王京京,李全福,張立廣,邵青龍

(保定市第二醫(yī)院肝膽外科,河北 保定 071000)

膽囊癌(Gallbladder cancer,GBC)是最常見的膽道癌癥,因其侵襲性行為和早期缺乏有效的篩查手段,導(dǎo)致多數(shù)患者在診斷時(shí)已處于晚期且預(yù)后較差[1-2]。盡管少數(shù)患者可以進(jìn)行根治性切除,但5年生存率仍然很低[3]。因此,尋找有效治療藥物有助于改善GBC患者預(yù)后。紫檀芪(Pterostilbene,PTS)是白藜蘆醇的衍生物,從花生、葡萄、桑葚、蔓越莓、藍(lán)莓中提取,具有抗炎、抗氧化和抗癌作用[4-5]。PTS可調(diào)控多種信號(hào)通路,抑制細(xì)胞增殖[6-8]。既往研究[9]表明,PTS可減弱GBC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,抑制GBC進(jìn)展,其作用機(jī)制仍需更深入研究。有研究[10]顯示,微小RNA(microRNA,miRNA)可調(diào)控腫瘤的發(fā)展。據(jù)報(bào)道[11],微小RNA-340-5p(microRNA-340-5p,miR-340-5p)在GBC中低表達(dá),促進(jìn)miR-340-5p表達(dá)可抑制GBC細(xì)胞增殖和侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。髓細(xì)胞白血病-1(Myeloid cell leukemia-1,MCL-1)是B淋巴細(xì)胞瘤-2(B cell lymphoblastoma-2,Bcl-2)蛋白家族的抗凋亡蛋白,其過表達(dá)與腫瘤分級(jí)、低存活率和化療耐藥性相關(guān)[12]。研究[13]發(fā)現(xiàn),在GBC中環(huán)狀RNA漿細(xì)胞瘤變體易位1通過miR-339-3p上調(diào)MCL-1表達(dá),促進(jìn)GBC生長(zhǎng)。推測(cè)PTS和miR-340-5p/MCL-1是治療GBC的潛在藥物或靶點(diǎn),然而PTS對(duì)GBC細(xì)胞遷移和侵襲的影響機(jī)制是否是通過調(diào)控miR-340-5p/MCL-1軸實(shí)現(xiàn)尚不可知。因此,本研究基于GBC細(xì)胞系GBC-SD,探討PTS對(duì)GBC細(xì)胞遷移和侵襲及miR-340-5p/MCL-1軸的影響,以期了解GBC的發(fā)展機(jī)制,為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與動(dòng)物 人GBC細(xì)胞系GBC-SD細(xì)胞(批號(hào):TP-3915K)購自上海通派生物科技公司。6周齡雄性無胸腺裸鼠(體重14～16 g,SPF級(jí))購自江蘇艾菱菲生物公司,生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(蘇)2022-0014,在無病原體實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng)。裸鼠實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 PTS(批號(hào):SP9570,原料藥,純度≥99.15%)購自陜西慈緣生物技術(shù)公司;空載質(zhì)粒、miR-340-5p小干擾RNA(siRNA)質(zhì)粒、MCL-1-野生型(WT)、MCL-1-突變型(MUT)、miR-340-5p模擬物(mimics)、miR-340-5p陰性對(duì)照(miR-340-5p-NC)質(zhì)粒均由上海吉瑪公司合成;DMEM培養(yǎng)基(批號(hào):JKR-D027)、Lipofectamine 3000試劑(批號(hào):JKR-D016)、CCK-8試劑盒(批號(hào):JKR-A011)、TRIzol試劑(批號(hào):JKR-D009)、辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(批號(hào):JKR-K013)購自武漢金開瑞生物公司;膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)雙染試劑盒(批號(hào):L10164)、Matrigel基質(zhì)膠(批號(hào):L19134)、PCR試劑盒(批號(hào):L21573)、RIPA裂解液(批號(hào):K19242)、MCL-1(批號(hào):K25116)、Ki67(批號(hào):K29157)、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1,批號(hào):K31548)、Bcl-2(批號(hào):K36229)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax,批號(hào):K70191)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved caspase-3,批號(hào):K71264)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH,批號(hào):K10135)一抗購自蘇州亞凡生物公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PTS濃度篩選:GBC-SD細(xì)胞置于10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。待GBC-SD細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,接種于96孔板中,加入不同濃度PTS(0、5、10、20、40、80 μmol/L)孵育48 h后,加入CCK-8溶液15 μl,4 h后酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度(OD),計(jì)算細(xì)胞存活率(各濃度PTS的OD450與0 μmol/L的OD450的比值×100%)。各濃度PTS均設(shè)8個(gè)平行樣。計(jì)算PTS對(duì)GBC-SD細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50),將接近IC50的PTS用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞分組與干預(yù):在6孔板中接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GBC-SD細(xì)胞(2×105個(gè)/孔),將細(xì)胞分為對(duì)照組(DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)GBC-SD細(xì)胞)、PTS組(加入80 μmol/L的PTS培養(yǎng)GBC-SD細(xì)胞)、PTS+空載質(zhì)粒組(加入80 μmol/L的PTS培養(yǎng)GBC-SD細(xì)胞,并轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒)、PTS+miR-340-5p沉默組(加入80 μmol/L的PTS培養(yǎng)GBC-SD細(xì)胞,并轉(zhuǎn)染miR-340-5p siRNA質(zhì)粒)。使用Lipofectamine 3000試劑轉(zhuǎn)染對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒。各組均設(shè)8個(gè)平行樣。

1.3.3 細(xì)胞增殖檢測(cè):將各組細(xì)胞置于96孔板中,培養(yǎng)48 h后加入15 μl的CCK-8溶液,4 h后酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450,計(jì)算細(xì)胞存活率(各干預(yù)組OD450與對(duì)照組OD450比值×100%)。

1.3.4 集落形成檢測(cè):用多聚甲醛固定在6孔板中培養(yǎng)2周的各組GBC-SD細(xì)胞,然后0.1%結(jié)晶紫染色,顯微鏡觀察計(jì)數(shù)集落形成數(shù)(>50個(gè)細(xì)胞的集落)。

1.3.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè):各組GBC-SD細(xì)胞進(jìn)行48 h的培養(yǎng),然后制備成細(xì)胞懸浮液。將懸浮液與10 μl的Annexin V-FITC和10 μl的PI在37 ℃下培養(yǎng)15 min,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.3.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn):收集各組細(xì)胞并接種在6孔板中,待細(xì)胞融合度≥80%,用微量移液器槍頭垂直劃線。PBS洗滌,在DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48 h,顯微鏡下測(cè)量劃痕距離并拍照,計(jì)算遷移率[(0 h劃痕距離-48 h劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%]。

1.3.7 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn):Transwell預(yù)先涂上Matrigel基質(zhì)膠,將細(xì)胞接種于Transwell小室上室,下室加完全培養(yǎng)基。48 h后將上室細(xì)胞去除,4%多聚甲醛固定下室侵襲細(xì)胞10 min,然后0.1%結(jié)晶紫染色5 min,顯微鏡下計(jì)數(shù)染色細(xì)胞數(shù)量(細(xì)胞侵襲數(shù))。

1.3.8 miR-340-5p和MCL-1 mRNA表達(dá)檢測(cè):使用TRIzol試劑從培養(yǎng)48 h的各組細(xì)胞中提取RNA,并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)反應(yīng)。反應(yīng)條件:在93 ℃變性12 min,然后循環(huán)34次(93 ℃ 16 s,61 ℃ 21 s,79 ℃ 27 s),67 ℃延伸4 min。擴(kuò)增體系(總共30 μl)根據(jù)PCR試劑盒進(jìn)行分配。引物由北京陽科華科技公司合成,序列見表1。以2-ΔΔCt法計(jì)算miR-340-5p(內(nèi)參U6)和MCL-1 mRNA(內(nèi)參GAPDH)的相對(duì)表達(dá)量。

表1 各基因引物序列

1.3.9 MCL-1及增殖凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè):將培養(yǎng)48 h的各組細(xì)胞用預(yù)冷的RIPA進(jìn)行裂解,蛋白濃度采用BCA法定量后,進(jìn)行電泳分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)膜,室溫用5%脫脂牛奶封閉1 h,將膜與MCL-1(1∶1160)、Ki67(1∶1090)、Cyclin D1(1∶1640)、Bcl-2(1∶950)、Bax(1∶950)、Cleaved caspase-3(1∶1400)、GAPDH(1∶1550)一抗孵育,4 ℃過夜,然后加二抗(1∶3100)一起孵育2.5 h,使用ECL檢測(cè)試劑盒可視化,根據(jù)條帶灰度值計(jì)算蛋白表達(dá)量。

1.3.10 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn):將MCL-1-WT、MCL-1-MUT連接到pmir-GLO雙熒光素酶載體,將構(gòu)建的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒MCL-1-WT、MCL-1-MUT在GBC-SD細(xì)胞中與miR-340-5p-NC或miR-340-5p mimics共轉(zhuǎn)染48 h,熒光素酶活性采用雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定。

1.3.11 體內(nèi)腫瘤移植實(shí)驗(yàn):使用6周齡雄性無胸腺裸鼠進(jìn)行體內(nèi)研究。取100 μl含有GBC-SD細(xì)胞(1×104個(gè))的細(xì)胞液經(jīng)皮下注射所有裸鼠體內(nèi)。7 d后,將裸鼠分為模型組和PTS組,每組10只。模型組裸鼠灌胃40 mg/kg 0.9%氯化鈉溶液,PTS組裸鼠灌胃40 mg/kg的PTS[14],每天1次,連續(xù)4周。分別于造模成功后(GBC-SD細(xì)胞液100 μl皮下注射裸鼠體內(nèi)7 d后)、給藥4周后測(cè)量裸鼠腫瘤體積。給藥4周后處死裸鼠分離腫瘤并測(cè)量腫瘤重量。取腫瘤組織將其勻漿化,參照上述RT-qPCR和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤組織中miR-340-5p、MCL-1 mRNA和蛋白表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 PTS濃度篩選結(jié)果 0、5、10、20、40、80 μmol/L PTS濃度下的GBC-SD細(xì)胞存活率依次為(100.00±0.00)%、(91.37±5.12)%、(79.51±8.09)%、(70.23±6.18)%、(61.49±7.38)%、(50.78±6.77)%。隨著PTS濃度的升高,GBC-SD細(xì)胞存活率逐漸降低(均P<0.05)。經(jīng)計(jì)算,IC50為74.31,因此本研究選擇80 μmol/L的PTS進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 各組GBC-SD細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力比較 見表2。與對(duì)照組比較,PTS組細(xì)胞存活率、集落形成數(shù)、遷移率、細(xì)胞侵襲數(shù)降低,細(xì)胞凋亡率升高(均P<0.05);與PTS組和PTS+空載質(zhì)粒組比較,PTS+miR-340-5p沉默組細(xì)胞存活率、集落形成數(shù)、遷移率、細(xì)胞侵襲數(shù)升高,細(xì)胞凋亡率降低(均P<0.05)。

表2 各組GBC-SD細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力比較

2.3 各組GBC-SD細(xì)胞miR-340-5p、MCL-1 mRNA和蛋白及增殖凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 見表3。與對(duì)照組比較,PTS組miR-340-5p、Bax、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)升高,MCL-1 mRNA和蛋白、Ki67、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)降低(均P<0.05)。與PTS組和PTS+空載質(zhì)粒組比較,PTS+miR-340-5p沉默組miR-340-5p、Bax、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)降低,MCL-1 mRNA和蛋白、Ki67、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)升高(均P<0.05)。

表3 各組GBC-SD細(xì)胞miR-340-5p、MCL-1 mRNA和蛋白及增殖凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

2.4 miR-340-5p與MCL-1的靶向關(guān)系 見表4。Star Base數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)顯示,miR-340-5p與MCL-1存在結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,miR-340-5p mimics和MCL-1-WT共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性較miR-340-5p-NC和MCL-1-WT共轉(zhuǎn)染降低(P<0.05)。

表4 熒光素酶活性比較

2.5 PTS干預(yù)后對(duì)裸鼠腫瘤生長(zhǎng)及miR-340-5p/MCL-1軸的影響 見表5。模型組和PTS組造模成功后腫瘤體積比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較,PTS組給藥4周后腫瘤體積、給藥4周后腫瘤重量、MCL-1 mRNA和蛋白表達(dá)降低,miR-340-5p表達(dá)升高(均P<0.05)。

表5 PTS干預(yù)后對(duì)裸鼠腫瘤生長(zhǎng)及miR-340-5p/MCL-1軸的影響

3 討 論

PTS是白藜蘆醇的二甲基衍生物,是一種具有潛在化學(xué)預(yù)防活性的植物多酚化合物。PTS已被證明在多種癌癥如前列腺癌[15]、胃癌[16]等中具有抗癌的作用。研究[17]表明,PTS能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致S期阻滯,抑制細(xì)胞增殖、遷移和過度侵襲。此外,PTS可通過增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞活性,從而殺死前列腺癌細(xì)胞[18]。PTS在GBC中的抗癌作用已有報(bào)道[9],其潛在的機(jī)制還需進(jìn)一步探索。在本研究中,我們分析了PTS對(duì)體外GBC細(xì)胞的影響,結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,PTS組細(xì)胞存活率、集落形成數(shù)、遷移率、細(xì)胞侵襲數(shù)、Ki67、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)降低,細(xì)胞凋亡率、Bax、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)升高,與HOJO等[16]和WAWSZCZYK等[17]研究結(jié)果一致,表明PTS可抑制GBC-SD細(xì)胞增殖、遷移、侵襲并促進(jìn)GBC-SD細(xì)胞凋亡,提示PTS能抑制GBC-SD細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為,進(jìn)而減弱其惡性進(jìn)展。

miRNA是基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,在癌癥中發(fā)揮重要功能[19-20]。miR-340-5p作為一種miRNA,在多種腫瘤中下調(diào)并可作為腫瘤抑制基因[21]。在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中,miR-340-5p表達(dá)明顯下調(diào),過表達(dá)miR-340-5p可提高結(jié)直腸癌患者總生存期,并抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[22]。在GBC中,下調(diào)miR-340-5p使得GBC患者的存活率降低,促進(jìn)GBC細(xì)胞生長(zhǎng)[11]。本研究結(jié)果顯示,與PTS組比較,PTS+miR-340-5p沉默組細(xì)胞存活率、集落形成數(shù)、遷移率、細(xì)胞侵襲數(shù)、Ki67、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)升高,細(xì)胞凋亡率、Bax、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)降低,表明在PTS干預(yù)的基礎(chǔ)上沉默miR-340-5p可使PTS對(duì)GBC-SD細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲能力及增殖凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的作用效果減弱,PTS可能通過上調(diào)miR-340-5p表達(dá)影響GBC-SD細(xì)胞生物學(xué)行為。

MCL-1是腫瘤中高表達(dá)的抗凋亡蛋白,通過與Bcl-2家族的促凋亡成員Bax和Bcl-2相關(guān)K蛋白結(jié)合,阻斷線粒體外膜通透性、細(xì)胞色素C釋放和Caspase級(jí)聯(lián)激活,從而保護(hù)細(xì)胞免于凋亡。在癌癥細(xì)胞中,MCL-1過表達(dá)有助于致癌[23]。HSIEH等[24]研究顯示,下調(diào)MCL-1表達(dá)有利于促進(jìn)人前列腺癌細(xì)胞凋亡,抑制前列腺癌生長(zhǎng)。在乳腺癌中,高表達(dá)MCL-1與預(yù)后不良有關(guān),抑制MCL-1表達(dá)能抑制乳腺癌移植瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)[25]。本研究發(fā)現(xiàn),PTS干預(yù)后可升高GBC-SD細(xì)胞中miR-340-5p表達(dá),降低MCL-1 mRNA和蛋白表達(dá);與PTS單獨(dú)干預(yù)GBC-SD細(xì)胞比較,PTS和沉默miR-340-5p聯(lián)合干預(yù)會(huì)降低GBC-SD細(xì)胞中miR-340-5p表達(dá),升高M(jìn)CL-1 mRNA和蛋白表達(dá);且miR-340-5p和MCL-1存在靶向調(diào)控關(guān)系,MCL-1是miR-340-5p的下游靶點(diǎn)。這些都說明PTS可通過上調(diào)miR-340-5p表達(dá)進(jìn)而抑制MCL-1表達(dá)。體內(nèi)裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)顯示,PTS能抑制裸鼠腫瘤生長(zhǎng)和MCL-1 mRNA和蛋白表達(dá),促進(jìn)miR-340-5p表達(dá)。以上結(jié)果表明,PTS能通過促進(jìn)miR-340-5p表達(dá)進(jìn)而抑制MCL-1表達(dá),抑制GBC-SD細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,促進(jìn)GBC-SD細(xì)胞凋亡。

綜上所述,PTS可通過上調(diào)miR-340-5p表達(dá)下調(diào)MCL-1表達(dá),抑制GBC-SD細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,促進(jìn)GBC-SD細(xì)胞凋亡。本研究為GBC的新藥研發(fā)和靶向治療提供了理論前景。本研究不足之處在于涉及影響GBC細(xì)胞的生物學(xué)行為的基因較多,PTS是否可通過其他通路調(diào)控GBC惡性進(jìn)展有待進(jìn)一步研究。