閆鳳梅， 李 玲， 郝 羽， 黃 靜， 撒開清， 王 碩

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院職業(yè)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，銀川 750004； 2.寧夏環(huán)境因素與慢性病控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004）

鄰苯二甲酸酯類化合物（phthalic acid esters，PAEs）具有良好的可塑性和延展性，廣泛用于塑料加工等行業(yè)[1]。PAEs 極易通過揮發(fā)、溶解和遷移等方式進(jìn)入環(huán)境，最終經(jīng)皮膚、呼吸道和消化道進(jìn)入人體并對(duì)人體造成損害[2]。PAEs 的種類有很多，包括鄰苯二甲酸二異壬酯（DINP）、鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）、鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）等[3]。有研究[4]表明，DBP 可以破壞鰓的能量代謝和形態(tài)，誘導(dǎo)肝毒性。DBP 通過激活NOD2/RIP2/NF-κB 信號(hào)通路，引起草魚肝細(xì)胞凋亡和炎性因子水平的升高[5]。當(dāng)DBP 被人體吸收后，能水解成鄰苯二甲酸單丁酯（monobutyl phthalate，MBP），MBP 具有多種毒性，對(duì)動(dòng)物生殖和發(fā)育有一定的影響[6]。有研究[7]表明，MBP 對(duì)雄性青春期大鼠內(nèi)分泌器官有一定的毒性作用。MBP 也可以通過TNF/IL6/STAT3 信號(hào)通路誘導(dǎo)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞株（TM-3）細(xì)胞鐵死亡[8]。細(xì)胞焦亡是一種細(xì)胞程序性死亡方式，其發(fā)生通常與各種細(xì)胞死亡有關(guān)，如細(xì)胞凋亡和壞死。有研究[9-11]顯示，Caspase-3/GSDME 通路可引起細(xì)胞焦亡，還可改變凋亡和焦亡之間的平衡[12]。本課題組前期研究結(jié)果表明，MBP 作用于睪丸間質(zhì)細(xì)胞后會(huì)引起細(xì)胞凋亡[13]，一定劑量的MBP 可提高TM-3 細(xì)胞自噬水平[14]。因此，本研究以睪丸間質(zhì)細(xì)胞為模型，以Caspase-3 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡為切入點(diǎn)，探討MBP是否通過Caspase-3/GSDME 通路誘導(dǎo)睪丸間質(zhì)細(xì)胞焦亡，為進(jìn)一步研究MBP 致雄性生殖毒性的作用提供理論依據(jù)和研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、主要儀器與試劑

1.1.1 細(xì)胞株 小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞株（TM-3 細(xì)胞，美國(guó)ATCC 細(xì)胞研究中心）。

1.1.2 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱、發(fā)光成像系統(tǒng)、凈化工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），細(xì)胞計(jì)數(shù)儀［康寧（上海）管理有限公司］，細(xì)胞成像系統(tǒng)倒置生物顯微鏡［愛可機(jī)械（深圳）有限公司］，高速冷凍離心機(jī)（上海力申科學(xué)儀器有限公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)珀金埃爾默股份有限公司）。

1.1.3 試劑 MBP 標(biāo)準(zhǔn)品（純度：99.85%，美國(guó)Medchem Express 公司），胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），細(xì)胞凋亡與壞死試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒和Caspase-3 抑制劑（Ac-DEVD-CHO）（上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司），CCK-8 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、全蛋白提取和BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司），Caspase-3（ab184787）、GSDME（ab215191）、GSDME-N 抗體（ab222407）（英國(guó)Abcam 公司） 和cleaved-Caspase3 抗體（D160009）［生工生物工程（上海）股份有限公司］。

1.2 TM-3 細(xì)胞培養(yǎng)、染毒液配制及分組

復(fù)蘇TM-3，離心棄掉凍存液，加入新配制的完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2、100%相對(duì)濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后換液傳代，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期收集細(xì)胞。MBP 染毒液配制：準(zhǔn)確稱取適量的MBP粉末溶于無菌的二甲基亞砜（DMSO）中制成母液。按照本課題組前期實(shí)驗(yàn)劑量[8]，加入無菌培養(yǎng)基，梯度稀釋成對(duì)照組（0 mmol·L-1）、低劑量組（2.5 mmol·L-1）、中劑量組（5 mmol·L-1）、高劑量組（10 mmol·L-1）的染毒液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 CCK-8 法檢測(cè)不同濃度Caspase-3 抑制劑對(duì)細(xì)胞活力的影響

調(diào)整細(xì)胞濃度，將細(xì)胞接種到96 孔板中，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)到細(xì)胞貼壁后，加入濃度梯度為0（對(duì)照組）、2.5、5、10、20 μmol·L-1的抑制劑繼續(xù)培養(yǎng)24 h，避光加入適量的檢測(cè)液，37 ℃孵育，檢測(cè)其吸光度值。

1.4 光學(xué)顯微鏡下觀察TM-3 細(xì)胞形態(tài)

將TM-3 細(xì)胞接種到6 孔板中，待細(xì)胞鋪滿孔底70%～80%，分別加入0、2.5、5、10 mmol·L-1的MBP 干預(yù)24 h，于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.5 LDH 釋放實(shí)驗(yàn)

取TM-3 懸液，將細(xì)胞接種于96 孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按照分組加入MBP 染毒液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)23 h 后，向樣品最大酶活性孔加入LDH 釋放試劑，繼續(xù)于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。檢測(cè)時(shí)各孔取120 μL 上清液，移至新的96 孔板中，各孔分別加入60 μL 配制好的LDH 檢測(cè)工作液，室溫下避光孵育30 min；采用酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)定各孔光密度（OD）值。計(jì)算：LDH 釋放率（%）=［（實(shí)驗(yàn)孔OD 值-對(duì)照孔OD 值）/（最大酶活性孔OD 值-對(duì)照孔OD 值）］×100%。

1.6 Hoechst 33342/碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色檢測(cè)

各組細(xì)胞經(jīng)不同藥物干預(yù)24 h 后，向含有細(xì)胞的6 孔板中加入5 μL Hoechst 33342 和5 μL PI 染液，于4 ℃條件下避光孵育30 min，PBS 溶液漂洗后，使用倒置熒光顯微鏡拍照。隨機(jī)選取3 個(gè)不同視野，計(jì)算每個(gè)視野中的細(xì)胞總數(shù)及紅色熒光細(xì)胞數(shù)，計(jì)算PI 陽性細(xì)胞比例[15-16]。

1.7 Western blot 檢測(cè)Caspase-3 和GSDME 蛋白變化

將適當(dāng)濃度的細(xì)胞懸液接種于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，混勻。待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80% 時(shí)，用MBP 染毒，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，嚴(yán)格按照全蛋白提取試劑盒說明書操作，用BCA 法測(cè)蛋白濃度，配制合適的上樣體系，變性。通過Western blot（制膠，上樣，跑膠，轉(zhuǎn)膜，剪膜，封閉，一抗孵育，洗膜，二抗孵育，洗膜）檢測(cè)Caspase-3 和GSDME 蛋白的表達(dá)量，并應(yīng)用Image J 軟件計(jì)算灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 9 和SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度MBP 染毒對(duì)TM-3 細(xì)胞形態(tài)的影響

對(duì)照組TM-3 細(xì)胞大多為多邊形，細(xì)胞間排列較密集。隨著染毒劑量的增加，各細(xì)胞間的間隙變大，腫脹和球囊狀冒泡的細(xì)胞增多，貼壁細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，見圖1。

2.2 MBP 染毒對(duì)TM-3 細(xì)胞上清液中LDH 水平的影響

MBP 染毒細(xì)胞24 h 后，檢測(cè)細(xì)胞上清液中的LDH 含量，與對(duì)照組相比，所有處理組細(xì)胞上清液中的LDH 水平均升高（P＜0.01），見圖2。

圖2 不同濃度MBP 對(duì)TM-3 細(xì)胞LDH 釋放率的影響

2.3 Ac-DEVD-CHO 對(duì)TM-3 細(xì)胞活力的影響

CCK-8 法檢測(cè)不同濃度Ac-DEVD-CHO 對(duì)TM-3 細(xì)胞增殖的影響。隨著Ac-DEVD-CHO 濃度的增加，TM-3 細(xì)胞的存活率出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，5 μmol·L-1Ac-DEVDCHO 細(xì)胞存活率為99.17%（P＞0.05）。因此，選擇5 μmol·L-1Ac-DEVD-CHO 作為抑制劑組干預(yù)劑量。進(jìn)一步檢測(cè)各處理組對(duì)細(xì)胞活性的影響，結(jié)果表明，與中劑量組相比，抑制劑組細(xì)胞存活率降低（P＜0.05），見圖3。

圖3 不同處理組染毒對(duì)TM-3 細(xì)胞活力的影響

2.4 Ac-DEVD-CHO 對(duì)TM-3 細(xì)胞上清液中LDH 水平的影響

不同分組處理細(xì)胞24 h 后，檢測(cè)細(xì)胞上清中的LDH 含量，與對(duì)照組相比，所有處理組細(xì)胞上清液中的LDH 水平均升高（P＜0.05）。與中劑量組相比，中劑量+抑制劑組LDH 的釋放率有所下降（P＜0.05），見圖4。

圖4 Ac-DEVD-CHO 對(duì)TM-3 細(xì)胞LDH 釋放率的影響

2.5 MBP 染毒對(duì)TM-3 細(xì)胞PI 陽性比例的影響

經(jīng)Hoechst 33342/PI 雙染后結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各染毒組PI 陽性比例均升高（P 均＜0.05），見圖5。

圖5 不同濃度MBP 對(duì)TM-3 細(xì)胞PI 陽性比例的影響

2.6 Ac-DEVD-CHO 對(duì)TM-3 細(xì)胞PI 陽性比例的影響

與對(duì)照組相比，抑制劑組、中劑量組、中劑量+抑制劑組PI 陽性比例均升高（P 均＜0.05）。與中劑量組相比，中劑量+抑制劑組PI 陽性比例有所下降（P＜0.05），見圖6。

圖6 加入Ac-DEVD-CHO 對(duì)TM-3 細(xì)胞PI 陽性比例的影響

2.7 不同濃度MBP 對(duì)TM-3 細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

各MBP 染毒組cleaved-caspase3 和GSDMEN 蛋白的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比增加。與對(duì)照組相比，中、高劑量組cleaved-caspase3、GSDMEN 蛋白的相對(duì)表達(dá)量均升高（P 均＜0.05），見圖7。

圖7 不同濃度MBP 對(duì)TM-3 細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

2.8 Ac-DEVD-CHO 對(duì)TM-3 細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

與對(duì)照組相比，各染毒組cleaved-caspase3和GSDME-N 的蛋白相對(duì)表達(dá)均上升。與中劑量組相比，中劑量+抑制劑組的cleaved-caspase3和、GSDME-N 蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖8。

圖8 Ac-DEVD-CHO 對(duì)TM-3 細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

3 討論

細(xì)胞焦亡是一種程序性的細(xì)胞死亡方式，它的主要特征是細(xì)胞腫脹、細(xì)胞膜穿孔和細(xì)胞內(nèi)容物的釋放[17]。焦亡通常由炎癥小體觸發(fā)并由氣體蛋白執(zhí)行，它的通路主要分為典型的炎性小體途徑，即激活的Caspase-1 進(jìn)而裂解氣體蛋白D（GSDMD）形成GSDMD n 端，GSDMD n 端能夠與細(xì)胞膜結(jié)合形成跨膜孔，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡；由脂多糖（LPS）與Caspase-4/5 的直接結(jié)合誘導(dǎo)是非典型的炎癥小體途徑；以及Caspase-3 介導(dǎo)的焦亡途徑，Caspase-3 可以裂解氣體蛋白E 形成跨膜孔，然后導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入焦亡過程[9，18]。有研究[19]表明，GSDME 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡主要依賴Caspase-3的剪切活化。

Wang 等[9，20-22]研究表明，焦亡細(xì)胞在光鏡下表現(xiàn)出細(xì)胞腫脹和球囊狀冒泡的顯微鏡特征。而本研究顯示，MBP 作用于TM-3 細(xì)胞后，低、中、高劑量組細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞腫脹和球囊狀冒泡的狀態(tài)，提示細(xì)胞可能發(fā)生了焦亡。

Hoechst 33342/PI 染色和LDH 釋放率測(cè)定是鑒定細(xì)胞焦亡的常用檢測(cè)方法[15，23]。LDH 是存在于細(xì)胞質(zhì)的一種糖酵解酶，細(xì)胞發(fā)生焦亡時(shí)，細(xì)胞膜上會(huì)形成孔洞，LDH 通過孔洞進(jìn)入細(xì)胞外，而PI 染料不能進(jìn)入細(xì)胞膜完整的細(xì)胞。所以可以通過檢測(cè)細(xì)胞LDH 的釋放和Hoechst 33342/PI 染色情況來判斷細(xì)胞膜破損情況[24]。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，MBP 染毒組各組的PI 陽性細(xì)胞比例和LDH 釋放水平均升高，兩者結(jié)果提示，MBP 染毒后導(dǎo)致TM-3 的細(xì)胞膜發(fā)生破損，與何婷婷等[15，24]關(guān)于細(xì)胞膜破損的研究相似。Caspase-3/GSDME 通路是一種細(xì)胞焦亡的通路，GSDME 作為焦亡蛋白，通過其表達(dá)量的變化可以判斷焦亡的發(fā)生與否[9]。本研究結(jié)果表明，各劑量組的Caspase-3 和GSDME 的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組升高，表明MBP 誘導(dǎo)睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生了焦亡。Ac-DEVD-CHO 是一種Caspase-3 蛋白抑制劑，Ac-DEVD-CHO 作用于細(xì)胞后，與中劑量組相比，中劑量+抑制劑組的細(xì)胞存活率提高，LDH 釋放率、PI 陽性細(xì)胞比例以及Caspase-3 和GSDME 的相對(duì)表達(dá)水平降低。表明Ac-DEVD-CHO 可以抑制MBP 誘導(dǎo)的睪丸間質(zhì)細(xì)胞焦亡。提示Caspase-3 參與了MBP 誘導(dǎo)的睪丸間質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的損傷，并且Caspase-3 是GSDME的上游因子。上述研究結(jié)果表明MBP 通過Caspase-3/GSDME 信號(hào)通路誘導(dǎo)TM-3 細(xì)胞焦亡。

綜上所述，MBP 可以通過Caspase-3/GSDME通路誘導(dǎo)睪丸間質(zhì)細(xì)胞焦亡，為進(jìn)一步闡明PAEs 雄性生殖毒性機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但關(guān)于PAEs 的雄性生殖毒性的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。