米婧璇,張飛燕,孟祥荷,王雅娜,王一凡,劉洪偉,趙山山,張麗萍

(1.河北工程大學,河北 邯鄲 056000;2.河北省科學院生物研究所,河北 石家莊 050081; 3.河北省人民醫(yī)院,河北 石家莊 050057)

0 引言

伊枯草菌素是芽孢桿菌產(chǎn)生的一種脂肽類化合物,具有廣譜的抗真菌活性[1],研究發(fā)現(xiàn)伊枯草菌素對西瓜枯萎病菌(Fssartmoxysporum)、草莓腐敗菌鐮刀霉(Fusariumfujikuroi)、玉米葉斑病原菌(Southcornleafblight)等多種病原真菌具有抑制作用[1-3]。

梨黑斑病是梨的三大病害之一,由梨鏈格孢菌(AlternariaNees)侵染引起[4],受感染的果實發(fā)生嚴重的腐爛變質(zhì),造成巨大的經(jīng)濟損失。目前防治該病以化學農(nóng)藥為主,長期大量使用易造成果品農(nóng)藥殘留、環(huán)境水體污染等問題,嚴重危害人體健康。生物制劑具有安全、高效、環(huán)境友好等特性,研發(fā)新型生物農(nóng)藥,是實現(xiàn)國家綠色發(fā)展戰(zhàn)略、農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重大需求。

本項目組前期研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌ZLP-101(Bacillus velezensis ZLP-101)所產(chǎn)伊枯草菌素對多種植物病原真菌有較強的抑制作用,本文在探討伊枯草菌素對梨鏈格孢菌抑菌穩(wěn)定性的基礎上,研究其對采后雪梨貯存品質(zhì)的影響,為其進一步開發(fā)梨果保鮮劑及新型生物農(nóng)藥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及來源

伊枯草菌素由河北省科學院生物研究所微生物研究室分離純化自貝萊斯芽孢桿菌ZLP-101,梨鏈格孢菌由河北省科學院生物研究所微生物研究室保存,雪梨采摘于石家莊趙縣雪梨種植基地。

培養(yǎng)基:PDA固體培養(yǎng)基。

1.2 包埋法制備含菌平板

將梨鏈格孢霉菌在PDA培養(yǎng)基上進行培養(yǎng),用無菌水沖洗下菌落上的分生孢子,將孢子懸浮液濃度調(diào)整為1×106cfu/mL,參考曾維才[5]的方法,制備含菌平板備用。

1.3 伊枯草菌素的抑菌活性及穩(wěn)定性分析

1.3.1 伊枯草菌素抑菌活性測定

采用平板對峙法測定伊枯草菌素抑菌活性,在1.2制備好的含菌平板上打孔,將伊枯草菌素稀釋成濃度為1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL、7 mg/mL、8 mg/mL的溶液,分別注入孔內(nèi),48 h后測量抑菌圈直徑,每組設3個平行。

1.3.2 pH值對伊枯草菌素抑菌活性的影響

量取濃度為2 mg/mL伊枯草菌素溶液1 mL,用1 mol/ L的HCl 溶液和1 mol/ L的NaOH溶液分別調(diào)節(jié)pH值分別至 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0,處理1 h后將pH調(diào)至7.0,測定其抑菌活性。

1.3.3 溫度對伊枯草菌素抑菌活性的影響

量取濃度為2 mg/mL伊枯草菌素溶液1 mL,分別在20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃下水浴30 min、60 min后晾至室溫,測定其抑菌活性。

1.3.4 反復凍融對伊枯草菌素抑菌活性的影響

量取濃度為2 mg/mL伊枯草菌素溶液1 mL,在-20 ℃和-80 ℃條件下反復凍融2、4、6、8、10次,隨后放至室溫,測定其抑菌活性。

1.3.5 金屬鹽離子對伊枯草菌素抑菌活性的影響

量取濃度為2 mg/mL伊枯草菌素溶液1 mL,分別添加1 mL濃度為1 mg/mL的MnSO4、K2SO4、CuSO4、MgSO4、Na2SO4、Fe2(SO4)3,常溫條件下處理1 h,測定其抑菌活性。

1.3.6 紫外線照射對伊枯草菌素抑菌活性的影響

量取濃度為2 mg/mL伊枯草菌素溶液1 mL,于30 W紫外燈下,分別照射2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h,測定其抑菌活性。

1.3.7 貯藏時間對伊枯草菌素抑菌活性的影響

量取濃度為2 mg/mL伊枯草菌素溶液1 mL,在室溫條件下保存7 d、14 d、21 d、28 d,測定其抑菌活性。

1.4 伊枯草菌素溶液對雪梨保鮮效果研究

挑選無機械損傷、成熟度基本一致的新鮮雪梨用蒸餾水沖洗干凈,在室溫下風干1 h,隨機分為4組,每組5個。對照組為空白處理;處理組1參考祖雪[6]的離體接種試驗,用接種針對雪梨表面輕刺造成3個微刺傷口,在傷口上接種5 μL梨鏈格菌孢子懸浮液;處理組2置于2 mg/mL的伊枯草菌素溶液中浸泡30 min;處理組3接種梨鏈格孢菌24 h后置于2 mg/mL的伊枯草菌素溶液中浸泡30 min。均在室溫下風干,裝入保鮮袋,在溫度為28 ℃,相對濕度約90%條件下進行貯藏。于第0、7、14、28 d進行發(fā)病率及品質(zhì)指標的測定。方法如下:

發(fā)病率:發(fā)病率=(發(fā)病病斑數(shù)/總病斑數(shù))×100%;

失重率:失重率=[(初始重量-貯藏結束重量)/初始重量]×100% ;

硬度:采用GY-4型數(shù)顯水果硬度計[7]測定;

可滴定酸:參考李涵等[8]的方法進行測定;

還原糖:采用3,5-二硝基水楊酸法[9]測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20軟件進行分析,采用t檢驗進行差異顯著性分析,當P<0.05差異達統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 伊枯草菌素的抑菌穩(wěn)定性分析

2.1.1 伊枯草菌素抑菌活性測定

實驗結果如圖1所示,隨著伊枯草菌素溶液濃度增加,抑菌效果逐漸增強;濃度為2 mg/mL時,抑菌圈直徑為14.22 mm;濃度為4 mg/mL時,抑菌圈直徑為16.18 mm;濃度大于4 mg/mL時抑菌圈直徑不再增大。綜合考慮伊枯草菌素的抑菌效果與使用成本,采用2 mg/mL作為后續(xù)實驗濃度。

圖1 伊枯草菌素抑菌能力測定結果圖

2.1.2 pH值對伊枯草菌素抑菌活性的影響

實驗結果如圖2所示,在pH 4～7時,隨著pH值增大伊枯草菌素抑菌活性逐漸增加;在pH 7～10時,抑菌活性與對照組相比差異不顯著;pH大于10后抑菌活性逐漸降低,可見伊枯草菌素在pH 7～10時性能穩(wěn)定。

圖2 pH值對伊枯草菌素抑菌效果的影響

2.1.3 溫度對伊枯草菌素抑菌活性的影響

由圖3可知,處理溫度為40 ℃時,伊枯草菌素的抑菌活性較對照組無明顯變化,之后隨著處理溫度的升高抑菌活性逐漸降低,60 ℃時處理30 min和60 min抑菌活性分別降低為對照組的72.64%和70.32%,表明伊枯草菌素在40 ℃以下性能穩(wěn)定。

圖3 溫度對伊枯草菌素抑菌效果的影響

2.1.4 反復凍融對伊枯草菌素抑菌活性的影響

由圖4可知,與對照組相比,在-20 ℃和-80 ℃條件下凍融次數(shù)低于6次時抑菌圈直徑差異不顯著,凍融10次時抑菌活性分別降低為對照組的85.86%和85.16%,表明伊枯草菌素具有反復凍融穩(wěn)定性。

圖4 反復凍融對伊枯草菌素抑菌效果的影響

2.1.5 金屬離子對伊枯草菌素抑菌活性的影響

實驗結果如圖5所示,添加1 mg/mL的 Na+、Fe3+可以顯著提高伊枯草菌素的抑菌活性,較對照組分別提高了14.77%和17.93%;添加1 mg/mL 的K+、Cu2+、Mg2+顯著降低其抑菌活性,分別為對照組的77.21%、77.57%和83.54%,添加Mn+對伊枯草菌素的抑菌活性影響不顯著。

圖5 金屬離子對伊枯草菌素抑菌效果的影響

2.1.6 紫外線照射對伊枯草菌素抑菌活性的影響

實驗結果如圖6所示,紫外線照射6 h內(nèi)抑菌圈直徑差異不顯著,之后隨著照射時間的延長活性逐漸下降,8 h抑菌活性降低為對照組的80.87%,可見紫外線照射6 h內(nèi)伊枯草菌素抑菌性能穩(wěn)定。

圖6 紫外線照射對伊枯草菌素抑菌效果的影響

2.1.7 貯存時間對伊枯草菌素抑菌活性的影響

實驗結果如圖7所示,與對照組相比,常溫貯存14 d內(nèi)伊枯草菌素抑菌活性無顯著差異,貯存28 d時抑菌活性為對照組的91.35%,表明伊枯草菌素具有室溫貯存穩(wěn)定性。

圖7 貯存時間對伊枯草菌素抑菌效果的影響

2.2 伊枯草菌素對雪梨保鮮效果的影響

2.2.1 對梨黑斑病的防病效果

由表1室內(nèi)離體防病實驗結果可知,只接種病原菌的處理、貯存28 d后發(fā)病率達為100%,處理3發(fā)病率為40%,差異顯著,表明伊枯草菌素對離體接種的梨鏈格孢菌有顯著的抑制作用。

表1 不同處理的雪梨發(fā)病率

2.2.2 失重率

水果貯存過程中,呼吸強度逐漸增強,會加速果實水分流失。不同處理對雪梨失重率變化的影響結果如圖8所示,隨著儲存時間延長,各組樣品失重率逐漸增加,其中只接種病原菌的處理1失重率最大,28 d時處理2是對照組的46.3%,可見伊枯草菌素處理能顯著降低采后梨果的失重率。

圖8 失重率變化

2.2.3 硬度變化

硬度能夠直接反映出果品的成熟度和腐爛程度,是判斷果蔬品質(zhì)較直觀的依據(jù)之一,不同處理對雪梨硬度的影響結果如圖9所示,隨著貯存時間延長,各處理組樣品硬度逐漸降低,其中處理1硬度降低最多;28 d時處理2硬度較對照組高18.7%;可見伊枯草菌素處理能有效保持采后梨果的硬度。

圖9 硬度變化

2.2.4 可滴定酸含量變化

可滴定酸是果實品質(zhì)的重要性狀之一,影響果實風味,不同處理對雪梨可滴定酸含量的影響結果如圖10所示,隨著貯存時間的延長,各處理組樣品可滴定酸含量逐漸降低,處理1可滴定酸含量降低最多;28 d時處理2可滴定酸含量較對照組高14.3%,表明伊枯草菌素處理能較好的維持梨果中的可滴定酸含量從而保持其風味。

圖10 可滴定酸含量變化

2.2.5 還原糖含量變化

還原糖含量可直接反映果蔬的成熟度,是果蔬甜味的主要來源,不同處理對雪梨還原糖含量變化的影響結果如圖11所示,在整個貯存過程中,處理2還原糖含量較為穩(wěn)定。推測經(jīng)過伊枯草菌素處理能使梨果呼吸作用降低從而減少還原糖消耗。

圖11 還原糖含量變化

3 結論

伊枯草菌素對引起梨黑斑病的鏈格孢菌有較強的抑菌活性,在pH 7～10、溫度40 ℃以下、反復凍融6次、紫外線照射6 h及室溫貯存28 d的條件下可保持穩(wěn)定的抑菌活性,并且添加金屬離子Na+和Fe3+能夠增強其抑菌活性。采用伊枯草菌素溶液處理采后雪梨,在有效防止病原菌侵染的同時能較好地保持果實硬度,保留果實水分和營養(yǎng)成分,從而延長采后雪梨的保鮮時間。因此,伊枯草菌素具有替代化學保鮮劑的潛力,可作為新型生物保鮮劑進行深入研究。