張成鑫 楊杰 郝欣欣 王秋實(shí)

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，遼寧沈陽(yáng) 110004

造血干細(xì)胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）是惡性血液系統(tǒng)疾病主要治療方法之一[1]。主要工作原理是將骨髓中造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）動(dòng)員至外周血中，通過(guò)血細(xì)胞單采機(jī)采集足量的HSC供移植使用。根據(jù)HSC的來(lái)源可以分為自體HSCT（auto-HSCT）和異體HCST（allo-HSCT）。HSCT成功的關(guān)鍵是采集當(dāng)天外周血中有足夠的HSC，并設(shè)置合適的采集參數(shù)采集出足夠的HSC[1-3]。

外周血中CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)是預(yù)測(cè)外周血中HSC含量最有效的參數(shù)，一般認(rèn)為行auto-HSCT時(shí)CD34+細(xì)胞數(shù)至少為2×106/kg[2-3]，多數(shù)患者因需要采集時(shí)間較長(zhǎng)，沒(méi)有足夠時(shí)間等待外周血CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)完成后即開(kāi)始采集。因此多數(shù)根據(jù)動(dòng)員劑使用情況、采集動(dòng)員時(shí)間、當(dāng)日白細(xì)胞計(jì)數(shù)確定是否采集[4-5]。以往研究發(fā)現(xiàn)診斷時(shí)間長(zhǎng)、化療周期6個(gè)周期以上，骨髓中漿細(xì)胞含量超過(guò)20%是HSC采集不足風(fēng)險(xiǎn)因素[6-8]。本研究回顧性調(diào)查了2018年1月—2023年1月應(yīng)用便攜式血細(xì)胞采集儀MCS+進(jìn)行的140次自體HSC采集情況，分析不同采集效果的患者采集前以及采集時(shí)參數(shù)的差異，旨在發(fā)現(xiàn)影響HSC采集效果的因素，預(yù)測(cè)患者采集效果，為后續(xù)采集和治療提供預(yù)測(cè)方案。

材料與方法

1 研究對(duì)象

以2018年1月—2023年1月在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院行auto-HSCT的63名患者的140次HSC采集為研究對(duì)象。采集前簽署HSC動(dòng)員和血細(xì)胞分離單采知情同意書(shū)。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥14歲，擬行auto-HSCT，完成一次完整HSC采集。排除標(biāo)準(zhǔn)：異基因HSC采集，年齡＜14歲，患者不能耐受或者采集時(shí)有特殊情況中途停止采集。數(shù)據(jù)回顧性調(diào)查經(jīng)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。不涉及患者隱私，免除知情同意。

2 試劑與儀器

便攜式血細(xì)胞采集儀（MCS+，美國(guó)血液技術(shù)，美國(guó)）、血細(xì)胞分析儀（XP-100，Sysmex，日本）、重組人粒細(xì)胞集落刺激因子250 μg（批號(hào)：N19K312，格拉諾賽特，日本）、一次性使用血細(xì)胞分離器971E（批號(hào)：8921132，美國(guó)血液技術(shù)，美國(guó)）、 血液保存液ACD-A（批號(hào)：2202271，山東威高，中國(guó)）、葡萄糖酸鈣注射液（批號(hào)：20220512，華潤(rùn)雙鶴利民藥業(yè)，中國(guó)）。

3 HSC動(dòng)員

患者動(dòng)員方案：多發(fā)性骨髓瘤（Mutiple myeloma，MM）患者采用CE動(dòng)員方案（環(huán)磷酰胺3 g/m2，d1；依托泊苷100 mg，d1-4）。淋巴瘤患者采取ESHAP動(dòng)員方案（順鉑20 mg/m2，d1-4；依托泊苷100 mg，d1-4；甲基強(qiáng)的松龍500 mg，d1-4；阿糖胞苷1 500 mg/m2，d5）。聯(lián)合粒細(xì)胞集落刺激因子。從化療后患者白細(xì)胞到達(dá)最低值（簡(jiǎn)稱低點(diǎn)）開(kāi)始回升時(shí)給予粒細(xì)胞集落刺激因子5 μg/（kg·d），1次/12 h皮下注射，d4-5或白細(xì)胞升高至3×109/mL開(kāi)始干細(xì)胞采集。

4 HSC采集前評(píng)估

采集當(dāng)日復(fù)查血常規(guī)，并在采集前2 h使用粒細(xì)胞集落刺激因子。所有患者采集后以CD34+含量≥2×106/kg作為采集效果較好判斷標(biāo)準(zhǔn)[2-3]，根據(jù)患者需要移植干細(xì)胞數(shù)量決定是否再次采集。

5 HSC采集

使用便攜式血細(xì)胞采集儀MCS+進(jìn)行采集，程序?yàn)橥庵苎狧SC采集，采集區(qū)間選擇分光度45%～12%，后推8～12 mL紅細(xì)胞，再循環(huán)比例1∶4，循環(huán)總血量設(shè)定為患者總血容量的1.5～2倍，根據(jù)終體積進(jìn)行微調(diào)。采集過(guò)程應(yīng)用枸櫞酸抗凝，抗凝比例為1∶8～1∶12。采集過(guò)程中密切觀察患者是否有口唇麻木，抽搐，心慌低鈣反應(yīng)等，每小時(shí)給予口服10%葡萄糖酸鈣口服液一支，預(yù)防枸櫞酸鈉過(guò)量，采集后的干細(xì)胞進(jìn)行血常規(guī)和CD34+計(jì)數(shù)。

6 分組

以采集終產(chǎn)物中的CD34+計(jì)數(shù)分組，其中的CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)≥2×106/kg計(jì)為良好組，＜2×106/kg計(jì)為不佳組[9-10]。

7 觀察指標(biāo)

回顧性調(diào)查兩組患者性別，年齡，體重，診斷，采血血量，低點(diǎn)天數(shù)，低點(diǎn)時(shí)白細(xì)胞水平，低點(diǎn)到采集天數(shù)，采集前1日白細(xì)胞計(jì)數(shù)，采集當(dāng)日白細(xì)胞計(jì)數(shù)，采集當(dāng)日淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，采集當(dāng)日單核細(xì)胞計(jì)數(shù)，采集當(dāng)日血紅蛋白（hemoglobin，HB）紅細(xì)胞壓積（hematocrit，HCT），采集干細(xì)胞容積，循環(huán)總血量。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均采用中位數(shù)（范圍）及中位數(shù)（四分位間距）表示。計(jì)量數(shù)據(jù)均不服從正態(tài)分布，采用Wilcoxon兩獨(dú)立樣本檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用卡方檢驗(yàn)。風(fēng)險(xiǎn)因素分析采用Logistic回歸分析。采用DeLong方法對(duì)年齡、采集時(shí)間，有核細(xì)胞及總體模型曲線下面積進(jìn)行比較[11]。

采用受試者特征（receiver operating characteristic curve，ROC）曲線下面積（area under the curve of AUC）評(píng)估模型的準(zhǔn)確性。根據(jù)約登指數(shù)最大值確定截?cái)嘀?，?jì)算靈敏度與特異度等指標(biāo)。采用DeLong的方法對(duì)年齡、采集時(shí)間，白細(xì)胞及總體模型曲線下面積進(jìn)行比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 兩組患者基本情況及采集情況

共63名患者140次自體HSC采集納入分析，其中男性患者79例次，女性患者61例次，淋巴瘤88例次，MM 52例次。兩組采集前實(shí)驗(yàn)室參數(shù)：動(dòng)員到低點(diǎn)時(shí)間、動(dòng)員時(shí)最低白細(xì)胞計(jì)數(shù)、低點(diǎn)到采集的天數(shù)、采集當(dāng)天患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞壓積和血紅蛋白水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。兩組患者基本情況以及采集情況見(jiàn)表1。

表1 兩組患者基本情況以及采集情況

2 影響患者采集效果獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素

Logistic回歸分析后發(fā)現(xiàn)，患者年齡、低點(diǎn)到采集的天數(shù)以及采集當(dāng)天單核細(xì)胞計(jì)數(shù)是影響采集效果的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。影響采集效果獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素見(jiàn)表2。

表2 影響采集效果獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素

3 采集效果預(yù)測(cè)模型評(píng)估

患者年齡、低點(diǎn)到采集的天數(shù)、采集當(dāng)天單核細(xì)胞計(jì)數(shù)的ROC曲線下面積分別為0.63，0.73，0.70。多變量模型的曲線下面積為0.81，高于單個(gè)變量的表現(xiàn)，P值均＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?；颊吣挲g、低點(diǎn)到采集的天數(shù)、采集當(dāng)天單核細(xì)胞計(jì)數(shù)及總體模型曲線下面積見(jiàn)圖1。

圖1 患者年齡、低點(diǎn)到采集的天數(shù)、采集當(dāng)天單核細(xì)胞計(jì)數(shù)及總體模型曲線下面積

討 論

目前，HSC采集動(dòng)員方案多數(shù)采取化療聯(lián)合粒細(xì)胞集落刺激因子進(jìn)行動(dòng)員，動(dòng)員后幾天或白細(xì)胞回升到一定程度時(shí)開(kāi)始采集。HSC采集設(shè)備工作原理是利用透光度探針對(duì)采集到離心杯內(nèi)離心全血進(jìn)行透光度檢測(cè)，血細(xì)胞為有形成分，含有不同類型細(xì)胞的血漿透光度不同，根據(jù)不同細(xì)胞透光度差異可以對(duì)目的細(xì)胞進(jìn)行采集[12]。本研究對(duì)便攜式血細(xì)胞采集儀MCS+的采集效果進(jìn)行分析。

CD34+細(xì)胞目前是HSC成功采集的最有效的標(biāo)志物和預(yù)測(cè)指標(biāo)，在外周血中，含量低于0.1%，動(dòng)員后的外周血中可以含有相當(dāng)于骨髓甚至高于骨髓的CD34+細(xì)胞[1-3]，因此可以通過(guò)采集動(dòng)員后的外周血獲得足夠的HSC。但是由于CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)回報(bào)時(shí)間較長(zhǎng)，動(dòng)員后干細(xì)胞在體外容易快速分化成熟，另外由于HSC采集時(shí)間較長(zhǎng)，因此一般不等待CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，多數(shù)根據(jù)動(dòng)員天數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)等情況啟動(dòng)采集。本研究根據(jù)采集后CD34+/kg的數(shù)量進(jìn)行分組后發(fā)現(xiàn)良好組和不佳組中包括診斷、到達(dá)低點(diǎn)天數(shù)、低點(diǎn)白細(xì)胞計(jì)數(shù)、低點(diǎn)到采集天數(shù)、采集當(dāng)日白細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、當(dāng)日HB值、當(dāng)日HCT、循環(huán)總血量均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與以往文獻(xiàn)報(bào)告干細(xì)胞采集與患者性別、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、動(dòng)員方案、血小板計(jì)數(shù)，循環(huán)中不成熟細(xì)胞數(shù)量相關(guān)等部分一致[7-8]。提示患者的基礎(chǔ)疾病以及對(duì)動(dòng)員反應(yīng)情況可能影響采集效果。

在分析基礎(chǔ)疾病時(shí)發(fā)現(xiàn)患有淋巴瘤的患者采集效果優(yōu)于MM患者，盡管均為惡性血液病，但是MM主要累計(jì)骨髓，骨髓中干細(xì)胞儲(chǔ)備不足，導(dǎo)致即使使用了足量的動(dòng)員劑，但是外周血中仍沒(méi)有足夠的HSC用于動(dòng)員。PUSIC等[13]發(fā)現(xiàn)無(wú)論使用哪種動(dòng)員方案MM患者多次采集率都高于淋巴瘤患者。

在干細(xì)胞動(dòng)員的過(guò)程中，多數(shù)使用化療藥物結(jié)合集落細(xì)胞刺激因子方案。應(yīng)用化療藥物后患者由于骨髓造血抑制，導(dǎo)致外周血中白細(xì)胞逐漸下降到最低，然后隨著化療停止，骨髓造血恢復(fù)，外周血中白細(xì)胞逐漸升高，結(jié)合集落細(xì)胞刺激因子作用，骨髓中HSC動(dòng)員到外周血中，即可以進(jìn)行采集。對(duì)比采集良好組，發(fā)現(xiàn)不佳組患者到達(dá)低點(diǎn)天數(shù)長(zhǎng)，低點(diǎn)時(shí)白細(xì)胞計(jì)數(shù)低，低點(diǎn)到采集時(shí)間長(zhǎng)，采集當(dāng)日白細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)均較低。提示采集不佳組骨髓儲(chǔ)備能力可能較差，化療藥物使用后，外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)快速下降，停藥后，盡管使用足量集落細(xì)胞刺激因子，但是由于患者體內(nèi)沒(méi)有充分HSC，導(dǎo)致外周血中成熟細(xì)胞和干細(xì)胞均較少，無(wú)法采集充足的干細(xì)胞[13]。

單針采集過(guò)程是采集一定量的外周血后，在離心杯中逐漸將透光度高的血漿推送到轉(zhuǎn)移袋中，采集一定透光度區(qū)間的細(xì)胞成分，完成干細(xì)胞分離采集，采集過(guò)程和回輸過(guò)程交替進(jìn)行。因此，患者HB值和HCT會(huì)影響每次體外分離血量，貧血患者由于HCT低，需要更多離體血液用于分離HST。本研究結(jié)果顯示，采集效果不佳組患者的HB和HCT均低于采集效果較好組。與李少文等[14]發(fā)現(xiàn)采集時(shí)HB低，采集的干細(xì)胞中HSC含量低結(jié)果一致。分析原因也可能與患者骨髓儲(chǔ)備低有關(guān)，紅系造血恢復(fù)較慢。對(duì)比總的循環(huán)血量，效果不佳組循環(huán)血量更多，單針干細(xì)胞采集時(shí)使用間斷采集的方式，采集不佳組由于貧血患者較多，每次循環(huán)處理血量較多導(dǎo)致總處理量較多。另外，采集人員也會(huì)根據(jù)前次采集結(jié)果臨時(shí)提高總處理量以期待采集更多的干細(xì)胞，但是從分析結(jié)果看，盡管循環(huán)血量增加，仍不能采集足夠的干細(xì)胞，提示有效的動(dòng)員時(shí)機(jī)和采集時(shí)機(jī)才是HSC采集效果的有效保障。

為了分析影響采集獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，本研究對(duì)17個(gè)因素進(jìn)行的Logistic回歸結(jié)果顯示，患者年齡、低點(diǎn)到采集的天數(shù)、采集當(dāng)日的單核細(xì)胞計(jì)數(shù)是影響采集效果的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，以上因素對(duì)于預(yù)測(cè)采集效果的ROC曲線下面積分別為0.63，0.73，0.70。年齡小、低點(diǎn)到采集的時(shí)間短，采集當(dāng)日單核細(xì)胞計(jì)數(shù)高與采集效果好相關(guān)，患者對(duì)于動(dòng)員劑反應(yīng)速度快，反應(yīng)效率高是有效采集的重要保障。KONG等[15]和苗瑩瑩等[16]在對(duì)異基因供者采集影響因素中也發(fā)現(xiàn)供者年齡是影響采集效果的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，在異基因供者不能及時(shí)進(jìn)行CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，通過(guò)對(duì)上述3個(gè)參數(shù)判斷可以預(yù)測(cè)采集效果，3個(gè)參數(shù)對(duì)于預(yù)測(cè)采集效果預(yù)測(cè)曲線下面積為0.81，可以較好預(yù)測(cè)采集效果，以為繼續(xù)采集或者更換治療方案做準(zhǔn)備。

總之，通過(guò)應(yīng)用MCS+采集的自體HSC回顧性分析發(fā)現(xiàn)患者的基礎(chǔ)疾病、對(duì)動(dòng)員劑的反應(yīng)、患者采集前HB等在采集效果良好和不佳組有區(qū)別。患者年齡、低點(diǎn)到采集的天數(shù)、采集當(dāng)日的單核細(xì)胞是影響采集效果的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突