陳芯媛,林小惠,陳吶敏,陳家鑫,游翠芳

在我國,卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,其病死率位于女性生殖道惡性腫瘤之首,是嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤[1]。由于卵巢癌早期發(fā)現(xiàn)困難,癥狀隱匿,多數(shù)患者確診時已屬中晚期[2]。目前一線化療包括術后輔助化療和新輔助化療,而鉑類藥物是一線化療方案的主要藥物。然而,隨著化療周期的增加,患者易發(fā)生鉑類藥物的耐受,癌細胞會在短期內(nèi)復發(fā)、遷移,普遍預后極差[3]。針對卵巢癌鉑類耐藥,目前采取的非鉑類化療藥物、靶向藥物治療、內(nèi)分泌治療、免疫治療等手段在臨床應用中仍存在治療效果不理想、藥物毒性反應大等問題,且耐藥機制尚未明確[4]。因此,卵巢癌對鉑類藥物的耐藥性是目前臨床治療面臨的重要挑戰(zhàn)。對卵巢癌鉑類耐藥機制的研究以及新的治療方案的開發(fā)也成為了當前卵巢癌治療的熱門研究領域。

在疾病治療領域,傳統(tǒng)中醫(yī)藥的治療效果得到了充分證實。隨著中醫(yī)中藥在癌癥治療中的廣泛應用,尋找具有高效、低毒、可增強或逆轉(zhuǎn)卵巢癌鉑耐藥性的天然化合物,對于卵巢癌鉑耐藥患者的治療具有極其重要的價值。同時,也有助于推動中藥的現(xiàn)代化發(fā)展以及二次開發(fā)利用。網(wǎng)絡藥理學融合系統(tǒng)生物學、生物信息學、網(wǎng)絡科學等學科,從系統(tǒng)層次和生物網(wǎng)絡的整體角度出發(fā),解析藥物與治療對象之間的分子關聯(lián)[5]。在中藥藥理機制研究、新藥發(fā)現(xiàn)、藥物重新定位、老藥新用以及不良反應、毒副作用研究等方面取得了良好成效。本研究旨在運用網(wǎng)絡藥理學方法,對逆轉(zhuǎn)卵巢癌鉑耐藥的核心靶點、化合物和中藥進行篩選和探究,借助分子對接驗證并分析中藥的作用機制,為卵巢癌鉑耐藥的逆轉(zhuǎn)治療提供新的思路和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 卵巢癌鉑耐藥相關靶點的獲取 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫分別以“ovarian cancer”“cisplatin resistance”“platinum resistance”為檢索詞進行檢索,物種設置為“Homo sapiens”獲取的數(shù)據(jù),借助Hiplot繪制韋恩圖,其交集靶點定義為卵巢癌鉑耐藥的潛在靶點。通過Uniport蛋白質(zhì)生物信息學數(shù)據(jù)庫統(tǒng)一靶點基因/蛋白信息,R軟件對靶點進行基因本體(GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。

1.2 候選化合物及中藥的篩選 以卵巢癌鉑耐藥的潛在靶點為關鍵詞,通過中藥數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)獲取可干預靶點的活性化合物,定義為潛在治療卵巢癌鉑耐藥的候選化合物。根據(jù)TCMSP平臺建議的藥物篩選標準進行篩選：口服生物利用度(OB)≥30%、藥物相似性(DL)≥0.18、半衰期(HL)>4、分子量(MW)≤500Da、可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)(RBN)≤10、拓撲極性表面積(TPSA)≤600?2。

1.3 中藥挖掘及網(wǎng)絡關系構(gòu)建 通過TCMSP平臺構(gòu)建的“藥物靶點—活性化合物—中藥”網(wǎng)絡關系,映射出含有候選化合物的中藥,參考標準為《中華人民共和國藥典》(2020年版一部)規(guī)范統(tǒng)一中藥名稱,挖掘出可治療潛在靶點的中藥。應用Cytoscape 3.6.0軟件進行網(wǎng)絡可視化及拓撲分析,構(gòu)建“潛在靶點—候選化合物—中藥”網(wǎng)絡關系。對具有潛在治療作用的中藥進行性味歸經(jīng)的分析,統(tǒng)計各個中藥在四氣五味、歸經(jīng)的頻次,并按頻次進行排序。

1.4 分子對接 為驗證“潛在靶點—候選化合物—中藥”網(wǎng)絡中候選化合物與潛在靶點相互作用,選擇度值>4的候選化合物作為配體,度值排名前5位的核心靶點作為受體進行分子對接驗證,PubChem數(shù)據(jù)庫下載受體結(jié)構(gòu)、ChemOffice結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換及幾何優(yōu)化,收集候選化合物的三維結(jié)構(gòu);通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB),收集合適的靶點蛋白三維結(jié)構(gòu);應用AutoDock Vina軟件進行分子對接及結(jié)果評估?；诮Y(jié)合構(gòu)象和結(jié)合親和力選擇最優(yōu)配體—受體結(jié)合構(gòu)型,采用PILP工具分析分子間作用力,PyMol軟件對分子對接驗證結(jié)果進行可視化。

2 結(jié) 果

2.1 潛在靶點獲取 GeneCards數(shù)據(jù)庫以“ovarian cancer”為檢索詞,獲得卵巢癌疾病靶點8 929個,取TOP 500個靶點。GeneCards數(shù)據(jù)庫以“cisplatin resistance”及“platinum resistance”為檢索詞,分別獲得4 082個和1 862個靶點,以score>10為篩選標準,獲得202個與鉑耐藥相關的靶點。通過卵巢癌靶點與鉑耐藥靶點取交集,共獲得卵巢癌鉑耐藥的潛在靶點111個,定義為干預卵巢癌鉑耐藥的潛在靶點,見圖1。

圖1 卵巢癌鉑耐藥靶點的Venn圖

2.2 候選化合物獲取及構(gòu)建潛在靶點—候選化合物—中藥網(wǎng)絡 將潛在靶點在TCMSP數(shù)據(jù)庫中查找可匹配的候選化合物及中藥,其中可結(jié)合的靶點23個,候選化合物235個,中藥406種。利用Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建潛在靶點—候選化合物—中藥網(wǎng)絡圖,見圖2。紅色箭頭節(jié)點為潛在靶點,藍色菱形節(jié)點為候選化合物,黃色三角形節(jié)點為中藥,節(jié)點越大,度值越高,關聯(lián)性越高。根據(jù)拓撲分析結(jié)果,度值排名前5的核心靶點分別為PGR、AR、MAPK14、TNF、CASP3;度值>4的核心化合物分別為皂素(diosgenin)、玫瑰樹堿(ellipticine)、丹參酮ⅡA(tanshinone iia)、隱丹參酮(cryptotanshinone)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、苦參堿(matrine),詳見表1。以上化合物與卵巢癌鉑耐藥靶點具有較強相關性,可進一步研究。

表1 干預卵巢癌鉑耐藥的潛在核心化合物(度值>4)

圖2 潛在靶點—候選化合物—中藥網(wǎng)絡圖

2.3 潛在靶點GO功能和KEGG通路富集分析 通過R包clusterProfiler進行GO功能和KEGG通路富集分析(P<0.05),見圖3。GO功能列出富集結(jié)果前10的條目,生物過程(BP)主要涉及上皮細胞增殖、細胞對氧化應激反應、凋亡信號通路調(diào)節(jié)等;細胞組分(CC)主要在膜筏、膜系統(tǒng)微域、轉(zhuǎn)錄復制復合體等表達;分子功能(MF)主要集中在細胞因子受體結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。KEGG通路列出富集結(jié)果前30的條目,潛在靶點可能參與調(diào)控PI3K-Akt路、MAPK通路、FoxO通路、HIF-1通路、p-53通路及癌癥、腫瘤及耐藥性疾病相關的通路。

圖3 潛在靶點GO和KEGG富集分析

2.4 與靶蛋白的分子對接 通過分子對接研究核心化合物與主要靶點之間的相互作用,結(jié)合親和力<-5.0 kcal/mol,表明具有良好的相互作用。分子對接自由能熱圖(圖4)結(jié)果表明核心化合物皂素、玫瑰樹堿、丹參酮ⅡA、隱丹參酮、β-谷甾醇、苦參堿與主要靶標蛋白AR(PDBID：1z95)、CASP3(PDBID：3kjf)、MAPK14(PDBID：1wbo)、PGR(PDBID：3g8o)、TNF(PDBID：2az5)對接結(jié)果,對接得分最高-6.2 kcal/mol,最低為-10.4 kcal/mol,具有良好的結(jié)合效應和可靠的相互作用,卵巢癌鉑耐藥潛在靶點與化合物分子對接示意圖見圖5,分子間作用力包括氫鍵、鹽橋。

圖4 卵巢癌鉑耐藥潛在靶點與化合物分子對接自由能熱圖

注：A：AR-玫瑰樹堿;B：CAPS3-丹參酮ⅡA;C：MAPK14-皂素;D：PGR-苦參堿;E：TNF-隱丹參酮;F：PGR-β-谷甾醇

2.5 中藥性味歸經(jīng)功效分析 根據(jù)《中華人民共和國藥典》(2020年版一部)所收錄品種,保留度值>4,共收集到75種中草藥,部分中藥見圖6。統(tǒng)計中藥基本信息(圖7),分析中藥的性味歸經(jīng),其中藥性以寒性(34.67%)出現(xiàn)頻次最高,如半枝蓮、關黃柏。藥味以苦味(37.39%)藥物居多,如吳茱萸、丹參。歸經(jīng)入肝經(jīng)(20.44%)、肺經(jīng)(17.68%)藥物居多,如三棱、苦參。

圖6 潛在靶點—候選化合物—中藥網(wǎng)絡度值前20位的中藥

圖7 逆轉(zhuǎn)卵巢癌鉑耐藥候選中藥的性味分布及歸經(jīng)分析

3 討 論

本研究利用網(wǎng)絡藥理學和數(shù)據(jù)挖掘技術,探討中藥在增敏卵巢癌化療藥物相關耐藥中的作用,利用相關拓撲分析參數(shù)篩選核心靶點、化合物和中藥,并通過分子對接技術進一步評價所納入靶點和化合物的藥理活性。

經(jīng)過分析,我們發(fā)現(xiàn)度值上排名較為靠前的核心靶點包括PGR、AR、MAPK14、TNF、CASP3等。這些靶點可能通過某種作用機制,對化療藥物產(chǎn)生增敏效果。TNF是一種具有抗腫瘤和促炎活性的細胞因子,通過與其受體TNFR1和TNFR2結(jié)合,降低某些化療藥物的敏感性,誘導腫瘤細胞耐藥、促進腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移、激活保護性信號通路和誘導免疫耐受[6]。TNF能誘導NF-kB信號通路對卵巢癌的多種細胞過程產(chǎn)生影響,調(diào)節(jié)增殖、侵襲、黏附和血管生成有關的下游基因轉(zhuǎn)錄過程[7]。值得注意的是,TNF具有雙重作用,在腫瘤化療中的應用需要考慮其劑量、途徑、時間和靶向等因素,以及不同類型和階段的腫瘤,通過干預TNF來克服化學耐藥性并增加治療反應仍需深入研究。MAPK14是p38 MAPK在人體中常見亞型之一,激活p38 MAPK途徑并誘導血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA),前列腺素—內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2),早期生長反應1(EGR1)和缺氧誘導因子1-α(HIFI1A)發(fā)揮作用,從而促進卵巢癌的惡性生物學行為和抵抗力[8]。miR-433的過表達能通過誘導細胞衰老來促進卵巢癌細胞對化療的耐受性[9],且通過生物信息學分析篩選出了與細胞衰老相關的miR-433靶基因包括CDK6,MAPK14,E2F3和CDKN2A。因此,通過網(wǎng)絡藥理學篩選出的潛在靶點參與鉑類藥物耐藥的調(diào)控,可為后續(xù)研究提供參考。

本研究發(fā)現(xiàn),潛在靶點—候選化合物中隱丹參酮(CPT)是一種從中藥丹參中分離的脂溶性二萜醌類化合物。CPT已被證實具有良好的抗腫瘤作用,在消化系統(tǒng)腫瘤如胃癌、肝癌、腸癌,在生殖系統(tǒng)腫瘤如卵巢癌、乳腺癌、宮頸癌和前列腺癌,在造血系統(tǒng)腫瘤白血病等腫瘤細胞都具有抑制增殖與誘導凋亡的作用[10]。同時,CPT還具有增敏化療療效或逆轉(zhuǎn)化療耐藥的作用。CPT通過下調(diào)P-gp表達增加抗癌藥物在細胞內(nèi)的積累從而逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌多藥耐藥[11];產(chǎn)生的活性氧在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的細胞凋亡中起重要作用,還通過誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)絡應激,對順鉑、依托泊苷和氟尿嘧啶等多種抗腫瘤藥物具有增敏作用;通過減弱腫瘤相關成纖維細胞(CAFs)介導的卵巢癌細胞對順帕的耐藥性[12];通過下調(diào)Nrf2途徑逆轉(zhuǎn)人肺癌A549細胞的順鉑耐藥性[13]。這些研究結(jié)果表明,CPT不僅具有廣泛的抗腫瘤作用,在協(xié)同化療藥物抗腫瘤耐藥方面亦可能存在巨大潛力。β-谷甾醇是一種植物甾醇,具有抗炎、抗菌、抗真菌和降低膽固醇等多種生理活性,已被報道對纖維肉瘤和結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌和前列腺癌具有抗癌作用。Bae等[14]在卵巢癌細胞研究中,β-谷甾醇主要對線粒體產(chǎn)生不利影響,通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)—線粒體軸來增強ROS的產(chǎn)生和鈣的內(nèi)流,導致線粒體膜電位減少和線粒體功能障礙從而抑制腫瘤的發(fā)展。EMT與腫瘤發(fā)生、侵襲性、轉(zhuǎn)移和治療耐藥性有關,β-谷甾醇可通過下調(diào)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的標志物Snail和vimentin的表達,增加E-cadherin的表達,從而減少胰腺癌細胞的遷移和侵襲能力[15]。此外,分子對接結(jié)果顯示多個化合物與潛在靶點顯示出良好的結(jié)合能力,進一步驗證了靶點與化合物相互作用研究的可靠性,這也為針對卵巢癌鉑耐藥的新藥研發(fā)提供了新的思路和研究方向。

本研究中,旨在挖掘出與逆轉(zhuǎn)卵巢癌鉑耐藥的中藥。如半枝蓮是傳統(tǒng)醫(yī)學中廣泛使用的抗腫瘤中藥,對肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞均表現(xiàn)出明顯的拮抗作用[16]。Xue等[17]評估了半枝蓮植物中分離得到27個新克羅烷型二萜類化合物對人乳腺癌多藥耐藥細胞的逆轉(zhuǎn)作用,發(fā)現(xiàn)其中四個化合物(11、14、16和18)比經(jīng)典的P-gp抑制劑維拉帕米具有更好的逆轉(zhuǎn)能力,可能是通過抑制P-糖蛋白表達克服腫瘤細胞的耐藥性,這也是逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥的重要策略。ABC轉(zhuǎn)運蛋白介導的藥物流出也是腫瘤細胞中常見的耐藥機制之一。吳茱萸中提取的生物堿吳茱萸次堿能下調(diào)ABCB1的蛋白表達水平,增強ABCB1過表達細胞株MCF-7/ADR及A549/Taxol對抗腫瘤藥物的敏感性。進一步的機制研究表明,吳茱萸次堿是通過上調(diào)E3泛素連接酶MARCH8來實現(xiàn)對MDR的逆轉(zhuǎn)[18]。另一成分吳茱萸堿可能通過誘導細胞衰老來改善卵巢癌細胞的化療耐受性,降低A2780/PTXR細胞中多藥耐藥蛋白(MDR-1)的表達和功能,目前已證實可增強卵巢癌細胞對紫杉醇治療的敏感性,且不引起細胞毒性,但在鉑類藥物中的增敏作用還需深入研究[19]。以上可推測本次研究可挖掘出可能逆轉(zhuǎn)或增敏鉑類藥物的中藥,可設計實驗進行驗證并進一步開發(fā)利用。

綜上所述,我國中草藥在抗腫瘤及其耐藥性方面的研究顯示出廣闊的應用前景和潛能,其抗腫瘤作用和逆轉(zhuǎn)耐藥性的機制研究和臨床應用仍需進一步探討,以開發(fā)更加高效、低毒、安全的抗腫瘤藥物,為開發(fā)更加高效、低毒的抗腫瘤藥物提供了新的思路和方法。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突