商曉慧 趙曉玲 詹常森

摘 要 目的：建立健腰密骨片浸膏粉的多成分定量分析方法，為評(píng)價(jià)浸膏粉中間體的質(zhì)量提供依據(jù)。方法：采用HPLC法，以乙腈-磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相，梯度洗脫，測(cè)定健腰密骨片浸膏粉中5種成分的含量。結(jié)果：木蘭花堿、丹酚酸B、朝藿定C、淫羊藿苷和寶藿苷Ⅰ5種成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，r≥0.999 7；5種化合物的平均回收率分別為100.47%、104.37%、95.38%、95.93%、96.66%。該方法的專屬性、重復(fù)性均良好。結(jié)論：該分析方法準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為健腰密骨片浸膏粉的質(zhì)量控制方法。

關(guān)鍵詞 健腰密骨片浸膏粉 HPLC 多成分定量分析

中圖分類號(hào)：O657.72； R286 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2024）03-0071-05

引用本文 商曉慧， 趙曉玲， 詹常森. HPLC法同時(shí)測(cè)定健腰密骨片浸膏粉中5種指標(biāo)成分[J]. 上海醫(yī)藥， 2024， 45（3）： 71-75.

基金項(xiàng)目：上海市2021年度“科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”生物醫(yī)藥科技支撐專項(xiàng)項(xiàng)目（21S21903100）

Simultaneous determination of five constituents in Jianyao Migu tablets by HPLC

SHANG Xiaohui， ZHAO Xiaoling， ZHAN Changsen

（Shanghai Hutchison Pharmaceuticals/Shanghai Engineering Research Center for Innovation of Solid Preparation of TCM， Shanghai 201401， China）

ABSTRACT Objective： To establish a multi-component quantitative analysis method for the extract powder of Jianyao Migu tablets and provide a basis for comprehensive evaluation of the quality of extract powder. Methods： The contents of five components in the extract powder of Jianyao Migu tablets were determined by HPLC method with acetonitrile-phosphate buffer as mobile phase and gradient elution. Results： The five components including magnoflorine， salvianolic acid B， epimedin C， icariin and baohuosideⅠshowed a good linear relationship in their respective concentration ranges （r≥0.999 7）. The average recovery rates of 5 compounds were 100.47%， 104.37%， 95.38%， 95.93% and 96.66%， respectively. The specificity and reproducibility of this method were good. Conclusion： The established analytical method is accurate and reproducible， and can be used for the quality control of extract powder in Jianyao Migu tablets.

KEY WORDS extract powder of Jianyao Migu tablets； HPLC； multi-component quantitative analysis

健腰密骨片是上海和黃藥業(yè)有限公司研發(fā)的中藥1類新藥，于2020年底獲得國(guó)家藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的臨床試驗(yàn)許可。處方由黃芪、淫羊藿、墨旱蓮、丹參等6味中藥經(jīng)提取、純化、濃縮、干燥等一系列工藝制備而成。該方為國(guó)醫(yī)大師施杞教授的經(jīng)驗(yàn)方，具有益氣健腰補(bǔ)腎、化痰通絡(luò)止痛的功效[1]，臨床擬用于治療腎虛血瘀型老年骨質(zhì)疏松性腰痛。方中黃芪具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗等功效，含有黃酮、皂苷等活性成分[2]；淫羊藿具有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕等功效，含有黃酮、木脂素、生物堿等活性成分[3]；墨旱蓮具有滋補(bǔ)肝腎、涼血止血等功效，含有黃酮類、三萜類等活性成分[4]；丹參具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩等功效，含有丹酚酸類、丹參酮類等活性成分[5]；青風(fēng)藤具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、利小便等功效，含有生物堿[6]、揮發(fā)油[7]等活性成分；牛膝具有逐瘀通經(jīng)，補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨等功效，含有三萜皂苷、甾酮類等活性成分[8]。

現(xiàn)有的健腰密骨片成品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了黃芪甲苷、淫羊藿苷和丹酚酸B的含量限度，為了更好地控制成品質(zhì)量，需對(duì)浸膏粉中間體進(jìn)行相關(guān)性研究，探索量質(zhì)傳遞規(guī)律，因此需對(duì)中間體指標(biāo)成分建立含量測(cè)定方法。前期參照健腰密骨片黃芪甲苷含量測(cè)定方法[9]建立了浸膏粉黃芪甲苷含量測(cè)定方法，本研究建立浸膏粉其它主要成分含量的同時(shí)測(cè)定方法。

1 材料和方法

1.1 儀器與試藥

ACQUITY Arc高效液相色譜儀（沃特斯中國(guó)有限公司）；實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)（重慶利迪現(xiàn)代水技術(shù)設(shè)備有限公司）；AL204天平、XS205天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；SK7210HP型超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）。

木蘭花堿對(duì)照品（批號(hào)10555，含量≥98.0%計(jì)），購(gòu)自上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；丹酚酸B對(duì)照品（批號(hào)111562-201917，供含量測(cè)定用，含量以96.6%計(jì)）、朝藿定C對(duì)照品（批號(hào)111780-201905，供含量測(cè)定用，含量以94.3%計(jì)）、淫羊藿苷對(duì)照品（批號(hào)110737-202017，供含量測(cè)定用，含量以98.1%計(jì)）、寶藿苷Ⅰ對(duì)照品（批號(hào)111852-202104，供含量測(cè)定用，含量以99.2%計(jì)）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；健腰密骨片浸膏粉（批號(hào)S190201、211001和S220801）為上海和黃藥業(yè)有限公司自制商業(yè)規(guī)模樣品；乙腈為色譜純?cè)噭?；水為超純水；磷酸二氫鉀和磷酸為色譜純?cè)噭?；其他試劑均為市售分析純?/p>

1.2 方法

1.2.1 溶液制備

1）混合對(duì)照品溶液 精密稱取對(duì)照品木蘭花堿、丹酚酸B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ適量，加80%甲醇溶解制成每毫升分別含500.03、1 003.0、1 002.0、501.7、202.5 mg的混合溶液。

2）供試品溶液 精密稱定健腰密骨片浸膏粉0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇溶液40 mL，稱定重量。超聲處理（功率350 W，頻率53 kHz）30 min，取出，放冷，再稱定重量，用80%甲醇溶液補(bǔ)足減失的量，搖勻，取上清液用有機(jī)微孔濾膜（0.22 mm）濾過，取續(xù)濾液。

3）陰性樣品溶液 根據(jù)處方比例和制劑工藝，分別制得缺淫羊藿藥材、丹參藥材、青風(fēng)藤藥材的單陰性樣品和缺淫羊藿和青風(fēng)藤藥材的雙陰性樣品。按供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。

1.2.2 色譜條件

Agilent ZORBAX SB C18柱（4.6 mm×250 mm，5 mm）；以乙腈（A）-磷酸鹽緩沖液（B）（0.02 mol/L的磷酸二氫鉀溶液，以磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5）為流動(dòng)相，按表1的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 mL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng) 270 nm（木蘭花堿、朝藿定C、淫羊藿苷和寶藿苷Ⅰ，保留時(shí)間0～80 min），286 nm（丹酚酸B，保留時(shí)間30～40 min）。

2 結(jié)果

2.1 專屬性試驗(yàn)

分別取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、單陰性樣品（分別缺淫羊藿、缺丹參、缺青風(fēng)藤）及雙陰性樣品（同時(shí)缺青風(fēng)藤和淫羊藿）溶液10 mL進(jìn)樣分析，結(jié)果見圖1。在木蘭花堿對(duì)照品出峰位置上缺青風(fēng)藤、缺淫羊藿的單陰性樣品溶液上分別出現(xiàn)干擾峰，而在同時(shí)缺青風(fēng)藤和淫羊藿的雙陰性樣品溶液上未見干擾峰，說明木蘭花堿同時(shí)存在于青風(fēng)藤和淫羊藿藥材中，其他藥材中各成分對(duì)木蘭花堿的含量測(cè)定無(wú)干擾；在丹酚酸B對(duì)照品出峰位置上缺丹參陰性樣品溶液未見干擾峰，在朝藿定C、淫羊藿苷和寶藿苷Ⅰ的3個(gè)對(duì)照品出峰位置上缺淫羊藿陰性樣品溶液未見干擾峰，說明各陰性樣品無(wú)干擾。

2.2 線性關(guān)系、檢出限及定量限

精密吸取適量混合對(duì)照品溶液，加入適量80%甲醇稀釋，使木蘭花堿質(zhì)量濃度分別為12.51、25.02、50.03、100.06、250.15、500.30 mg/mL；丹酚酸B質(zhì)量濃度為25.08、50.15、100.30、200.60、501.50、1 003.0 mg/mL；朝藿定C質(zhì)量濃度為25.05、50.10、100.20、200.40、501.0、1 002.0 mg/mL；淫羊藿苷質(zhì)量濃度為12.54、25.09、50.17、100.34、250.85、501.70 mg/mL；寶藿苷Ⅰ質(zhì)量濃度為5.06、10.13、20.25、40.50、101.25、202.50 mg/mL。取各個(gè)質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液進(jìn)行液相色譜分析。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)（r）。以信噪比S/N=10時(shí)對(duì)照品的含量為定量限，以信噪比S/N=3時(shí)對(duì)照品的含量為檢測(cè)限，結(jié)果顯示，各成分在各自的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（表2）。

2.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液適量，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)行液相色譜分析。結(jié)果顯示，木蘭花堿、丹酚酸B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ色譜峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為0.40%、0.04%、0.05%、0.15%、0.16%，RSD均小于2.0%，符合2020版中國(guó)藥典要求[10]，表明儀器精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

平行制備6份樣品（批號(hào)211001），進(jìn)行液相色譜檢測(cè)。結(jié)果顯示，木蘭花堿、丹酚酸B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為0.52%、0.69%、0.79%、0.86%、0.78%，RSD均小于3.0%，符合2020版中國(guó)藥典要求[10]，表明該方法重復(fù)性較好。

2.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱定9份各成分含量已知的樣品（批號(hào)211001）0.25 g，分別加入相當(dāng)于樣品中各成分含量的80%、100%、120%的對(duì)照品，進(jìn)行液相色譜測(cè)定，計(jì)算各成分含量的平均回收率和RSD值。結(jié)果顯示，木蘭花堿、丹酚酸B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ的平均回收率分別為100.47%、104.37%、95.38%、95.93%、96.66%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為2.88%、1.95%、2.52%、2.87%、4.59%，符合2020版中國(guó)藥典要求[10]，表明該方法準(zhǔn)確度較好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液（批號(hào)211001），于室溫下放置0、2、4、8、12、18、24、48、72 h時(shí)進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示，木蘭花堿、丹酚酸B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ色譜峰面積在72 h內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為0.52%、0.19%、0.20%、0.58%、0.87%，RSD均小于2.0%，表明供試品溶液在室溫下放置72 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 耐用性試驗(yàn)

取同一批健腰密骨片浸膏粉（批號(hào)211001）制備成供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，考察不同類型/不同批號(hào)色譜柱（Agilent Zorbax SB-C18、Agilent Eclipse Plus-C18）對(duì)木蘭花堿、丹酚酸B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ含量檢測(cè)的影響。結(jié)果顯示不同型號(hào)色譜柱檢測(cè)各指標(biāo)性成分的分離度均大于1.5，含量RSD均小于5.0%，表明該方法耐用性良好（表3）。

2.8 樣品含量測(cè)定

取3批健腰密骨片浸膏粉制備成供試品溶液，每批各進(jìn)樣測(cè)定2次，計(jì)算含量（表4）。結(jié)果顯示該方法下測(cè)定各批次樣品含量相對(duì)偏差均小于5.0%，表明該方法檢測(cè)樣品含量數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠。

3 討論

研究[11-12]發(fā)現(xiàn)木蘭花堿同時(shí)存在于淫羊藿和青風(fēng)藤藥材中，故本研究同時(shí)制備缺淫羊藿、缺青風(fēng)藤的單陰性樣品溶液及缺上述兩味藥材的雙陰性樣品溶液，經(jīng)證實(shí)在木蘭花堿色譜峰出峰位置上分別缺兩味藥材的單陰性樣品溶液（圖1 C和E）均出現(xiàn)干擾峰，在同時(shí)缺兩味藥材的雙陰性樣品溶液（圖1F）未出現(xiàn)干擾峰。

本研究對(duì)浸膏粉質(zhì)量濃度（0.01、0.012 5、0.016 7、0.025、0.05 g/mL）、提取溶劑甲醇濃度（20%、40%、60%、80%）和乙醇濃度（60%）、超聲時(shí)間（20、30、40、50、60 min）分別進(jìn)行考察，綜合考慮色譜峰數(shù)量、峰面積等因素，最終選擇0.025 g/mL樣品80%甲醇超聲提取30 min作為提取條件。

本研究還分別考察了流動(dòng)相酸鹽種類和濃度（水、0.05%磷酸、0.1%磷酸、0.1%乙酸、乙二胺、0.01 mol/L磷酸二氫鉀、0.02 mol/L磷酸二氫鉀）對(duì)液相色譜分析的影響，發(fā)現(xiàn)不同種類酸鹽對(duì)木蘭花堿和丹酚酸B的2個(gè)色譜峰峰形和出峰時(shí)間影響較大，經(jīng)過對(duì)比研究后選擇0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液，再以磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5作為流動(dòng)相。

綜上，本研究建立的健腰密骨片浸膏粉多成分定量分析方法可同時(shí)對(duì)處方中木蘭花堿、丹酚酸B、朝藿苷C、淫羊藿苷和寶藿苷Ⅰ共5種成分進(jìn)行定量分析，體現(xiàn)方中青風(fēng)藤、丹參、淫羊藿3味藥材，可作為健腰密骨片中間體多味藥指標(biāo)成分的檢測(cè)方法。后期將進(jìn)行中間體及成品指紋圖譜研究，以期對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行更全面的表征和控制。

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