易三鳳,屈銀宗,龔承先,趙艷潔,楊建美

(1.湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院消化內(nèi)科,湖北 武漢 430015;2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科,山東 青島 266003)

食管癌是全球高發(fā)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,發(fā)病率及病死率均較高,給人類健康帶來重大威脅[1-3]。深入研究新的分子治療靶點和潛在的診斷標志物對改善食管癌患者預(yù)后至關(guān)重要。環(huán)狀RNA(Circular RNA,circRNA)是一種閉環(huán)狀RNA,沒有蛋白質(zhì)編碼功能,呈現(xiàn)顯著的細胞特異性和組織特異性[4]。研究[5-6]表明,絕大多數(shù)癌癥均存在circRNA表達失調(diào),其表達水平與癌癥患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后以及復(fù)發(fā)有關(guān)。在食管癌中circRNA充當(dāng)腫瘤促進因子或腫瘤抑制因子,影響食管癌細胞的分化、脂肪代謝和鐵死亡等過程,是食管癌發(fā)生和進展的重要生物標志物[7]。探究circRNA與食管癌治療的潛在關(guān)系,可能有利于食管癌的臨床病理診斷和靶向治療。環(huán)狀RNA GRIN2B(Circular RNA GRIN2B,circ-GRIN2B)位于人基因組12p13.1區(qū)域,由12號外顯子首尾相接而成,在食管癌中的表達和活性鮮有報道。基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus,GEO)分析顯示circ-GRIN2B在食管癌組織中的表達明顯低于正常組織。研究證實,微小RNA(microRNA,miR)-135b在多種惡性腫瘤如卵巢癌、食管癌中表達上調(diào),發(fā)揮癌基因功能,沉默miR-135b表達能夠抑制腫瘤細胞的惡性生物學(xué)行為[8]。本研究探討circ-GRIN2B是否通過調(diào)控miR-135b影響食管癌細胞增殖和侵襲。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞與主要試劑 食管癌細胞株(Eca109、TE-13、KYSE30、OE33、EC9706)和正常食管上皮細胞株HET-1A購自美國ATCC公司?？蛰d對照質(zhì)粒、circ-GRIN2B過表達質(zhì)粒(批號:TSP12-13、TSP12-49)購自北京擎科生物科技有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、Lipofectamine 2000(批號:AM1660TS、AM826PE)購自美國賽默飛公司;總RNA提取試劑盒(批號:15596026)購自美國Invitrogen公司;胎牛血清(FBS)、蛋白定量試劑盒(批號:T8593E、T9300A)購自日本Takara公司;Transwell小室、雙熒光素酶檢測系統(tǒng)(批號:PICM0RG50、PICM0TO10)購自美國Merck Millipore公司;熒光素酶質(zhì)粒circ-GRIN2B-wt和circ-GRIN2B-mut及基質(zhì)膠(批號:84574、84575、66589)購自美國Proteintech公司;抗體周期蛋白依賴性激酶8(CDK8)、周期素C(Cyclin C)、β-微管蛋白(β-tubulin)和纖維結(jié)合蛋白(FN)、轉(zhuǎn)錄因子8(ZLF8)、叉頭盒蛋白C2(FOXC2)(批號:ab229192、ab85927、ab18207、ab2413、ab168527、ab308055)購自美國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:采用含13% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)Eca109、TE-13、KYSE30、OE33、EC9706 和HET-1A細胞。取對數(shù)期的EC9706細胞消化并接種在6孔板,培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。采用Lipofectamine 2000試劑分別轉(zhuǎn)染circ-GRIN2B過表達質(zhì)粒(circ-GRIN2B組)和空載對照質(zhì)粒(NC組)至EC9706細胞。轉(zhuǎn)染50 h后,驗證質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果。

1.2.2 RT-qPCR檢測circ-GRIN2B和miR-135b表達:使用總RNA提取試劑盒裂解并提取細胞總RNA,以500 ng RNA為模板合成cDNA。以U6和GAPDH為內(nèi)參,引物序列見表1。以2-ΔΔCt法分析circ-GRIN2B和miR-135b相對表達量。

表1 各基因引物序列

1.2.3 平板克隆實驗檢測EC9706細胞增殖:轉(zhuǎn)染20 h后,胰酶消化并重懸EC9706細胞,每組加入約900個細胞至6孔板,最終培養(yǎng)體積為3 ml,保證每孔底呈單細胞狀態(tài),培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)13 d。棄去剩余培養(yǎng)基,流水洗滌5次,用1%多聚甲醛固定50 min。加入0.3%結(jié)晶紫染色50 min后進行觀察、拍照并統(tǒng)計分析。

1.2.4 侵襲實驗檢測EC9706細胞侵襲:取200 μl基質(zhì)膠均勻鋪在Transwell室上部,培養(yǎng)箱內(nèi)靜置形成基質(zhì)屏障。轉(zhuǎn)染20 h后,胰酶消化并重懸EC9706細胞,在Transwell室上部每組加入3.5×105個EC9706細胞,培養(yǎng)基體積為200 μl。在Transwell室下部加750 μl含30% FBS的培養(yǎng)基,保證Transwell室上下均無氣泡,培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)25 h。流水洗滌5次,用1%多聚甲醛固定50 min后加入0.3%結(jié)晶紫染色50 min。在倒置光學(xué)顯微鏡下拍照并統(tǒng)計分析。

1.2.5 雙熒光素酶報告實驗檢測circ-GRIN2B與miR-135b靶向關(guān)系:將對數(shù)生長期的EC9706細胞鋪于6孔板,分別共轉(zhuǎn)染circ-GRIN2B-wt和miR-NC、circ-GRIN2B-mut和miR-NC、circ-GRIN2B-wt和miR-135b、circ-GRIN2B-mut和miR-135b,每組轉(zhuǎn)染終濃度為150 nmol/L。轉(zhuǎn)染45 h后,裂解每組細胞,分別檢測海腎熒光素酶活性和螢火蟲熒光素酶活性作為對照和校正參數(shù)。

1.2.6 Western blot檢測EC9706細胞增殖和侵襲相關(guān)蛋白:使用蛋白裂解液充分裂解EC9706細胞,高速離心30 min收集總蛋白后煮沸9 min。采用11% SDS-PAGE膠電泳分離,恒溫下轉(zhuǎn)移到聚偏二氯乙烯膜,10%質(zhì)量濃度脫脂牛奶封膜3 h。稀釋一抗,均勻覆蓋在聚偏二氯乙烯膜,室溫反應(yīng)6 h。將稀釋后的二抗均勻覆蓋在聚偏二氯乙烯膜,室溫孵育2.5 h。將ECL試劑盒的A液和B液混合,均勻覆蓋在膜蛋白面,在化學(xué)發(fā)光儀中曝光、顯影,以β-tubulin為內(nèi)參,對條帶進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同食管癌細胞株circ-GRIN2B表達比較 見圖1。RT-qPCR結(jié)果顯示,與HET-1A細胞比較,circ-GRIN2B在食管癌細胞株Eca109、TE-13、KYSE30、OE33、EC9706表達降低,且EC9706細胞中最低(均P<0.05)。故采用EC9706細胞進行后續(xù)實驗。

注:與HET-1A細胞比較,*P<0.05;與EC9706細胞比較,#P<0.05圖1 不同食管癌細胞株circ-GRIN2B表達比較

2.2 NC組與circ-GRIN2B組circ-GRIN2B表達量比較 在EC9706細胞中轉(zhuǎn)染circ-GRIN2B質(zhì)粒后,NC組與circ-GRIN2B組circ-GRIN2B表達量分別為1.01±0.38和10.56±2.02,circ-GRIN2B組circ-GRIN2B表達量高于NC組(t=4.657,P<0.01)。

2.3 circ-GRIN2B對EC9706細胞增殖的影響 見圖2。平板克隆實驗結(jié)果顯示,NC組和circ-GRIN2B組EC9706細胞集落數(shù)量分別為(149.80±11.68)個和(41.24±6.47)個,circ-GRIN2B組EC9706細胞集落數(shù)量少于NC組(t=8.127,P<0.01)。

圖2 兩組EC9706細胞平板克隆實驗結(jié)果(結(jié)晶紫染色,×100)

2.4 circ-GRIN2B對EC9706細胞侵襲的影響 見圖3。Transwell實驗顯示,NC組和circ-GRIN2B組EC9706細胞侵襲數(shù)目分別為(90.25±7.48)個和(41.43±8.48)個,circ-GRIN2B組EC9706細胞侵襲數(shù)目少于NC組(t=4.317,P<0.01)。

圖3 兩組EC9706細胞Transwell實驗結(jié)果(結(jié)晶紫染色,×100)

2.5 circ-GRIN2B對miR-135b的靶向調(diào)控作用 見圖4、5。circRNADb軟件預(yù)測顯示,circ-GRIN2B與miR-135b間存在結(jié)合序列。雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示,與miR-NC+circ-GRIN2B-wt組比較,miR-135b+circ-GRIN2B-wt組EC9706細胞熒光素酶活性下降(P<0.01)。

圖4 circ-GRIN2B與miR-135b結(jié)合位點

2.6 circ-GRIN2B對EC9706細胞miR-135b表達的影響 NC組與circ-GRIN2B組EC9706細胞miR-135b表達量分別為(7.07±0.90)和(1.01±0.18),circ-GRIN2B組miR-135b表達量低于NC組(t=6.596,P<0.01)。

2.7 circ-GRIN2B對EC9706細胞增殖和侵襲相關(guān)蛋白表達的影響 見圖6。Western blot結(jié)果顯示,circ-GRIN2B組EC9706細胞增殖相關(guān)蛋白(CDK8、Cyclin C)和侵襲相關(guān)蛋白(FN、ZLF8、FOXC2)表達水平較NC組降低(均P<0.05)。

注:與NC組比較,*P<0.05圖6 circ-GRIN2B對EC9706細胞增殖和侵襲相關(guān)蛋白表達的影響

3 討 論

食管癌屬于原發(fā)性消化道腫瘤,其發(fā)生與原癌基因的激活和抑癌基因的缺失相關(guān)[9-11]。circRNA廣泛參與腫瘤如喉癌、視網(wǎng)膜母細胞瘤、胸腺瘤等惡性演進過程,調(diào)控細胞周期、近端浸潤和遠端轉(zhuǎn)移,其突變或失活與細胞的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[12-14]。近年來研究[15-17]顯示,circRNA參與調(diào)控關(guān)于食管癌細胞的生長、侵襲、放療敏感性等,可能是食管癌的潛在診療靶點。例如,食管癌組織和細胞中circ_0006948表達上調(diào),circ_0006948表達減少可抑制食管癌細胞的生長、遷移、侵襲和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[17]。circ_141539在食管癌組織中顯著上調(diào),其高表達與患者TNM分期、分化程度和預(yù)后不良顯著相關(guān),具有較高的診斷價值;circ_141539過表達通過海綿化 miR-4469和激活細胞周期蛋白依賴性激酶3表達,促進食管癌細胞的增殖和侵襲[18]。研究[19]發(fā)現(xiàn),在食管癌組織和細胞株中檢測到circ-VIM表達顯著上調(diào),通過吸附miR-124在體外促進食管癌細胞的免疫逃逸和惡性轉(zhuǎn)化,在體內(nèi)促進異種移植物的生長和肺轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),circ-GRIN2B在食管癌Eca109、TE-13、KYSE30、OE33、EC9706細胞株中表達下調(diào),且EC9706細胞中最低,因此后續(xù)選用EC9706細胞進行實驗,進一步研究發(fā)現(xiàn)過表達circ-GRIN2B能夠顯著抑制EC9706細胞的增殖和侵襲,同時使EC9706細胞增殖相關(guān)蛋白(CDK8、Cyclin C)和侵襲相關(guān)蛋白(FN、ZLF8、FOXC2)表達水平下調(diào),表明circ-GRIN2B參與食管癌的發(fā)生和發(fā)展。

研究[20-22]表明,circRNA在細胞中扮演miRNA的海綿分子,通過調(diào)節(jié)miRNA含量影響細胞的形態(tài)學(xué)改變和生物學(xué)過程。例如,circ-PSMC3在吉非替尼耐藥食管鱗癌細胞中表達下調(diào),過表達circ-PSMC3通過靶向抑制miR-135b表達增加了食管鱗癌細胞對吉非替尼的敏感性,促進食管鱗癌細胞的凋亡[22]。本研究通過circRNADb軟件預(yù)測并經(jīng)雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實,circ-GRIN2B與miR-135b存在靶向調(diào)控關(guān)系。研究[23]顯示,miR-135b在細胞內(nèi)負責(zé)調(diào)節(jié)配體識別,影響多種信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo),與細胞免疫應(yīng)答有關(guān)。miR-135b可能在非小細胞肺癌、胃癌、胰腺癌等惡性腫瘤中表達升高,能夠顯著促進腫瘤細胞的生長、侵襲和化療耐藥性[24-25]。DI等[26]研究發(fā)現(xiàn),食管癌組織樣本中miR-135b表達升高,并且在Eca109、EC9706、KYSE150細胞中的表達高于正常食管上皮細胞,沉默miR-135b表達在體外能夠抑制Eca109和EC9706細胞的增殖、侵襲、遷移并促進細胞凋亡,在體內(nèi)能夠抑制異種移植腫塊的生長。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),circ-GRIN2B能負調(diào)控miR-135b的表達,表明了circ-GRIN2B抑制食管癌細胞的增殖、侵襲可能與調(diào)控miR-135b表達有關(guān)。

綜上所述,circ-GRIN2B在食管癌細胞中低表達,其可能通過下調(diào)miR-135b表達抑制食管癌細胞的增殖和侵襲。circ-GRIN2B未來有望成為一種新的食管癌治療靶點。本研究的不足之處在于,未能證明circ-GRIN2B在體內(nèi)對食管癌細胞增殖和侵襲的抑制作用,下一步研究將通過裸鼠荷瘤實驗來驗證circ-GRIN2B在體內(nèi)的抑癌作用。