劉道偉， 張 娜， 劉琭璐， 章 梅， 楊惠芳

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，銀川 750004； 2.寧夏環(huán)境因素與慢性病控制重點實驗室，銀川 750004）

塵肺病是在職業(yè)活動中長期吸入不同致病性的生產(chǎn)性粉塵，并在肺內(nèi)潴留而引起的，以肺組織彌漫性纖維化為主的一組職業(yè)性肺部疾病的統(tǒng)稱[1]。目前，塵肺病是我國發(fā)病人數(shù)最多、危害最嚴(yán)重的職業(yè)病，包括矽肺和煤工塵肺[2]。雖然近幾年我國塵肺病的新發(fā)病例數(shù)呈下降趨勢，但塵肺病給我國職業(yè)人群造成的危害仍然不可忽視[3]。在塵肺發(fā)病機制的復(fù)雜炎性網(wǎng)絡(luò)中，線粒體的致病作用越來越受到大家的重視。線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化的場所，為細(xì)胞生命活動提供能量、生成ATP 的同時，生成副產(chǎn)物活性氧，還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、內(nèi)容物致炎等多種作用[4]。因此，粉塵引起的肺組織線粒體功能障礙可能是塵肺纖維化的重要發(fā)病機制之一。本研究擬在建立大鼠塵肺纖維化模型的前提下，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)篩選出塵肺病發(fā)生和發(fā)展過程中與線粒體有關(guān)的重要基因，并進行生物信息學(xué)分析，以期為后續(xù)研究塵肺病的分子機制提供參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

無特定病原體（SPF）級7～8 周齡雄性SD 大鼠30 只，體質(zhì)量200～220 g，購自寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。實驗動物飼養(yǎng)于（25±2）℃，空氣濕度50%～60%，12 h 明暗交替環(huán)境中，自由飲水、攝食，統(tǒng)一進食標(biāo)準(zhǔn)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后開始進行實驗。所有動物實驗均符合動物倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 材料和試劑

煤塵（寧夏煤礦礦井內(nèi)回風(fēng)巷降塵）；二氧化硅標(biāo)準(zhǔn)品（美國Sigma-Aldrich 公司）；乙醚（東莞市化學(xué)試劑有限公司）；4%多聚甲醛（蘭杰科技有限公司）；蘇木素（北京索萊寶科技有限公司）；伊紅（北京索萊寶科技有限公司）；Wiegert 鐵蘇木素（上海雙簡生物科技有限公司）；麗春紅酸性品紅（上海士鋒生物科技有限公司）；磷鉬酸［阿拉丁試劑（上海）有限公司］；苯胺藍(lán)（南京化學(xué)試劑股份有限公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉菌抗生物素蛋白溶液（杭州紐龍生物科技有限公司）；DAB 染色液（北京索萊寶科技有限公司）。

1.3 主要儀器

石蠟切片機、低溫高速離心機（德國Rjung Heidelberg 公司）；潔凈工作臺（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；精密電子天平（寧波金諾天平儀器有限公司）。

1.4 粉塵懸溶液制備

為配制懸濁液50 mg·mL-1，分別稱取1.75 g二氧化硅與煤塵于兩支50 mL 玻璃瓶中，再各加入生理鹽水35 mL，充分混勻，封口后在121 ℃高壓蒸汽鍋內(nèi)消毒20 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 分組和造模

根據(jù)隨機數(shù)表法將大鼠分為3 組，即對照組、煤塵組、矽塵組，每組10 只。采用一次性非氣管暴露法對煤塵組與矽塵組大鼠于氣管內(nèi)分別注入1 mL 已配制好的煤塵和二氧化硅粉塵懸液，對照組以等量的滅菌生理鹽水代替。

1.6 肺組織病理學(xué)檢查

大鼠造模完成后于同一環(huán)境下飼養(yǎng)至90 d，乙醚麻醉后，心尖采血處死。迅速取出完整的肺組織，觀察大體形態(tài)并拍照。取左肺葉置于甲醛中，用于常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，分別進行HE染色和Masson 染色，通過免疫組化檢測膠原蛋白Ⅰ（COL-Ⅰ）表達水平。將右肺葉保存于液氮中，用于轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒灐?/p>

1.7 高通量測序

1.7.1 轉(zhuǎn)錄組測序步驟 對大鼠右肺葉樣本進行總RNA 提取與質(zhì)檢，經(jīng)mRNA 富集、雙鏈cDNA 合成、PCR 富集與文庫純化與庫檢后，開展高通量Illumina 測序分析。測序部分委托北京百邁客生物科技有限公司完成。使用Illumina HiSeq平臺對cDNA 文庫進行測序得到大量raw reads，過濾后得到原始數(shù)據(jù)（clean date），與參考基因組比對，得到mapped data。

1.7.2 基因功能分析與差異表達基因篩選 測序得到各組樣本的校正基因表達量后，進行基因的差異表達定量分析。對對照組與煤塵組、對照組與矽塵組兩兩進行分析，基因差異表達顯著水平與倍數(shù)，使用FDR（false discovery rate）進行可信度檢驗。在差異表達基因檢測過程中，將（上、下調(diào)差異倍數(shù)≥1.5）且FDR＜0.05 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)基因在不同樣品中的表達量進行差異表達分析、差異表達基因功能注釋和功能富集等表達水平分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD－t法。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)觀察

通過對各組肺組織形態(tài)、肺組織切片染色（HE 染色、Masson 染色）和免疫組化COL-Ⅰ表達水平的觀察，發(fā)現(xiàn)煤塵組與矽塵組病理改變明顯且纖維化程度升高，出現(xiàn)了肺纖維化的典型特征，見圖1 至圖4。

圖1 大鼠肺組織形態(tài)學(xué)

圖2 大鼠肺組織HE 染色

圖3 大鼠肺組織Masson 染色

圖4 大鼠肺組織免疫組化實驗

2.2 序列比對分析

將質(zhì)量控制后的clean reads 與參考基因組比對，12 個樣本比對到參考基因組上的reads 數(shù)目及在clean reads 中超過93.91%；比對到參考基因組唯一位置的reads 數(shù)目及在clean reads 中超過86.29%；比對到參考基因組多處位置的reads 數(shù)目及在clean reads 中低于8.11%。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果具有較高的覆蓋度和均勻性。

2.3 基因的差異表達分析

在對照組與煤塵組中，1 246 個基因存在顯著性差異（上調(diào)913 個和下調(diào)333 個）；在對照組與矽塵組中，5 462 個基因存在顯著性差異（上調(diào)2 796 個和下調(diào)2 666 個），見圖5。根據(jù)測序數(shù)據(jù)中的FPKM 值生成差異基因火山圖和聚類熱圖，見圖6。

圖5 差異表達基因圖

2.4 GO 與KEGG 富集分析

對對照組與煤塵組、對照組與矽塵組樣本進行GO 富集分析，得到差異基因在GO term 上的分布情況，包括分子功能、生物過程、細(xì)胞組分。

對照組與煤塵組、對照組與矽塵組的差異基因均主要集中于生物調(diào)節(jié)、刺激反應(yīng)、催化活性、細(xì)胞部分、單一的生物過程、細(xì)胞等功能上。對照組與煤塵組的差異基因富集在前20 條通路上，其中在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、吞噬體、結(jié)核、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用等顯著通路富集的差異基因最多。對照組與矽塵組的差異基因富集在前20條通路上，其中在癌癥的途徑、吞噬體、朊病毒病、結(jié)核等顯著通路富集的差異基因最多，見圖7。

圖7 差異基因GO 注釋分析和KEGG 富集分析

2.5 與線粒體有關(guān)的差異基因

對對照組與煤塵組中的差異基因進行篩選，與線粒體有關(guān)的差異基因Bcl2a1、Scimp、Arg2、Mmp9、Sod2 等，共35 個（28 個上調(diào)，7 個下調(diào)），對照組與煤塵組中相關(guān)差異基因較少。

對照組與矽塵組相比，和線粒體有關(guān)的差異基因Mmp9、Trem2、Akr1b8、Acod1、Ptcd3 等一共302 個（202 個上調(diào)，100 個下調(diào)）。通過GO 富集分析發(fā)現(xiàn)，在生物過程中，細(xì)胞過程、單一的有機體過程較為重要。在細(xì)胞組分中，以細(xì)胞部分、細(xì)胞為主。在分子功能中，以催化活性、活動分子傳感器為主。在對照組與矽塵組中，與線粒體相關(guān)的差異基因通過KEGG 顯著富集到的前20 條通路，包括精氨酸生物合成、丙酮酸代謝、軍團菌病、細(xì)胞凋亡、檸檬酸循環(huán)（TCA 循環(huán)）、氧代羧酸代謝、心肌收縮、p53 信號通路、氨基酸的生物合成、朊病毒病、細(xì)胞凋亡、逆行內(nèi)源性大麻素信號、碳代謝、非酒精性脂肪肝病、氧化磷酸化、帕金森綜合征、亨廷頓病、產(chǎn)熱、阿爾茨海默病、肌萎縮側(cè)索硬化。其中，氧化磷酸化、產(chǎn)熱、帕金森綜合征、朊病毒病等通路富集的與線粒體相關(guān)的差異基因最多，見圖8。

圖8 與線粒體相關(guān)差異基因GO 注釋分析和KEGG 富集分析

3 討論

煤工塵肺的發(fā)生、發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，從單一基因或單一通路探究疾病的發(fā)生和發(fā)展因素、尋求治療靶點是片面且困難的，所以篩選分析差異表達基因十分重要[5]。

本研究采用一次性非暴露式氣管內(nèi)灌注法對大鼠進行染塵實驗，成功建立大鼠肺組織纖維化模型。通過肺組織形態(tài)學(xué)觀察與HE 染色、Masson 染色等觀察，確立大鼠纖維化病理切片特征。結(jié)果顯示，與對照組相比，煤塵組大鼠的肺組織表面觀察到大量煤斑，呈灶狀、境界不清、色黑、質(zhì)軟，存在少量陳舊性的出血點；HE 染色切片中正常固有結(jié)構(gòu)消失，大部分的肺泡間隔消失，肺間質(zhì)鏡下充滿纖維化增生，有毛細(xì)血管擴張充血，炎性細(xì)胞浸潤于肺泡中，有的肺泡腔內(nèi)充滿被煤塵侵蝕的細(xì)胞，煤斑增大融合，局部氣腔擴大。矽塵組大鼠的肺組織表面可見彌漫性粟粒狀結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)隆起于肺表面，質(zhì)地較硬，肺表面有囊腫，并有融合病灶、散在陳舊性出血點；HE染色切片觀察到典型的矽結(jié)節(jié)由已發(fā)生玻璃樣變的膠原纖維構(gòu)成，肺固有結(jié)構(gòu)消失，肺泡結(jié)構(gòu)不存在，肺組織內(nèi)可見彌漫性纖維化病灶。Masson 染色切片中，煤塵組、矽肺組的膠原纖維程度均高于對照組。通過免疫組化對大鼠肺組織切片進行COL-Ⅰ表達水平的測定顯示，煤塵組、矽肺組的COL-Ⅰ表達水平均高于對照組。

高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在挖掘差異表達基因、揭示生物基因表達及調(diào)控機制中發(fā)揮了重要作用[6-7]。通過高通量轉(zhuǎn)錄組測序方式篩選出3 組大鼠的肺組織樣本的差異表達基因，并從中找出與線粒體有關(guān)的差異表達基因進行生物信息學(xué)分析。通過GO 富集分析發(fā)現(xiàn)煤塵組和矽塵組分別與對照組相比，在生物過程中，以細(xì)胞過程、單一的有機體過程較為重要；在分子功能中，以活動分子傳感器、催化活性為主；在細(xì)胞組分中，以細(xì)胞部分、細(xì)胞為主。

KEGG 代謝通路注釋結(jié)果表明，對照組與矽塵組中與線粒體相關(guān)的差異基因富集到的通路中，氧化磷酸化、產(chǎn)熱、帕金森綜合征、朊病毒病等通路富集的基因最多。煤工塵肺中與線粒體相關(guān)的差異基因，如Mmp9，有研究結(jié)果[8]表明，Mmp9 是一種新的線粒體功能障礙生物標(biāo)志物，同時能激活生長因子，促進上皮下成纖維細(xì)胞增殖和活化，導(dǎo)致膠原纖維大量增生。

綜上所述，本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)篩選出煤工塵肺中與線粒體相關(guān)差異基因和通路，這些差異基因可能成為煤工塵肺的基因治療靶點，為進一步解析探索煤工塵肺與線粒體的關(guān)系提供依據(jù)。