDa,1:1 000,美國Millipore公司),RAGE(～80-82 kDa,1∶1 000,美國Millipore公司)在室溫下孵育過夜。在室溫下用適當(dāng)?shù)睦备^氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1∶5 000;美國Santa Cruz Biotechnology公司)覆蓋2 h。用ECL Western印跡檢測試劑(美國Thermo Fisher Scientific公司)對蛋白條帶進行可視化。使用Quantity One軟件(美國Bio-Rad實驗室)對條帶密度進行定量。

2 結(jié)果

2.1 尿酸鈉誘導(dǎo)大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型的建立及鎮(zhèn)痛性能的評價 與對照組相比,模型組大鼠的踝關(guān)節(jié)在尿酸鈉注射后2 h時表現(xiàn)出廣泛的腫脹,并在8 h時達到峰值,持續(xù)到注射后48 h,在注射后72 h,踝關(guān)節(jié)腫脹完全消失(圖1A)。在注射尿酸鈉后8 h,顯微鏡觀察踝關(guān)節(jié)滑膜組織學(xué)切片顯示,模型組大鼠炎癥細(xì)胞廣泛浸潤,并伴有局灶性滑膜增生(圖1B)。模型組大鼠表現(xiàn)出明顯的持續(xù)性疼痛行為,這些行為持續(xù)到尿酸鈉注射后48 h(圖1C)。模型組大鼠表現(xiàn)出明顯而持久的機械性超敏反應(yīng),在尿酸鈉注射后2 h達到峰值,并持續(xù)到48 h(圖1D)。此外,模型組大鼠表現(xiàn)出輕度的熱超敏反應(yīng),該反應(yīng)在尿酸鈉注射后4 h出現(xiàn)并持續(xù)到24 h(圖1E)。上述數(shù)據(jù)表明,該大鼠痛風(fēng)模型概括了人類急性痛風(fēng)發(fā)作的疼痛反應(yīng)。因此,以下實驗利用該模型并在尿酸鈉注射后0～48 h之間進行,以研究EA是否以及如何減輕急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的疼痛反應(yīng)。

圖1 大鼠急性痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎模型的建立以及疼痛的表征

2.2 EA對尿酸鈉所致痛風(fēng)大鼠疼痛反應(yīng)的影響 與之前一樣,將尿酸鈉注射到大鼠腳踝導(dǎo)致持續(xù)疼痛評分明顯升高,以及50% PWT和爪退縮潛伏期明顯減少。與假EA組相比,在8、24和48 h時間點,EA治療顯著降低了痛風(fēng)大鼠的持續(xù)疼痛評分(P<0.05),同時顯著增加了50% PWT和爪退縮潛伏期(P<0.05)。以上結(jié)果表明,EA治療有效緩解了尿酸鈉誘發(fā)的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的持續(xù)疼痛,并產(chǎn)生穩(wěn)定而持久的抗痛覺過敏和抗熱痛覺過敏。見圖2。

圖2 EA對尿酸鈉所致痛風(fēng)大鼠疼痛反應(yīng)的影響

2.3 EA對TRPV1和相關(guān)下游分子的蛋白水平表達影響 使用Western blot分析來確定EA治療是否可以改變痛風(fēng)大鼠疼痛反應(yīng)相關(guān)的TRPV1及其下游分子的蛋白表達水平。結(jié)果表明,無論在背根神經(jīng)節(jié)與中樞脊髓背角,與對照組相比,模型組TRPV1和相關(guān)的下游蛋白激酶(S100B、GFAP和RAGE)水平表達均顯著提高(P<0.05)。EA治療顯著降低了TRPV1和相關(guān)的下游蛋白激酶(S100B、GFAP和RAGE)的過表達(P<0.05),而假EA治療并沒有改變這一觀察結(jié)果。見圖3。

圖3 EA對TRPV1和相關(guān)下游分子的蛋白水平表達影響

3 討論

尿酸鈉在關(guān)節(jié)內(nèi)和關(guān)節(jié)周圍沉積會引起白細(xì)胞浸潤,從而吞噬尿酸鈉。該過程將產(chǎn)生炎性和傷害感受介質(zhì)[9-12]。這些介體(例如IL-1β和過氧化氫)可致敏或直接激活周圍感覺神經(jīng)系統(tǒng)中的傷害感受器,并引起劇烈疼痛[13]。本研究通過將尿酸鈉注射到大鼠的踝關(guān)節(jié)中,建立了急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型。該模型是用于研究痛風(fēng)的疼痛反應(yīng)和炎癥機制的常用動物模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在尿酸鈉注射后2～4 h,大鼠出現(xiàn)了強烈的踝關(guān)節(jié)腫脹和疼痛反應(yīng)。在注射后8 h時,腫脹和疼痛反應(yīng)達到高峰。踝關(guān)節(jié)滑膜組織顯示炎癥細(xì)胞廣泛浸潤和增生。這些跡象均與使用相同模型的其他研究一致,表明成功建立痛風(fēng)模型[14]。但是與其他研究不同,本研究進一步延長了觀察時間,發(fā)現(xiàn)踝關(guān)節(jié)在尿酸鈉注射后48 h仍然表現(xiàn)出明顯的疼痛跡象,此后逐漸消退[15]。因此,本研究選擇在8～48 h的時間窗內(nèi)檢查了EA的鎮(zhèn)痛作用。

先前研究比較了低頻(2 Hz)、高頻(100 Hz)和混合頻率(2/100 Hz)EA對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的鎮(zhèn)痛作用,發(fā)現(xiàn)低頻(2 Hz)EA無效,高頻(100 Hz)與混合頻率(2/100 Hz)EA的鎮(zhèn)痛效果相似,但高頻(100 Hz)EA治療與混合頻率(2/100 Hz)EA治療相比,前者未能產(chǎn)生穩(wěn)定而持久的抗痛覺過敏,表明通過重復(fù)使用100 Hz EA可能產(chǎn)生鎮(zhèn)痛耐受性[16]。還有研究報道了在弗氏完全佐劑誘發(fā)的炎癥性疼痛大鼠模型中,2/100 Hz或100 Hz EA會持續(xù)產(chǎn)生抗傷害感受,而10 Hz EA則完全無效[17]?；谏鲜鰯?shù)據(jù),本研究認(rèn)為2/100 Hz是減輕尿酸鈉誘發(fā)的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎疼痛反應(yīng)的最佳EA頻率。因此,本研究在實驗中采用了2/100 Hz頻率進行EA治療,結(jié)果發(fā)現(xiàn)EA對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的機械性痛覺過敏產(chǎn)生了良好的鎮(zhèn)痛效果,同時還可以顯著減輕模型大鼠的持續(xù)疼痛評分、熱痛覺過敏和踝關(guān)節(jié)腫脹。

已有研究顯示TRPV1參與多種疼痛性炎癥,包括急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[18-20]。在急性痛風(fēng)發(fā)作中,通常伴隨著難以忍受的灼痛。TRPV1在有害熱的檢測中似乎很重要,因為TRPV1激動劑會誘發(fā)(而TRPV1拮抗劑會逆轉(zhuǎn))人類的灼痛。TRPV1的激活可以進一步啟動Ca2+內(nèi)流,使神經(jīng)元去極化[20]。TRPV1功能的下調(diào)導(dǎo)致對高溫刺激,輻射熱和熱板測試不敏感[21]。炎性介質(zhì)可誘導(dǎo)痛覺過敏激活TRPV1,提示其在炎性疼痛中的重要作用[14]。在炎性疼痛模型中,注射TRPV1拮抗劑卡西平可減輕熱痛覺過敏[22]。本研究發(fā)現(xiàn),注射尿酸鈉后模型組大鼠在背根神經(jīng)節(jié)與中樞脊髓背角中TRPV1的表達和相關(guān)的信號通路增加;EA處理可進一步降低TRPV1過表達,表明EA對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎疼痛有抵抗力。Wu等[23]研究表明ST36的解剖層,尤其是肌肉層中有大量的TRPV1。免疫熒光數(shù)據(jù)還顯示,TRPV1在ST36穴位神經(jīng)和非神經(jīng)細(xì)胞中表達。向ST36穴位注射辣椒素(TRPV1激動劑)可以像手動針灸治療一樣有效地緩解炎性疼痛,復(fù)制針灸的鎮(zhèn)痛作用。Zhang等[24]指出,在ST36穴位的EA可以通過減輕荷瘤大鼠背根神經(jīng)節(jié)中TRPV1的mRNA和蛋白水平的表達來減輕癌癥引起的疼痛。Chen等[25]報道,在雙側(cè)ST36、BL60穴位處的EA可以減少因向踝關(guān)節(jié)內(nèi)注射尿酸鈉引起的機械和熱痛覺過敏;TRPV1在炎癥性疼痛中增加,并且可以通過在周圍背根神經(jīng)節(jié)處的EA刺激進一步減弱。這些結(jié)果不僅表明EA可以緩解疼痛,還表明EA可以減少小到大直徑神經(jīng)元中TRPV1的過表達。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)TRPV1的激活會增加S100B、GFAP和RAGE的表達,而EA治療可以減少GFAP、S100B和RAGE的過表達,從而減輕疼痛。

4 結(jié)論

EA在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型中可有效緩解疼痛反應(yīng),其主要通過TRPV1及其下游蛋白激酶S100B、GFAP和RAGE受體介導(dǎo)鎮(zhèn)痛作用,為實踐EA治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎疼痛的臨床應(yīng)用提供了重要證據(jù)。