秦亞彬 張古英 趙德運(yùn)

河北省兒童醫(yī)院藥學(xué)部，河北石家莊 050031

甲氨蝶呤是抗葉酸類抗腫瘤藥，廣泛應(yīng)用于急性淋巴細(xì)胞白血病、淋巴瘤等疾病的化療[1-2]。研究顯示，常規(guī)監(jiān)測(cè)甲氨蝶呤血藥濃度可以有效降低不良反應(yīng)發(fā)生率[3-5]。左乙拉西坦和拉莫三嗪為第二代抗癲癇藥，在患兒中有較好的療效[6-8]。左乙拉西坦和拉莫三嗪聯(lián)合應(yīng)用或用于兒童、孕婦和肝腎功能異常的患者時(shí)，建議監(jiān)測(cè)血藥濃度[9-10]。

甲氨蝶呤、左乙拉西坦和拉莫三嗪均屬于兒童治療藥物監(jiān)測(cè)的常規(guī)品種[11-12]。實(shí)際臨床治療過程中存在癲癇患者聯(lián)合使用兩種抗癲癇藥的現(xiàn)象，癲癇合并白血病患者有兩種藥物聯(lián)用的可能。甲氨蝶呤和左乙拉西坦均為P-糖蛋白底物，兩者聯(lián)用可導(dǎo)致甲氨蝶呤的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)發(fā)生變化，繼而影響其濃度，增加腎毒性[13]。

HPLC-MS/MS 法具有良好的分離能力和選擇性，可以同時(shí)檢測(cè)多種藥物，近年來被廣泛用于治療藥物的監(jiān)測(cè)工作[14-15]。兒童血管細(xì)小，采血困難。故本研究嘗試采用微量血漿樣本，建立同時(shí)測(cè)定甲氨蝶呤、左乙拉西坦、拉莫三嗪濃度的HPLC-MS/MS 法，以用于患兒血藥濃度監(jiān)測(cè)，為合理用藥提供保障。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Agilent Ultivo 三重四極桿質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）；低溫高速離心機(jī)（北京白洋醫(yī)療器械有限公司）；渦旋混合器（杭州佑寧儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

甲氨蝶呤對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100138-201704，純度：99.4%）；內(nèi)標(biāo)甲氨蝶呤-D3（上海源葉生物有限公司，批號(hào)：H17M9Q56012，純度＞98.0%）；左乙拉西坦（成都德思特生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：DST-190223-028）；內(nèi)標(biāo)左乙拉西坦-D6，（深圳海思安生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：30001101，純度：98%）；拉莫三嗪（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100775-201902，純度：99.7%）；內(nèi)標(biāo)拉莫三嗪-13C3-D3（深圳海思安生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：30002385，純度：98%）；甲醇為色譜純（賽默飛世爾科技有限公司）；甲酸為色譜純（美國MREDA 公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；血漿均來源于河北省兒童醫(yī)院。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 分析柱為Agilent C18（50mm×2.1mm，1.8μm）；流動(dòng)相0.1%甲酸水（A）和甲醇（B）梯度洗脫（0.00～0.50 min，98%→95%A；0.50～1.50 min，95%→5%A；1.50～2.40 min，5% A；2.41～2.50 min，95% →98% A；2.50～3.50 min，98%A）；柱溫：45℃；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：8 ℃；流速為0.4 ml/min；進(jìn)樣體積：3 μl。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源，正離子模式；鞘氣溫度：280 ℃，鞘氣體積流量：11 L/min；噴嘴電壓：500 V；霧化器壓力：15 psi；毛細(xì)管電壓：正電壓4 000 V；干燥氣溫度：300 ℃，干燥氣體積流量7 L/min；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描分析。

離子通道選擇：甲氨蝶呤m/z 455.1→308.2，內(nèi)標(biāo)甲氨蝶呤-D3 m/z 458.1→311.1；左乙拉西坦m/z 171.1.4→126.2，內(nèi)標(biāo)左乙拉西坦-D6 m/z 177.2→132.2；拉莫三嗪m/z 256.1→211，內(nèi)標(biāo)拉莫三嗪-13C3-D3 m/z 262.1→217.1。碰撞能均為20 eV。

2.2 溶液配制

2.2.1 對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)溶液制備 準(zhǔn)確稱取甲氨蝶呤10.3 mg 置于50 ml 容量瓶中，左乙拉西坦、拉莫三嗪各20 mg 置于5 ml 容量瓶中，甲氨蝶呤-D3、左乙拉西坦-D6、拉莫三嗪-13C3-D3 各1 mg 用甲醇/ 水（V/V=1/1）分別溶解，超聲助溶并稀釋至刻度，獲得儲(chǔ)備液。用甲醇/水（V/V=1/1）對(duì)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋獲得一系列濃度對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)溶液及500 ng/ml 甲氨蝶呤-D3、30 μg/ml 左乙拉西坦-D6 和15 μg/ml 拉莫三嗪-13C3-D3 的混合內(nèi)標(biāo)溶液，-80℃冷凍保存。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品制備 精密吸取50 μl 甲氨蝶呤、50 μl 左乙拉西坦和50 μl 拉莫三嗪各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液加入離心管中，再加入1 850 μl 空白血漿渦旋混勻，制成6 個(gè)濃度系列的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線。甲氨蝶呤的濃度為25、50、100、500、1 000、1 500 ng/ml，左乙拉西坦的濃度為1、2、5、10、25、50 μg/ml，拉莫三嗪的濃度為0.5、1.0、2.5、5.0、12.5、25.0 μg/ml。

另取適量?jī)?chǔ)備液用空白血漿稀釋制得3 個(gè)濃度水平的混合質(zhì)控樣品。其中甲氨蝶呤的質(zhì)量濃度為75、300、1 200 ng/ml，左乙拉西坦的質(zhì)量濃度為3、20、40 μg/ml、拉莫三嗪的質(zhì)量濃度為1.5、10.0、20.0 μg/ml。

2.3 樣品前處理

精密吸取10 μl 血漿樣本，加入10 μl 混合內(nèi)標(biāo)溶液和100 μl 甲醇，渦旋1 min，11360 r/min 離心10 min，離心半徑為50 mm，取50 μl 上清液，用水稀釋5 倍后轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶供進(jìn)樣分析。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

根據(jù)《中華人民共和國藥典》[14]生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則，從選擇性、殘留、定量下限、校準(zhǔn)曲線、準(zhǔn)確度和精密度、稀釋可靠性及穩(wěn)定性方面對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證。

2.4.1 特異性考察 取6 個(gè)不同批次的空白血漿以等體積的甲醇/水（50/50）替代內(nèi)標(biāo)溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法處理分析，記錄空白血漿樣品色譜圖。另取上述6 份空白血漿配制成分析物標(biāo)準(zhǔn)血漿溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣，記錄待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物的色譜圖。結(jié)果顯示，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾甲氨蝶呤、左乙拉西坦和拉莫三嗪及其內(nèi)標(biāo)物的測(cè)定。見圖1。

圖1 左乙拉西坦、拉莫三嗪和甲氨蝶呤及內(nèi)標(biāo)物的典型色譜圖

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限 將“2.2.2”項(xiàng)下6 個(gè)濃度的樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣檢測(cè)。采用最小二乘法進(jìn)行回歸擬合，求得直線回歸方程并計(jì)算校正標(biāo)樣濃度。甲氨蝶呤在25～1 500 ng/ml 線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=0.251 6X+0.003 4（r=0.998 9），定量下限為25 ng/ml；左乙拉西坦在1～50 μg/ml 線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=16.687 6X+0.000 2（r=0.991 1），定量下限為1 μg/ml；拉莫三嗪在0.5～25.0 μg/ml 線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=46.369 5X-0.059 9（r=0.999 1），定量下限為0.5 μg/ml。定量下限信噪比均＞5，符合定量要求。

2.4.3 精密度與準(zhǔn)確度 混合質(zhì)控樣品和定量下限濃度樣品按“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測(cè)定，每個(gè)濃度平行測(cè)定5 份，批內(nèi)及批間準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果均符合要求。見表1。

表1 批內(nèi)及批間精密度及準(zhǔn)確度結(jié)果

2.4.4 基質(zhì)效應(yīng)取6 個(gè)不同個(gè)體來源的空白血漿，按“2.3”項(xiàng)下方法配置低、高濃度的混合質(zhì)控樣品，分別計(jì)算經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化后的基質(zhì)效應(yīng)因子及變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）。結(jié)果顯示，經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化后，各化合物基質(zhì)效應(yīng)因子的CV 均＜15%，樣品測(cè)定不受基質(zhì)的影響。見表2。

表2 各待測(cè)藥物在人血漿中的基質(zhì)效應(yīng)

2.4.5 殘留效應(yīng) 系統(tǒng)殘留分析是對(duì)定量上限樣品分析后立即分析空白血漿樣品。要求殘留不超過待測(cè)物定量下限的20%，不超過內(nèi)標(biāo)峰面積的5%。結(jié)果顯示，殘留符合接受標(biāo)準(zhǔn)。

2.4.6 稀釋可靠性 分別配制高于定量上限的標(biāo)準(zhǔn)樣品，其中甲氨蝶呤質(zhì)量濃度為30 μg/ml、左乙拉西坦和拉莫三嗪濃度均為100 μg/ml，用空白血漿稀釋上述樣品，使稀釋后樣品質(zhì)量濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，平行5 份，計(jì)算稀釋后樣品測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度。結(jié)果均＜15%，符合標(biāo)準(zhǔn)。

2.4.7 穩(wěn)定性 制備低、高濃度水平的混合質(zhì)控樣品，分別考察室溫放置24 h、-20 ℃凍存2 周、反復(fù)凍融3次及自動(dòng)進(jìn)樣器保存12 h 的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，甲氨蝶呤、左乙拉西坦和拉莫三嗪在以上條件下均不影響其測(cè)定準(zhǔn)確度。見表3。

表3 穩(wěn)定性結(jié)果

2.5 臨床應(yīng)用

建立的檢測(cè)方法經(jīng)驗(yàn)證后應(yīng)用于治療藥物監(jiān)測(cè)。2022 年10 月至2023 年3 月共檢測(cè)了1 348 例患兒樣本?；純翰裳笾糜贓DTA 抗凝采血管，4 000 r/min離心10 min，離心半徑為100 mm，取血漿；按“2.3”項(xiàng)下方法處理后檢測(cè)。共檢測(cè)甲氨蝶呤360 例，均為腫瘤維持性化療患兒，大劑量輸注甲氨蝶呤后24、48、72 h采血，其測(cè)定范圍在0.055～132.350 μmol/L。左乙拉西坦830 例、拉莫三嗪158 例，均為癲癇患兒，口服左乙拉西坦或拉莫三嗪1 周以上（達(dá)穩(wěn)態(tài)后），于清晨服藥前采血（谷濃度），左乙拉西坦測(cè)定范圍在1.00～44.19 μg/ml；拉莫三嗪測(cè)定范圍在0.50～17.68 μg/ml。本研究經(jīng)河北省兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（醫(yī)研倫審第202210 號(hào)）。

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道，HPLC-MS/MS 法主要用于同時(shí)測(cè)定多種理化性質(zhì)相似的同類藥物[15-17]。而本研究嘗試同時(shí)檢測(cè)理化性質(zhì)相差較大不同類藥物。在優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件時(shí)，嘗試了不同比例的流動(dòng)相和添加劑，最終采用梯度洗脫并且流動(dòng)相添加甲酸的方法，使甲氨蝶呤、左乙拉西坦和拉莫三嗪均有合適的保留時(shí)間，峰形較好，無拖尾現(xiàn)象，可以滿足檢測(cè)要求。另外，與已知方法比較，本研究只需要10 μl 血漿，非常適用于兒童等采血困難群體[18-21]。

在生物樣本分析的前處理方法中，蛋白沉淀法因其處理簡(jiǎn)便，易于操作，廣受青睞[22]。本研究選擇甲醇作為沉淀劑，待測(cè)物有足夠的提取回收率，可以滿足檢測(cè)需求。樣品前處理采用蛋白沉淀法，往往不能完全去除蛋白、鹽類和磷脂，這些內(nèi)源性干擾能引起基質(zhì)效應(yīng)[23]。本研究中采用與待測(cè)物結(jié)構(gòu)相似的同位素標(biāo)記作為內(nèi)標(biāo)，以降低基質(zhì)效應(yīng)的干擾。同位素內(nèi)標(biāo)具有與待測(cè)物相同的色譜行為，是HPLC-MS/MS 法最合適的內(nèi)標(biāo)[24]。另外，樣品經(jīng)蛋白沉淀法后的上清液，加水稀釋5 倍后再進(jìn)樣，以降低基質(zhì)干擾[25]。

本研究建立了可以同時(shí)測(cè)定血漿中甲氨蝶呤、左乙拉西坦和拉莫三嗪的HPLC-MS/MS 法，該方法可以用于治療藥物監(jiān)測(cè)，也適用于藥物相互作用及藥動(dòng)學(xué)研究，為藥物的合理使用提供參考依據(jù)。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。