劉子歌,袁 昂,王文鵬,陳德勝

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,廣西 南寧 530020;2.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院骨科,寧夏 銀川 750002)

無菌性松動是人工全關(guān)節(jié)置換術(shù)后常見的長期并發(fā)癥,也是手術(shù)翻修的主要原因之一[1]。研究[2-4]表明,無菌性松動主要源于人工關(guān)節(jié)接觸面之間的相互移動摩擦,導(dǎo)致產(chǎn)生微小的磨損顆粒,磨損顆粒會被界面之間的巨噬細胞所吞噬,同時被激活釋放大量的炎性介質(zhì),這些細胞因子能激發(fā)破骨細胞產(chǎn)生骨吸收,造成假體周圍骨組織的溶解,即種植體周圍骨溶解 (Peri-implant osteolysis,PIO),最終導(dǎo)致無菌性松動。研究[4]發(fā)現(xiàn),無菌性松動患者的免疫系統(tǒng)在這一過程中發(fā)揮了重要作用,人工關(guān)節(jié)產(chǎn)生的磨損顆粒可引發(fā)免疫系統(tǒng)的免疫反應(yīng),從而加劇炎癥。此過程包括T細胞和B細胞的激活,由此產(chǎn)生更多的炎癥因子,如腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素(Interleukin,IL)-1β、IL-6、前列腺素E2 (Prostaglandin E2,PGE2)等。免疫系統(tǒng)的參與不僅加劇了炎癥反應(yīng),還可能影響骨組織的局部免疫調(diào)節(jié),導(dǎo)致骨組織損傷,導(dǎo)致PIO和無菌性松動[5]。

姜黃素(Curcumin,Cur)是一種天然的生物活性化合物,主要存在于姜、肉桂、胡椒等食物中[6]。研究表明Cur具有多種益處,包括抗氧化、抗炎和抗腫瘤作用。Cur被認為可以通過干預(yù)細胞信號通路,降低炎癥反應(yīng)。有研究指出,Cur可以促進成骨細胞的發(fā)育和功能,同時抑制破骨細胞的生成。這意味著Cur可能有助于保護骨骼和延緩骨關(guān)節(jié)疾病的進展[7]。基于這些發(fā)現(xiàn),我們猜測Cur也可能對人工關(guān)節(jié)無菌性松動問題產(chǎn)生積極的影響。為了驗證這一假設(shè),本研究探索Cur對磨損顆粒誘導(dǎo)的破骨細胞生成及功能的影響,并通過檢測核因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)信號通路來揭示其潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞與主要試劑 小鼠巨噬細胞株RAW264.7購自中國科學(xué)院上海細胞庫。達爾伯克氏改良伊格爾氏培養(yǎng)基(DMEM)高糖培養(yǎng)基(貨號:21331046)、胎牛血清(貨號:10099141C)購自美國Gbico公司;商品純化鈦(Ti)顆粒(貨號:7440-32-6)購自美國Alfa Aesar公司;Cur (貨號:458-37-7)購自美國MCE公司;抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒(貨號:42010102)購自美國Sigma公司;TNF-α(貨號:bsk12002)、IL-1β(貨號:bsk12015)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9(貨號:bsk12013) ELISA試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)公司;細胞計數(shù)(CCK-8)試劑盒(貨號:KGA317)購自江蘇凱基生物技術(shù)公司;Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號:RR037Q)、Ultra SYBR One Step RNA PCR Kit熒光定量PCR試劑盒(貨號:RR064A)購自日本Takara生物公司;β-actin抗體(貨號:4967S)、p-p65(貨號:3033S)、磷酸化NF-κB抑制蛋白α(p-IκBα)(貨號:2859S)購自美國Cell Signaling公司;鬼筆環(huán)肽染色試劑(貨號:G1248-100T)購自武漢塞維爾公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鈦顆粒準(zhǔn)備:使用掃描電鏡檢查鈦顆粒的尺寸和直徑,以確保實驗所需的鈦顆粒符合要求。將鈦顆粒在180 ℃下焙烤6 h,然后浸泡在75%乙醇中,在水平搖床上搖動48 h。隨后離心處理,收集鈦顆粒并加入磷酸鹽緩沖液(PBS),進行高溫、高壓處理以再次確保無菌。使用PBS將高壓滅菌后的鈦顆粒重新懸浮。進行內(nèi)毒素檢測,確保內(nèi)毒素含量低于0.1 EU/ml,使Ti顆粒適用于細胞實驗。最終,實驗所使用的Ti顆粒濃度為0.1 mg/ml[8]。

1.2.2 CCK-8細胞增殖實驗:將RAW264.7細胞以5000個/孔的密度接種到96孔板中。加入不同濃度的Cur(0、1、5、10、15、20、30 μmol/L)進行干預(yù)。持續(xù)培養(yǎng)72 h后,加入10 μlCCK-8溶液,使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測量吸光度值(A)。細胞增殖率(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(未加藥)-A(空白)]×100%。以0 μmol/L濃度作為空白組,以確定RAW264.7細胞在沒有Cur干預(yù)情況下的基礎(chǔ)增殖率。后續(xù)選擇對RAW264.7細胞正常增殖沒有毒性效應(yīng)的Cur濃度作為干預(yù)濃度。

1.2.3 細胞培養(yǎng)及分組:將RAW264.7細胞置于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,在5% CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細胞分為空白組(完全培養(yǎng)基)、模型組(空白組+Ti 0.1 mg/ml)、低濃度Cur組(模型組+Cur 1 μmol/L)、中濃度Cur組(模型組+Cur 10 μmol/L)、高濃度Cur組(模型組+Cur 15 μmol/L)。

1.2.4 TRAP染色:將RAW264.7細胞以1×104個/孔接種于6孔板中,待細胞貼壁后按1.2.2方法分組處理,共培養(yǎng)5 d。然后用4%多聚甲醛固定細胞。加入TRAP染液在37 ℃生物培養(yǎng)箱中避光孵育1 h,堿性液沖洗干凈并晾干,在光鏡下觀察并計數(shù)。TRAP染色陽性的破骨細胞通常為體積大、多核且胞漿中通常含有紫紅色顆粒的細胞。

1.2.5 鬼筆環(huán)肽染色:固定前操作同1.2.4。0.1% Triton X-100穿膜5 min,加入鬼筆環(huán)肽染色液在37 ℃生物培養(yǎng)箱中避光孵育2 h。DAPI室溫染色細胞核 5 min。沖洗干凈后封片,在熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)。鬼筆環(huán)肽染色用于標(biāo)記和可視化破骨細胞內(nèi)的肌動蛋白纖維(F-actin)。F-actin是肌動蛋白的一種聚合物,在破骨細胞中具有關(guān)鍵的作用,陽染細胞通過熒光的強度與F-actin環(huán)的大小判斷相關(guān)破骨細胞的骨吸收功能的強弱。

1.2.6 ELISA實驗:將RAW264.7細胞以5×103個/孔接種于96孔板中,5 d后收集細胞培養(yǎng)上清,以160 r/min離心以去除Ti顆粒和細胞。按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β、MMP-9蛋白含量。

1.2.7 Western blot實驗:各組細胞培養(yǎng)5 d后提取蛋白,使用BCA蛋白定量試劑進行蛋白定量。配置12%分離膠溶液,每孔添加50 μg蛋白樣本。使用SDS-PAGE電泳技術(shù)進行蛋白分離,然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC膜)上。NC膜上的蛋白質(zhì)用5%牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h。將p-p65(1∶1000稀釋)和p-IκBα(1∶1500稀釋)的一抗進行冷藏過夜處理。將二抗(1∶10000稀釋)在室溫下孵育2 h。采用Image J軟件對圖像進行分析。

1.2.8 PCR實驗:各組細胞培養(yǎng)5 d后,按照TRIzol試劑說明書提取總RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,放入反轉(zhuǎn)錄儀中進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),檢測TRAP、TNF-α、活化 T 細胞核因子 1 (NFATc1)、IL-1β mRNA。以β-actin為內(nèi)參,引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度Cur對小鼠RAW264.7巨噬細胞增殖活性的影響 見圖1。CCK-8結(jié)果顯示,Cur濃度小于15 μmol/L對RAW264.7巨噬細胞增殖活性的影響與空白組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(均P>0.05),20、30 μmol/L Cur干預(yù)下RAW264.7細胞增殖率顯著性下降(均P<0.05)。因此,采用不高于15 μmol/L Cur進行后續(xù)實驗。

注:與空白組(0 μmol/L)比較,*P<0.05圖1 不同濃度Cur對RAW264.7巨噬細胞增殖活性的影響

2.2 不同濃度Cur對小鼠RAW264.7細胞分化的破骨細胞數(shù)目的影響 見圖2。TRAP染色結(jié)果顯示,模型組可觀察到許多體積較大、酒紅色、內(nèi)含多個細胞核的破骨細胞。給予不同濃度Cur干預(yù)后,染色呈陽性的破骨細胞數(shù)目隨著藥物濃度的增加而減少。進一步在顯微鏡下計數(shù)TRAP陽性細胞,空白組未檢出,模型組成熟破骨細胞數(shù)量為(145.31±7.87)個,低、中、高濃度Cur組TRAP陽性細胞數(shù)量分別為(139.76±5.63) 個、(87.63±4.12)個和(45.51±3.65)個。中、高濃度Cur組TRAP陽性細胞數(shù)量低于模型組(均P<0.05) 。

圖2 不同濃度Cur干預(yù)5 d后各組破骨細胞TRAP染色結(jié)果(×200)

2.3 不同濃度Cur對破骨細胞環(huán)形成的抑制效應(yīng) 見圖3。在模型組中觀察到了少量較大且呈綠色的F-actin環(huán)包圍著多核細胞,而細胞核則被DAPI染成藍色。此外,在細胞膜上觀察到一些偽足。在低、中濃度Cur組中,肌動蛋白骨架的環(huán)相對于模型組有所減少,且細胞核數(shù)量減少。而在高濃度Cur組中,多核細胞數(shù)量明顯減少。

圖3 不同濃度Cur對破骨細胞環(huán)形成的抑制效應(yīng)(鬼筆環(huán)肽染色,×200)

2.4 不同濃度Cur對破骨細胞TNF-α、IL-1β和MMP-9表達的影響 見圖4。與模型組比較,不同濃度Cur組TNF-α、IL-1β和MMP-9表達降低(均P<0.05)。

注:與模型組比較,*P<0.05圖4 不同濃度Cur對破骨細胞RAW264.7細胞TNF-α、IL-1β和MMP-9表達的影響

2.5 不同濃度Cur對破骨細胞p-IκBα和p-p65蛋白表達的影響 見圖5。與模型組比較,低濃度Cur組、中濃度Cur組、高濃度Cur組p-IκBα和p-p65蛋白表達降低(均P<0.05)。

注:與模型組比較,*P<0.05圖5 不同濃度Cur對p-IκBα和p-p65蛋白表達的影響

2.6 不同濃度Cur對破骨細胞TRAP、TNF-α、IL-1β和NFATc1 mRNA表達的影響 見圖6。與模型組比較,不同濃度Cur組TRAP、TNF-α、IL-1β和NFATc1 mRNA表達降低(均P<0.05) 。

注:與模型組比較,*P<0.05圖6 不同濃度Cur對破骨細胞TRAP、TNF-α、IL-1β和NFATc1 mRNA表達的影響

3 討 論

研究[9]表明,骨溶解與過度活躍的破骨細胞和骨吸收密切相關(guān)。目前的研究發(fā)現(xiàn),磨損顆粒的摩擦通常引發(fā)炎癥反應(yīng),破壞了機體內(nèi)部骨吸收和骨形成之間的平衡,這是PIO的典型特征。雖然多種細胞類型參與這一病理過程,但破骨細胞是引起骨丟失和導(dǎo)致假體松動的主要骨降解細胞。一般來說,磨損顆粒主要由假體表面互相摩擦產(chǎn)生,在人工關(guān)節(jié)中這些磨損顆粒通常是金屬碎片或超高分子量聚乙烯顆粒。這些顆粒會引起免疫細胞(包括巨噬細胞和T淋巴細胞)聚集到骨-種植體界面,觸發(fā)一系列促炎細胞因子的釋放,從而加速周圍炎性微環(huán)境的形成[10]。在這些炎癥介質(zhì)中,巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和NF-κB受體活化因子配體(RANKL)在激活破骨細胞過程中起著關(guān)鍵作用。M-CSF促進單核/巨噬細胞生長和分化成破骨細胞前體細胞。一旦RANKL與破骨細胞前體細胞表面RANKL結(jié)合,就會激活下游信號傳導(dǎo)通路,主要包括NF-κB信號通路,導(dǎo)致成熟的破骨細胞分化和隨后的骨吸收活動[11]。因此,干預(yù)破骨細胞的主要信號通路有望成為治療PIO的有效策略。

本研究使用的RAW264.7細胞是一種常用于炎癥和免疫相關(guān)研究的小鼠巨噬細胞系,通常用于研究巨噬細胞的生物學(xué)特性、免疫反應(yīng)以及與疾病相關(guān)的機制。這些細胞可在體外模擬炎癥反應(yīng),特別是與炎癥相關(guān)的細胞因子產(chǎn)生和巨噬細胞活性。在骨科研究中通常使用RAW264.7細胞來誘導(dǎo)它們分化為破骨細胞,然后研究破骨細胞的分化、功能以及它們與骨骼健康和疾病之間的關(guān)系。這些研究有助于深入了解骨骼代謝、骨質(zhì)疏松癥、骨折愈合等方面的生物學(xué)過程,從而為骨科研究和治療提供了重要的信息。Cur是一種存在于多種植物中的天然化合物。近期研究表明Cur具有多種有益的潛在作用,包括心血管健康和癌癥預(yù)防。盡管如此,這些保護機制尚未得到詳盡的探討。有研究[12-13]表明,其中一個可能的保護機制是通過下調(diào)炎癥反應(yīng)。這種下調(diào)包括抑制促炎介質(zhì)的合成和釋放,影響二十烷類化合物的產(chǎn)生從而抑制某些免疫細胞的激活,也可通過Cur對NF-κB或激活蛋白1等轉(zhuǎn)錄因子的抑制作用減少促炎介質(zhì)的合成[14]。這一機制可能有助于解釋Cur在多種疾病中的潛在益處,但仍需要進一步的研究來闡明其細節(jié)和潛在應(yīng)用。

本研究采用磨損顆粒誘導(dǎo)的體外破骨細胞形成模型,以驗證Cur在PIO中的作用。為了排除Cur通過對RAW264.7細胞產(chǎn)生毒性作用來影響破骨細胞形成的可能性,我們首先對RAW264.7細胞進行了不同濃度Cur的處理,持續(xù)72 h,以評估Cur的細胞毒性水平。實驗結(jié)果表明,小于等于15 μmol/L Cur對RAW264.7細胞的增殖沒有影響,因此我們選擇了不高于15 μmol/L Cur作為后續(xù)實驗的干預(yù)濃度。

骨吸收標(biāo)志酶TRAP通常被用來鑒定成熟的破骨細胞,具有3個或以上細胞核并且TRAP染色呈陽性(酒紅色)的細胞被識別為破骨細胞[15]。本研究通過TRAP染色實驗證實了不同濃度Cur對RAW264.7細胞向破骨細胞的分化產(chǎn)生了影響。隨著Cur濃度的增加,染色呈陽性的破骨細胞數(shù)量減少,這表明Cur可以抑制了體外破骨細胞的成熟。此外,F-actin環(huán)的形成被認為是破骨細胞發(fā)揮骨吸收功能的前提條件[16]。因此,本研究進行了鬼筆環(huán)肽染色實驗,以評估Cur對F-actin環(huán)形成的影響,結(jié)果與TRAP染色結(jié)果一致,模型組顯示出大且清晰的F-actin環(huán)。然而,在Cur干預(yù)后,F-actin環(huán)的大小隨著Cur濃度的增加而減小。綜合TRAP的結(jié)果,我們認為Cur在體外能夠抑制破骨細胞的功能和成熟度,并且這種抑制與Cur濃度呈正相關(guān)。

炎性骨溶解所誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)主要是通過磨損顆粒自身刺激巨噬細胞、成纖維細胞、成骨細胞及T淋巴細胞等分泌大量的TNF-α、IL-1β和IL-6炎性因子引起[17]。本研究用ELISA實驗檢測了模型中第5天上清培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β和MMP-9的表達量,顯示Cur能夠顯著抑制上述炎癥因子的表達,進一步證實Cur具有良好的抗炎效果。以前的研究已經(jīng)證明活化NFATc1和TRAP,對破骨細胞的形成和激活至關(guān)重要[18]。NFATc1是RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞分化的主要調(diào)節(jié)劑,并且通過上調(diào)負責(zé)破骨細胞黏附、遷移、酸化以及無機和有機骨基質(zhì)降解的各種基因。RANKL與RANK的結(jié)合導(dǎo)致腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)的募集,并導(dǎo)致下游分子如NF-κB和c-Jun的活化。NFATc2和NF-κB的協(xié)同作用激活了NFATc1,c-Jun信號與核因子相關(guān)的T細胞(NFAT)協(xié)同作用對RANKL調(diào)控的破骨細胞分化起到重要作用[19]。NFATc1轉(zhuǎn)錄因子常以高度磷酸化形式存在于細胞質(zhì)中,當(dāng)受到Ca2+刺激后,去磷酸化的NFATc1可以導(dǎo)致一系列破骨細胞特異性基因如MMP-9、TRAP、組織蛋白酶 K等的表達[20-23]。本研究PCR結(jié)果表明,Cur可顯著降低 NFATc1、TRAP mRNA的表達,表明Cur不僅可以影響 NFATc1 的表達,也可以影響其下游因子的表達。IκBα作為IκB家族中最重要的成員之一,調(diào)控NF-κB細胞通路中關(guān)于機體免疫與炎癥的途徑,其與p65/p50二聚體結(jié)合后活性將受到抑制[24-26]。本研究最后檢測了Cur處理后IκBα和p65磷酸化蛋白的表達,顯示Cur可能通過影響IκBα和p65磷酸化抑制了Ti顆粒誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7巨噬細胞中NF-κB通路的活化。

綜上所述,磨損顆?？赡芡ㄟ^NF-κB的激活參與PIO和人工關(guān)節(jié)無菌性松動。Cur對體外磨損顆粒誘導(dǎo)的破骨細胞生成和破骨細胞功能有抑制作用,其抑制作用的機制可能是抑制NF-κB信號通路。因此,Cur可能是治療假體磨損顆粒引起的骨溶解的一種潛在治療藥物。