徐 樂,劉 興,吳 琦,華召來,楊 菲,張軍峰

徐樂,張軍峰,南京中醫(yī)藥大學醫(yī)學院 江蘇省南京市 210023

劉興,楊菲,南京師范大學生命科學學院 江蘇省南京市 210023

吳琦,中國科學院微生物研究所 北京市 100101

華召來,揚中市人民醫(yī)院腫瘤防治研究所 江蘇省鎮(zhèn)江市 212299

0 引言

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)的發(fā)現(xiàn)結束了胃內無菌論,非培養(yǎng)依賴的分子生物學檢測技術發(fā)現(xiàn)胃內存在大量非H.pylori細菌,如擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)等[1].研究證實,包括H.pylori在內的螺桿菌屬是胃內優(yōu)勢菌屬(相對豐度可大于50%),不僅參與胃黏膜病變的發(fā)生發(fā)展,而且深刻影響胃菌群的結構與共生關系[2].最新研究發(fā)現(xiàn),慢性萎縮性胃炎患者感染攜毒力因子H.pylori的比例顯著高于非萎縮性胃炎,且胃內菌群多樣性降低[3],在H.pylori陰性患者胃內也能檢測到螺桿菌屬細菌[4],提示非H.pylori螺桿菌屬細菌(non-Helicobacter pylori Helicobacters,NHPH)可能是胃黏膜病變的新病原體,其詳細機制尚不清楚.

最先發(fā)現(xiàn)的NHPH是從雪貂胃內分離出的H.mustelae,后又從貓、狗胃內分離得到H.felis,從赤狐胃內分離得H.labacensis、H.mehlei、H.vulpis[5].除定植于胃部,在某些動物的肝臟、腸道和膽囊也能發(fā)現(xiàn)螺桿菌屬的存在,如H.hepaticus和H.marmot.目前已鑒定出的NHPH有47種,根據(jù)寄居部位分為胃內螺桿菌(GastricHelicobacter,GH)和肝腸螺桿菌(enterohepaticHelicobacterspecies,EHS),多呈隱性感染,參與消化系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展[6].作為螺桿菌屬的代表性菌株,H.pylori感染全球約50%的成年人群,可導致慢性胃炎、萎縮性胃炎、腸化生甚至胃癌[7],H.pylori感染者罹患胃癌的風險可增加約2-8倍[8].動物實驗顯示,多種NHPH與消化系統(tǒng)疾病相關,H.hepaticus灌胃BALB/c小鼠可誘導肝臟纖維化和癌前病變[9],H.bilis可誘導小鼠炎癥性腸病[10],H.suis與豬胃炎和胃潰瘍有關[11].這些結果提示,NHPH感染參與胃、腸、肝等消化器官病變.

H.pylori感染致病過程大致分為四個階段: (1)對胃黏膜酸性環(huán)境的適應;(2)利用鞭毛向上皮細胞移動;(3)上皮細胞屏障的穿透與特定受體的附著;(4)毒素的釋放及細胞毒性作用[12].尿素酶是輔助H.pylori定植的關鍵因子,由尿素酶基因簇編碼.在生理pH水平下,尿素酶陰性的H.pylori突變株喪失胃黏膜定植能力,而尿素酶陽性的H.pylori可水解尿素,釋放氨升高胃內pH值[13].H.pylori鞭毛作為動力提供器官,能保護細菌免受胃部酸性環(huán)境的侵襲,使致病菌能夠遷移到黏膜上皮,鞭毛基因(flaA和flaB)突變則會降低H.pylori的運動和定植能力[12].組成細菌鞭毛的幾種鞭毛蛋白,如HpA、FlaA或FlaB,可能在感染后引起體液免疫并刺激特異性抗體反應[14].而在成功定植后,H.pylori會釋放毒素和侵襲因子,主要包括血型抗原結合黏附素(blood group antigen-binding adhesion,BabA)、唾液酸結合黏附素(sialic acid-binding adhesin,SabA)、黏附相關脂蛋白(adherence-associated lipoprotein,AlpA/B)、CagA、空泡細胞毒素相關蛋白(vacuolating cytotoxin,VacA)等,其中CagA和VacA能夠利用IV型分泌系統(tǒng)進入上皮細胞[12],參與誘導胃黏膜上皮損傷和持續(xù)性炎癥,促進胃癌發(fā)生[15].因此,H.pylori致病機制為揭示NHPH致病性提供了參考依據(jù).

螺桿菌屬與人類共存數(shù)萬年或更久,為適應不同的環(huán)境,基因組呈現(xiàn)高度異質性和多樣性,在不同人群和地域間存在顯著差異.為了探索螺桿菌屬細菌的感染與進化機制,本研究調取了50株細菌的基因組,基于16S rRNA基因、鞭毛基因、尿素酶基因、脂多糖合成相關基因,構建系統(tǒng)進化樹,為更好理解螺桿菌屬致病潛能提供依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 螺桿菌屬菌株篩選: Genus(https://lpsn.dsmz.de/genus)網(wǎng)站查找螺桿菌屬成員,根據(jù)目前已發(fā)表的文獻,確定各螺桿菌的標準株、宿主、寄居部位和致病性,每種NHPH優(yōu)先選擇標準菌株作為研究對象,如果無標準株,則隨機選擇1個基因組完整的非標準株.H.pylori菌株數(shù)量很多,本研究以毒力因子CagA/VacA基因攜帶狀態(tài)為標準,選擇CagA+/VacA+、CagA+/VacA-、CagA-/VacA+、CagA-/VacA-的H.pylori各3株,作為H.pylori代表菌株.

1.1.2 螺桿菌屬菌株基因序列提取: 美國國家生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)Assembly(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫下載螺桿菌屬菌株基因組數(shù)據(jù),包括核酸序列信息文件(fasta nucleic acid file,fna)、基因對應蛋白質序列信息文件(fasta Amino Acid file,faa)和基因組注釋文件(general feature format,gff).在Gene數(shù)據(jù)庫中檢索螺桿菌完整16S rRNA序列,以完整序列作為參照序列,在TBtools(version 1.098745)軟件或NCBI的 Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)工具中進行相似性檢索,調取其他菌株16S rRNA基因序列信息,根據(jù)位點信息和匹配度,選擇匹配度較高的序列進行系統(tǒng)進化分析.基于H.pylori致病機制,選擇尿素酶、鞭毛、黏附素和毒力因子等常見致病物質基因進行分析,觀察這些基因在螺桿菌屬細菌基因組中的分布,在核酸序列信息fna文件中調取相應基因序列,以調取到的完整序列進行系統(tǒng)進化分析.

1.2 方法

1.2.1 基因序列比對: 將調取到的16S rRNA和致病物質基因序列導入MAGA軟件(https://www.megasoftware.net/)進行序列比對,核對修正,去掉首尾兩端不規(guī)則冗余序列,篩選標準: (1)菌株名稱一致;(2)序列連續(xù)性較好,缺口(gap)≤5;(3)序列長度大于原始序列1/3.選擇符合標準的基因序列,進行系統(tǒng)進化分析.

1.2.2 系統(tǒng)進化分析: 序列比對完成后采用鄰接法(neighbor-joining method,NJ)或最大似然法(maximum likelihood method,ML)在MAGA軟件中進行構樹,進化樹采用重復抽樣分析(Bootstrap Analysis)1000次的方法檢驗各分支的置信度,利用Figtree(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)軟件對進化樹進行優(yōu)化調整.

2 結果

2.1 螺桿菌屬細菌基因組信息 首先,在NCBI Assembly數(shù)據(jù)庫查詢“Helicobacter pylori”,共得3385株H.pylori基因組信息,根據(jù)毒力因子CagA/VacA基因的4種攜帶狀態(tài),每種狀態(tài)選擇3個菌株,其中,CagA+/VacA+攜帶狀態(tài)H.pylori菌株為FDAARGOS_298、ATCC 43504和NCTC 11637,CagA+/VacA-攜帶狀態(tài)H.pylori菌株為83、J99和MT5135,CagA-/VacA+攜帶狀態(tài)H.pylori菌株為B659-C2、280-A-EK1和HUP-B14,CagA-/VacA-攜帶狀態(tài)H.pylori菌株為HP14039、LIM-008和HPY.其次,查閱文獻獲得38株正式命名的NHPH,其中4株(H.nemestrinae、H.westmeadii、H.suncus、H.apri)缺失基因組信息.最后,本研究納入50個螺桿菌屬菌株作為研究對象,表1展示了菌株名稱、宿主、致病性、基因組編號等信息.

表1 螺桿菌屬菌株基本信息

2.2 螺桿菌屬細菌16S rRNA基因系統(tǒng)進化分析 NCBI Gene數(shù)據(jù)庫中,H.pylori和6株NHPH(H.felis、H.cinaedi、H.pullorum、H.bilis、H.bizzozeronii、H.suis)具有完整的16S rRNA序列,作為參照序列進行序列調取.H.nemestrinae、H.westmeadii、H.suncus、H.apri缺失基因組信息,H.fennelliae和H.salomonis的16S rRNA基因序列長度少于參照序列的1/3,均不納入分析,最后共獲得44株螺桿菌屬菌株的16S rRNA基因序列信息,利用NJ法構建系統(tǒng)進化樹(圖1).結果顯示,進化樹分為兩個大支,第Ⅰ支24株螺桿菌的寄生部位均為胃,宿主集中在貓、鼠、狗、人等哺乳動物;除H.mustelae寄生在胃內,第Ⅱ支19株螺桿菌的寄生部位為肝、腸和膽囊,宿主不僅包括哺乳動物,也包括雞、鵝、鳥等禽類.在第Ⅰ支的24個菌株中,12個H.pylori菌株緊密聚集形成單系分支,與2個NHPH菌株(H.acinonychis、H.cetorum)聚成一簇,屬間親緣關系較近;其他10株胃內NHPH構成一個獨立的大支系.第Ⅱ支的20個菌株未發(fā)現(xiàn)顯著的聚群.結果提示,寄生部位(胃和肝腸)是螺桿菌屬菌株系統(tǒng)進化中最重要的影響因素.

圖1 螺桿菌屬基于16S rRNA序列利用鄰接法構建的系統(tǒng)進化樹. 紅色區(qū)域: 胃內螺桿菌;藍色區(qū)域: 肝腸螺桿菌.

2.3 螺桿菌屬細菌致病物質基因系統(tǒng)進化分析

2.3.1 螺桿菌屬細菌致病物質基因分布情況: 以H.pylori為例,致病物質主要包括侵襲因子和毒素,本研究檢索了35個致病基因在螺桿菌屬菌株中的分布狀態(tài)(表2).其中,尿素酶基因存在于12株H.pylori和20株NHPH,鞭毛基因存在全部的44個菌株,脂多糖合成相關基因分布于12株H.pylori和30株NHPH;然而,AlpA/B、BabA、SabA、OipA、HopE等黏附因子以及毒力因子CagA僅存在于H.pylori,VacA還存在于H.bizzozeronii,黏膜接觸誘導因子(induced by contact with epithelium,iceA)存在于H.pylori菌株和H.bilis.結果提示,NHPH具有一定的致病性,但大多數(shù)缺少完整的毒力因子基因,致病性較弱.

表2 螺桿菌屬致病物質基因在螺桿菌屬細菌基因組中的分布

2.3.2 螺桿菌屬細菌鞭毛基因系統(tǒng)進化分析: 細菌鞭毛作為動力器官,可分為絲狀體、鉤狀體和基體三部分.其中,絲狀體由flaA和flaB基因編碼的鞭毛結構蛋白多聚體FlaA、FlaB組成[13];FlgE是鞭毛鉤狀體的主要蛋白,FlgE突變則菌株失去動力[50];基體又稱為細菌鞭毛馬達,為鞭毛提供動力,由外膜環(huán)(L ring)、周質環(huán)(P ring)、內膜環(huán)(MS ring)、胞質環(huán)(C ring)、聯(lián)動桿(rod)及分泌裝置(export apparatus)組成[51].選擇完整的基因序列進行系統(tǒng)進化分析,NJ法或ML法構建系統(tǒng)進化樹(圖2).

圖2 螺桿菌屬細菌鞭毛相關基因系統(tǒng)進化分析. 紅色區(qū)域: 胃內螺桿菌;藍色區(qū)域: 肝腸螺桿菌.

首先,鞭毛絲狀體基因分析顯示,基于28個菌株的flaA基因系統(tǒng)進化樹分為2個大支,第Ⅰ支主要由12株H.pylori和8株胃內NHPH(H.acinonychis、H.cetorum、H.labacensis、H.vulpis、H.baculiformis、H.cynogastricus、H.felis、H.ailurogastricus)構成,而肝腸螺桿菌H.cholecystus位于此支基部;第Ⅱ支包含的7個菌株(H.hepaticus、H.typhlonius、H.cinaedi、H.jaachi、H.marmotae、H.equorum、H.winghamensis)寄生部位均為肝腸,未發(fā)現(xiàn)顯著聚群.類似的,基于33個菌株的flaB基因系統(tǒng)進化樹也包括2個大支,第Ⅰ支包括12株H.pylori和10株胃內NHPH(H.acinonychis、H.cetorum、H.bizzozeronii、H.mehlei、H.ailurogastricus、H.cynogastricus、H.felis、H.labacensis、H.baculiformis、H.vulpis);第Ⅱ支主要由12株肝腸螺桿菌(H.jaachi、H.cinaedi、H.typhlonius、H.hepaticus、H.marmotae、H.canis、H.winghamensis、H.anseris、H.brantae、H.pametensis、H.bilis、H.trogontum)和胃內螺桿菌H.mustelae組成,提示H.mustelae可能在胃和肝腸均可寄生.

其次,鞭毛鉤狀體基因分析顯示,基于38個菌株的flgE基因系統(tǒng)樹分為2個大支,5株肝腸螺桿菌(H.winghamensis、H.canadensis、H.pullorum、H.rodentium、H.ganmani)聚為1支,12株H.pylori、12株胃內NHPH(H.acinonychis、H.cetorum、H.heilmannii、H.ailurogastricus、H.suis、H.bizzozeronii、H.mehlei、H.cynogastricus、H.felis、H.baculiformis、H.labacensis、H.vulpis)和其他9株肝腸螺桿菌(H.bilis、H.trogontum、H.muridarum、H.equorum、H.marmotae、H.jaachi、H.cinaedi、H.hepaticus、H.typhlonius)聚為另一大支,提示鞭毛鉤狀體基因的系統(tǒng)進化與寄生部位關系不確定.

最后,鞭毛馬達的組裝受到精確的控制,先合成裝配MS環(huán)和C環(huán),其次合成裝配分泌裝置,再合成裝置聯(lián)動桿,最后合成裝配P環(huán)和L環(huán)[51],本研究分析了鞭毛馬達13個基因的系統(tǒng)進化關系.MS環(huán)由蛋白FliF組裝,基于34個菌株的fliF基因系統(tǒng)進化樹包括2個大支,6支肝腸螺桿菌(H.bilis、H.trogontum、H.typhlonius、H.hepaticus、H.jaachi、H.cinaedi)單獨聚為一個大支,12株H.pylori、11株胃內NHPH和5株肝腸螺桿菌雜聚為另一大支.C環(huán)是鞭毛馬達的旋轉復合體,控制旋轉方向,由蛋白質FliG,FliM和FliN組成,基于這3個基因的系統(tǒng)進化樹顯著受到寄生部位的影響,譬如,基于35個菌株的fliG基因系統(tǒng)進化樹分為2個大支,第Ⅰ支包括12株H.pylori和11株胃內NHPH(H.acinonychis、H.cetorum、H.suis、H.bizzozeronii、H.mehlei、H.ailurogastricus、H.cynogastricus、H.felis、H.baculiformis、H.labacensis、H.vulpis);第Ⅱ支中,除胃內螺桿菌H.mustelae外,其他11株均為肝腸螺桿菌(H.bilis、H.trogontum、H.winghamensis、H.ganmani、H.pullorum、H.equorum、H.jaachi、H.cinaedi、H.marmotae、H.typhlonius、H.hepaticus).類似的,分泌裝置由蛋白質FliP、FliQ和FliR構成,基于這3個基因的系統(tǒng)進化樹顯著受到寄生部位的影響,H.pylori菌株和胃內NHPH聚為一個大支,肝腸螺桿菌聚為另一大支.聯(lián)動桿由蛋白質FliE,FlgB,FlgC,FlgF和FlgG組裝,其中flgF基因在NCBI gene數(shù)據(jù)庫無完整序列作為參照序列,不進行系統(tǒng)進化分析.基于flgC基因構建的系統(tǒng)進化樹顯著受到寄生部位的影響,而fliE、flgB、flgG基因進化關系較為雜亂.同時,外膜L環(huán)和周質P環(huán)相關基因flgH和flgI的系統(tǒng)進化也未發(fā)現(xiàn)明顯規(guī)律.結果提示,鞭毛動力和方向控制相關基因的系統(tǒng)進化受到寄生部位的顯著影響.

2.3.3 螺桿菌屬細菌脂多糖合成相關基因系統(tǒng)進化分析: 脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性菌的細胞壁成分,又稱內毒素,由類脂A、核心多糖和O-抗原組成[52].LPS合成過程中,涉及數(shù)十種基因,本研究在NCBI gene數(shù)據(jù)庫查閱到完整序列的基因有3個,包括脂多糖庚糖基轉移酶Ⅰ(lipopolysaccharide heptosyltransferase Ⅰ,Hep Ⅰ)、脂多糖庚糖基轉移酶Ⅱ(lipopolysaccharide heptosyltransferase Ⅱ,HepⅡ)和脂多糖轉運蛋白A(lipopolysaccharide transport periplasmic protein A,LptA).Hep Ⅰ由waaC基因編碼,Hep Ⅱ則由waaF基因編碼,庚糖轉移酶參與核心多糖的形成,負責將庚糖添加到核心多糖[52].脂多糖轉運蛋白A 由lptA基因編碼,負責將胞內裝配完整的LPS運輸?shù)酵饽?從而發(fā)揮抗原特性[53].基于26個菌株的lptA基因系統(tǒng)進化分析顯示,12株H.pylori與6株胃內NHPH(H.cetorum、H.suis、H.bizzozeronii、H.mehlei、H.cynogastricus、H.felis)以及4株肝腸螺桿菌(H.marmotae、H.cinaedi、H.jaachi、H.hepaticus)共同構成第Ⅰ大支,4株肝腸螺桿菌(H.pullorum、H.winghamensis、H.bilis、H.trogontum)聚為第Ⅱ大支;基于waaC和waaF基因構建的系統(tǒng)進化樹中,肝腸螺桿菌均單獨聚為一支(圖3).結果提示,LPS合成相關基因的系統(tǒng)進化關系同樣受到寄生部位(胃、肝腸)的影響.

圖3 螺桿菌屬細菌脂多糖合成相關基因系統(tǒng)進化分析.

2.3.4 螺桿菌屬細菌尿素酶基因系統(tǒng)進化分析:H.pylori尿素酶基因簇由結構基因ureA、ureB和5個輔助基因(ureE、ureF、ureG、ureH、ureI)構成[54].系統(tǒng)進化分析顯示,僅1株EHS(H.hepaticus)同時具有完整的ureA、ureB、ureG基因序列,另外3株EHS(H.muridarum、H.bilis、H.anseris)只具有完整的ureA基因序列.GH具有較為完整的尿素酶基因簇,系統(tǒng)進化樹未見明確的規(guī)律(圖4).結果提示,在螺桿菌屬系統(tǒng)進化中,尿素酶基因對GH是必需的,對EHS是非必需的.

3 討論

螺桿菌屬細菌高度多樣且深度分化,廣泛定植于多種宿主體內,根據(jù)寄生部位分為GH和EHS.越來越多的證據(jù)顯示,作為新興的人類病原體和潛在的人畜共患病病原體,螺桿菌屬與人類急性胃腸炎、炎癥性腸病、慢性肝膽疾病的發(fā)生發(fā)展相關,因此,闡明螺桿菌屬細菌的宿主及傳播途徑是控制此類細菌感染的關鍵[6].Mannion等[55]對100多個GH和EHS菌株的基因組進行了系統(tǒng)進化分析,發(fā)現(xiàn)GH和EHS基因組之間生理和毒力相關基因具有顯著異質性,EHS表現(xiàn)為非糖酵解依賴特性,更多依賴氨基酸/有機酸進行能量代謝;GH缺乏蛋氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成途徑,依賴于環(huán)境攝取途徑;代謝功能預測結果表明,GH和EHS的進化主要是為了適應營養(yǎng)豐富的胃和營養(yǎng)缺乏的肝腸;毒力因子基因圖譜分析發(fā)現(xiàn),GH和EHS可能利用不同的致病機制感染宿主并誘導炎癥和組織損傷.Haque等[56]分析了13種螺桿菌屬細菌的脂肪酸譜,結果發(fā)現(xiàn),GH的脂肪酸以19-碳環(huán)丙烷脂肪酸和十四烷酸為主,EHS的脂肪酸則以十六烷酸和十八烯酸為主.這些結果提示,胃與肝腸不同營養(yǎng)環(huán)境驅動的新陳代謝差異是螺桿菌屬細菌系統(tǒng)進化的關鍵驅動力.

本研究收集了12株H.pylori和38株NHPH的宿主、寄生部位、致病性和基因組,基于16S rRNA基因的系統(tǒng)進化分析顯示,螺桿菌屬細菌的進化樹主要根據(jù)寄生部位分為兩大支,第Ⅰ支是在哺乳動物胃內寄生的GH,第Ⅱ支是在哺乳動物和禽類肝腸寄生的EHS.值得注意的是,從雪貂胃黏膜中分離出的H.mustelae和EHS親緣關系更密切,H.mustelae主要定植于雪貂胃部,但在糞便中也能檢測到,提示H.mustelae具有胃、腸、肝跨器官感染的潛力.本研究還發(fā)現(xiàn),鞭毛動力和方向控制相關基因的系統(tǒng)進化也受到胃和肝腸寄生部位的顯著影響.Bansil等[57]利用體外實驗觀察螺桿菌屬細菌的運動性,發(fā)現(xiàn)細菌在胃黏液層中的游動速度隨著鞭毛數(shù)量的增加而增加,具有雙極鞭毛的H.suis的游動機制比單極的H.pylori更復雜;在沒有尿素的情況下,H.pylori在pH＜4的豬胃黏蛋白(porcine gastric mucin,PGM)凝膠中無法游動,鞭毛束空轉;添加尿素后,尿素水解產(chǎn)生NH3,升高黏蛋白凝膠的pH值,促進細菌游動,提示尿素是H.pylori在酸性胃黏液中游動的關鍵因素.本研究發(fā)現(xiàn),尿素酶基因存在于多數(shù)GH中,僅在4株EHS中表達,提示尿素酶基因對GH是必需的,對EHS是非必需的.動物實驗發(fā)現(xiàn),尿素酶基因敲除的EHS(H.hepaticus3B1)對盲腸定植水平?jīng)]有影響,但誘導肝炎發(fā)生的能力下降,提示尿素酶基因能夠增強EHS的致病性[58].脂多糖也是革蘭陰性螺桿菌的重要致病物質,糖基轉移酶基因是細菌脂多糖合成過程中的關鍵基因,InterProScan分析顯示,GH和EHS擁有不同的糖基轉移酶基因,表明螺桿菌屬脂多糖的結構和合成存在顯著差異[55].本研究發(fā)現(xiàn),基于糖基轉移酶基因(waaC和waaF)構建的系統(tǒng)進化樹,EHS均單獨聚為一支.綜合以上結果,決定螺桿菌屬細菌系統(tǒng)進化的遺傳基礎更偏向于生態(tài)位(即胃和肝腸),而不是宿主物種.

胃和近端小腸比遠端腸環(huán)境的酸性更強,是食物殺菌與消化吸收的主要部位[59].正常狀態(tài)下,約85%的碳水化合物、66%-95%的蛋白質和所有脂肪在進入大腸前被吸收[60].由于胃和小腸擁有營養(yǎng)豐富的環(huán)境,有研究認為GH可以直接利用環(huán)境營養(yǎng)物質,參與生物合成途徑的基因則部分丟失,形成較小的基因組;EHS的生存環(huán)境營養(yǎng)較為匱乏,需要更大的基因組和更多樣化的生物合成途徑完成復雜的新陳代謝[55].結果提示,H.pylori致病基因在EHS基因組中丟失,可能是適應肝腸環(huán)境新陳代謝的結果.因此,毒力較弱的EHS感染致病可能需要依賴其他腸道微生物的協(xié)同作用.Whary等[61]發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌PTA-6475(L.reuteriPTA-6475)是一種潛在的益生菌,在體外具有抗炎作用,然而,與H.hepaticus共同感染B6.129P2-IL-10tm1Cgn(IL-10-/-)小鼠,能夠顯著促進結腸炎的發(fā)生.Yang等[62]利用IL-10基因敲除的C67BL/6J小鼠作為感染對象,發(fā)現(xiàn)2種環(huán)境(MHH和MIT)飼養(yǎng)的C57BL/6J IL-10-/-小鼠,對H.hepaticus誘導的盲腸結腸炎具有高度可重復的差異,提示螺旋桿菌屬細菌的易感性差異與腸道菌群相關.此外,GH僅定植于胃黏膜,而EHS不僅在腸道中定植,也能在肝臟和膽囊中定植,提示EHS可能經(jīng)歷了更為復雜的環(huán)境進化壓力.

隨著越來越多的螺桿菌屬細菌被發(fā)現(xiàn),其感染傳播已引起廣泛關注.中國是H.pylori高感染和胃癌的高發(fā)區(qū),總體感染率約為55.8%,家庭總體感染率為71.2%,明顯高于個體感染率,感染者是主要的傳播源[63].NHPH宿主多為哺乳動物和禽類,具有潛在的人畜共患性,人類與動物的密切接觸是螺桿菌屬致病的風險因素[6].譬如,H.heilmanii最初發(fā)現(xiàn)于人類胃黏膜活檢,也廣泛分布于豬、貓、狗等宿主,臨床曾發(fā)現(xiàn)1例傳染源為寵物狗的慢性胃炎H.heilmanii感染患者.H.pullorum最先發(fā)現(xiàn)于肉雞的盲腸及肝臟,與肉雞肝炎和腸炎相關,也能從腸炎患者糞便和菌血癥患者血液中分離培養(yǎng),提示H.pullorum是一種人畜共患病病原體,肉雞是傳染源,傳播途徑可能與糞便污染、飼養(yǎng)環(huán)境暴露、食用未煮熟的雞肉等相關[64].這些結果提示,螺桿菌屬細菌存在跨宿主傳播感染的潛力,但對人類致病性依然不完全清楚.

4 結論

綜上,除某些致病基因(如Ⅳ型分泌系統(tǒng))在NHPH菌株基因組中分布碎片化而無法進行系統(tǒng)進化分析外,本研究基于H.pylori致病物質基因對螺桿菌屬菌株進行了系統(tǒng)進化分析,發(fā)現(xiàn)胃和肝腸生態(tài)位是GH和EHS系統(tǒng)進化的主要驅動力,為研究NHPH與H.pylori協(xié)同進化與感染機制提供了系統(tǒng)發(fā)生證據(jù).

文章亮點

實驗背景

螺桿菌屬與多種消化道疾病相關,除了幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)外,現(xiàn)已從多種自然動物宿主體內分離出了38種非H.pylori螺桿菌屬細菌(non-Helicobacter pylori Helicobacters,NHPH),但對NHPH的致病性研究尚不充分.

實驗動機

全面分析NHPH細菌的系統(tǒng)進化關系,為深入研究NHPH的進化與感染機制提供系統(tǒng)發(fā)生證據(jù).

實驗目標

探討螺桿菌屬細菌的系統(tǒng)進化關系.

實驗方法

本研究調取了12株H.pylori和38株NHPH的基因組,基于16S rRNA、鞭毛、尿素酶以及毒力因子基因,利用MAGA 11軟件進行序列比對并構建系統(tǒng)進化樹.

實驗結果

基于16S rRNA基因、細菌鞭毛動力相關基因(flaA、flaB、fliP、fliQ、fliR、fliG、fliM、fliN)、脂多糖合成相關基因(lptA,waaC和waaF)的系統(tǒng)進化關系顯示,胃內螺桿菌(GastricHelicobacter,GH)和肝腸螺桿菌(EnterohepaticHelicobacterSpecies,EHS)分別聚集為2個大支.GH具有較為完整的尿素酶基因簇,EHS中少見尿素酶基因.

實驗結論

寄生部位(胃和肝腸)是螺桿菌屬菌株系統(tǒng)進化的主要驅動力.

展望前景

近年來非培養(yǎng)依賴的高通量測序技術證實螺旋桿菌屬是胃優(yōu)勢菌群,本研究發(fā)現(xiàn)尿素酶基因對GH是必需的,對EHS是非必需的,因此,臨床應用不依賴尿素酶活性的分子生物學診斷技術,有助于深入研究螺桿菌屬細菌(特別是NHPH)參與消化系統(tǒng)疾病的致病機制.