陳健鑫 吳峰婧琳 魏玉倩 楊婭琳 馬煥成 楊紅玉 伍建榕

摘??要：油茶（Camellia?oleifera）是山茶科（Theaceae）的一種特有的油料植物，具有重要的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，隨著油茶的集約化種植，病蟲(chóng)害大量發(fā)生，加之良種選育滯后，嚴(yán)重制約著油茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。INDETERMINATE?DOMAIN（IDD）家族是高等植物中一類保守的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)介導(dǎo)植物內(nèi)源激素進(jìn)而調(diào)控植物的基礎(chǔ)免疫反應(yīng)。為鑒定油茶中IDD基因家族成員，本研究以油茶全基因組信息為參考，通過(guò)IDD基因家族保守結(jié)構(gòu)域鑒定了29個(gè)油茶CoIDD基因家族成員，進(jìn)一步明確了各基因的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、亞細(xì)胞定位。通過(guò)RT-PCR克隆到1個(gè)與AtIDD4/5/6同源的CoIDD4基因，明確了其理化性質(zhì)、表達(dá)模式及核定位信號(hào)，同時(shí)分析了其啟動(dòng)區(qū)順式作用元件的類型。研究結(jié)果表明，29個(gè)CoIDD基因家族成員分為4個(gè)亞組，平均親水系數(shù)均小于0，屬于親水性蛋白，且亞細(xì)胞定位均位于細(xì)胞核內(nèi)；克隆到CoIDD4基因的全長(zhǎng)ORF框包含1620?bp堿基，編碼539個(gè)氨基酸，主要在葉片和花器官中表達(dá)；該基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件主要是參與光響應(yīng)和植物激素響應(yīng)元件兩大種類。綜上所述，本研究在油茶中鑒定了29個(gè)IDD基因家族成員，其中CoIDD4基因與AtIDD4/5/6親緣關(guān)系較近，推測(cè)其可能參與油茶激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基礎(chǔ)免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)等進(jìn)程，為油茶IDD轉(zhuǎn)錄因子功能解析提供理論基礎(chǔ)，也為油茶的抗性優(yōu)良品種選育及分子育種提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：油茶；IDD基因家族；生物信息學(xué)分析；植物激素；抗性調(diào)控中圖分類號(hào)：S432??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Identification?and?Bioinformatics?Analysis?of?IDD?Gene?Family?in?Camellia?oleifera

CHEN?Jianxin1，?WU?Fengjinglin1，?WEI?Yuqian1，?YANG?Yalin1，?MA?Huancheng2，?YANG?Hongyu3*，?WU?Jianrong1，2*

1.?College?of?Biodiversity?Conservation，?Southwest?Forestry?University?/?Key?Laboratory?of?Forest?Disaster?Warning?and?Control?in?Universities?of?Yunnan?Province，?Kunming，?Yunnan?650224，?China;?2.?College?of?Biodiversity?Forestry，?Southwest?Forestry?University?/?Key?Laboratory?of?Biodiversity?Conservation?in?Southwest?China，?State?Forestry?Administration，?Kunming，?Yunnan?650224，?China;?3.?College?of?Agronomy?and?Life?Sciences，?Kunming?University，?Kunming，?Yunnan?650214，?China

Abstract：?Camellia?oleifera?is?a?unique?oil?plant?of?Theaceae，?which?has?important?ornamental?value?and?economic?value.?With?the?intensive?planting?of?Camellia，?many?diseases?and?pests?occur.?In?addition，?the?delayed?breeding?of?improved?varieties?seriously?restricts?the?development?of?the?Camellia?industry.?INDETERMINATE?DOMAIN?（IDD）?family?is?a?kind?of?conservative?transcription?factors?in?higher?plants，?which?regulate?the?basic?immune?response?of?plants?by?mediating?plant?endogenous?hormones.?In?order?to?identify?the?members?of?IDD?gene?family?in?C.?oleifera，?29?members?of?CoIDD?gene?family?were?identified?through?the?conserved?domain?of?IDD?gene?family?with?reference?to?the?whole?genome?information?of?C.?oleifera，?and?further?clarified?the?structure，?physical?and?chemical?properties，?phylogenetic?relationship，?and?sub?cell?localization?of?each?gene.?The?CoIDD4?gene?homologous?to?AtIDD4/5/6?was?cloned?by?RT-PCR，?and?its?physicochemical?properties，?expression?mode?and?nuclear?localization?signal?were?clarified.?At?the?same?time，?the?types?of?cis?acting?elements?in?its?promoter?region?were?analyzed.?The?results?showed?that?29?CoIDD?gene?family?members?were?divided?into?4?subgroups，?with?average?hydrophilicity?coefficients?less?than?0，?belonging?to?hydrophilic?proteins，?and?subcellular?localization?was?located?in?the?nucleus;?The?full-length?ORF?frame?cloned?into?CoIDD4?gene?contained?1620?bp?base?and?encoded?539?amino?acids，?which?were?mainly?expressed?in?leaf?and?flower?organs;?The?cis?acting?elements?in?the?promoter?region?of?the?gene?were?mainly?involved?in?light?response?and?plant?hormone?response?elements.?In?conclusion，?this?study?identified?29?IDD?gene?family?members?in?C.?oleifera，?among?which?CoIDD4?gene?was?closely?related?to?AtIDD4/5/6.?It?is?speculated?that?CoIDD4?gene?may?be?involved?in?the?process?of?hormone?signal?transduction?and?basic?immune?response?regulation?of?C.?oleifera，?which?would?provide?a?theoretical?basis?for?the?functional?analysis?of?IDD?transcription?factors?in?C.?oleifera?and?provide?a?reference?basis?for?the?selection?and?molecular?breeding?of?superior?resistant?varieties?of?C.?oleifera.

Keywords：?Camellia?oleifera;?IDD?gene?family;?bioinformatics?analysis;?plant?hormone;?resistance?regulation

DOI：?10.3969/j.issn.1000-2561.2024.02.003

油茶（Camellia?oleifera）是山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）的一種灌木或中喬木，是我國(guó)一種特有的油料植物。油茶在我國(guó)有悠久的種植和栽培歷史，從長(zhǎng)江流域到華南地區(qū)等14個(gè)省份被廣泛的栽培[1]。鮮榨茶油中富含不飽和脂肪酸以及多酚、黃酮、原花青素、總?cè)坪湍局氐然钚晕镔|(zhì)，是一種高質(zhì)量、耐儲(chǔ)存的健康食用油[2]。油茶在云南有悠久的種植歷史，主栽的品種是白花油茶和騰沖紅花油茶，截至2019年底，云南省共發(fā)展油茶23萬(wàn)hm2，綜合產(chǎn)值7.9億元，位列全國(guó)第11位[3-4]。隨著油茶集約化種植和油茶產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，加之良種選育滯后及栽培管護(hù)技術(shù)落后導(dǎo)致油茶病蟲(chóng)害發(fā)生嚴(yán)重，目前，油茶病蟲(chóng)害的防控仍是以化學(xué)防治為主的單一防治措施，一方面病原物的抗藥性逐漸增強(qiáng)，另一方面也給生態(tài)環(huán)境和人類健康帶來(lái)了負(fù)面影響。因此，油茶抗逆相關(guān)基因亟需解析。

INDETERMINATE?DOMAIN（IDD）基因家族是C2H2型鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子的一類，IDD基因家族的保守N端以DNA結(jié)合域（不定域）為特征，包含2個(gè)C2H2和2個(gè)C2HC鋅指結(jié)構(gòu)域，植物中的IDD基因通過(guò)與多種蛋白質(zhì)相互作用，與激素級(jí)聯(lián)重疊，控制或調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育與抗逆反應(yīng)應(yīng)答[5]。ID-domain基因最初由玉米中1個(gè)典型的開(kāi)花基因INDETERMINATE1（ID1）而被報(bào)道[6]，ID1基因編碼1個(gè)包含4個(gè)鋅指單元的核蛋白，具有C2H2型鋅指蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，在植物中通過(guò)ID1基因的ID-domain所定義的基因家族成為了C2H2型鋅指蛋白的一個(gè)亞族，即IDD鋅指蛋白家族。在擬南芥（Arabidopsis?thaliana）中發(fā)現(xiàn)了16個(gè)IDD成員，命名為AtIDD1-16，構(gòu)建基于氨基酸的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)發(fā)現(xiàn)，AtIDD4、AtIDD5和AtIDD6位于同一進(jìn)化支內(nèi)，且IDD4與IDD6關(guān)系較近，二者氨基酸的一致性為64%，3個(gè)IDD基因氨基酸序列的一致性為53%，3個(gè)蛋白的氨基酸序列在ID-domain區(qū)域的一致性高達(dá)96%[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)AtIDD4基因與根系的發(fā)育和葉片極性有關(guān)并參與DELLA相互作用，AtIDD5基因是一類與DELLA相互作用的蛋白；AtIDD6基因與根系的發(fā)育有關(guān)[9]，idd4擬南芥缺失突變體表現(xiàn)了對(duì)丁香假單胞的抗性，揭示了AtIDD4作為水楊酸（Salicylic?acid，?SA）信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子，參與植物激素信號(hào)網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和基礎(chǔ)免疫反應(yīng)[10]。隨著基因組測(cè)序技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已有多個(gè)物種中的IDD家族成員被鑒定并報(bào)道了其重要的生物學(xué)功能。通過(guò)IDD家族的保守結(jié)構(gòu)域在毛竹（Phyllostachys?edulis）中鑒定了32個(gè)具有完整IDD-domain的成員，證實(shí)PheIDD21受蔗糖誘導(dǎo)后是側(cè)調(diào)控芽發(fā)育的關(guān)鍵因子[11]。甘藍(lán)型油菜（Brassica?napus）在我國(guó)食用油產(chǎn)業(yè)中具有舉足輕重的地位，在油菜中鑒定了58個(gè)候選IDD蛋白，其中Bna.A08IDD7a基因通過(guò)介導(dǎo)赤霉素（Gibberellin，?GA）和生長(zhǎng)素（auxin，?IAA）的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程而參與根系生長(zhǎng)的調(diào)控[12]。

IDD基因家族在植物生長(zhǎng)發(fā)育、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及基礎(chǔ)免疫調(diào)控中具有重要作用，但在油茶中鮮有研究報(bào)道。本研究基于油茶基因組數(shù)據(jù)鑒定IDD基因家族成員，明確各個(gè)基因間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并利用生物信息學(xué)方法分析IDD基因家族蛋白的理化性質(zhì)、Motif預(yù)測(cè)、亞細(xì)胞定位等情況，同時(shí)鑒定并克隆AtIDD4/5/6的同源基因CoIDD4及分析其表達(dá)特征，為后續(xù)油茶分子育種和抗病品種的選育提供重要理論依據(jù)。

1??材料與方法

1.1??材料

供試植物：本研究所用油茶采集自云南省德宏州梁河縣油茶種植基地。選取長(zhǎng)勢(shì)一致的1年生油茶實(shí)生苗的葉片組織用于CoIDD基因的克隆，選取梁河縣翁冷村12～15年生油茶，分別收集葉、花、果實(shí)和根系組織用于CoIDD基因表達(dá)模式分析。每個(gè)組織至少收集3套生物學(xué)模板，收集后立刻用液氮速凍，于–80?℃長(zhǎng)期保存。

參考基因組及參考序列：油茶全基因組（ASM2231669v1）信息下載自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/GCA_022316695.1/）[13]，擬南芥IDD基因家族氨基酸序列及核苷酸序列下載自TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.arabidopsis.org）。

供試試劑：TRIZOL、Ex?Taq、10×Ex?Taq?Buffer、dNTP?Mixture、DH5a感受態(tài)細(xì)胞、pMD??19-T?Vector?Cloning?Kit，PrimeScriptTM?IV?1st?strand?cDNA?Synthesis?Mix購(gòu)買自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司。

1.2??方法

1.2.1??油茶IDD基因家族成員鑒定??在TAIR（https：//www.arabidopsis.org）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載擬南芥IDD基因家族16個(gè)成員的氨基酸序列，建立本地種子序列數(shù)據(jù)庫(kù)，利用BLAST軟件將擬南芥IDD基因家族氨基酸序列與油茶蛋白質(zhì)組序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。篩選后的油茶蛋白質(zhì)序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blastp并分析其結(jié)構(gòu)域，將未含有C2H2結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)剔除。同時(shí)將獲得的氨基酸序列比對(duì)到油茶的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//?github.?com/Hengfu-Yin/CON_genome_data）和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得轉(zhuǎn)錄本序列和基因組序列用于后續(xù)分析。

候選的家族成員通過(guò)ExPASy（https：//web.?expasy.org/protparam/）數(shù)據(jù)庫(kù)中的ProtParam工具，對(duì)CoIDD4蛋白的氨基酸大小、分子質(zhì)量、等電點(diǎn)基本信息進(jìn)行分析，并通過(guò)Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，若蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)，則通過(guò)NoD（http：//www.compbio.dundee.ac.uk/?www-nod/form_action_seqInput.jsp）預(yù)測(cè)分析其核定位序列。

1.2.2??油茶IDD基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建??利用MEGA?9軟件將擬南芥和油茶IDD基因家族成員cDNA序列和氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，并通過(guò)鄰接法（neighbor-Joining，?NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，設(shè)置Bootstrap值為1000。

1.2.3??油茶IDD基因家族保守結(jié)構(gòu)域（motif）分析??保守結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)中能夠折疊成特定三維結(jié)構(gòu)的一段相對(duì)區(qū)域，其結(jié)構(gòu)亞單位稱為基序（Motif），蘊(yùn)含了各自的遺傳進(jìn)化信息。利用MEGA?9軟件將擬南芥和油茶IDD基因家族氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，通過(guò)MEME（http：//meme-?suite.org/tools/?meme）在線軟件對(duì)擬南芥與油茶IDD基因家族序列進(jìn)行motif搜索，設(shè)置分析motif數(shù)值為10，并繪制相應(yīng)保守域結(jié)構(gòu)的logo圖。

1.2.4??油茶IDD4蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析及系統(tǒng)發(fā)育分析??通過(guò)Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/?phyre2/html/help.cgi？id=help/faq）在線軟件預(yù)測(cè)分析擬南芥AtIDD4/5/6蛋白和油茶CoIDD4蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，以此分析其蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。將CoIDD4基因在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST分析，選取同源性較高的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，利用MEGA中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap值設(shè)為1000。

1.2.5??油茶IDD4基因啟動(dòng)子順式作用元件分析及功能預(yù)測(cè)??根據(jù)油茶全基因組序列信息，利用TBtools提取CoIDD4基因序列上游長(zhǎng)度為2?kb的啟動(dòng)子序列，并將其上傳到PlantCARE（http：//?bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

1.2.6??油茶IDD4基因ORF克隆及表達(dá)模式分析??將篩選得到的擬南芥AtIDD4/5/6基因的同源基因CoIDD4的氨基酸比對(duì)到油茶的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)在線工具ORF?finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）對(duì)該序列進(jìn)行開(kāi)放閱讀框（ORF）預(yù)測(cè)，并通過(guò)Primer?5軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長(zhǎng)的引物（表1）。利用TRIZOL提取油茶葉片總RNA，通過(guò)NanoDrop?2000測(cè)定RNA濃度和純度，合格樣品利用PrimeScriptTM?IV?1st?strand?cDNA?Synthesis?Mix反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，以此為模板擴(kuò)增CoIDD4基因的全長(zhǎng)片段。擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD?19-T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆子送昆明擎科生物有限公司測(cè)序，將插入片段正確的陽(yáng)性克隆保存于–80?℃超低溫冰箱。

提取油茶植株的葉、花、果實(shí)和根系組織總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以油茶3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH）為內(nèi)參[14]，通過(guò)qPCR檢測(cè)CoIDD4基因在油茶不同組織內(nèi)的表達(dá)模式。

2??結(jié)果與分析

2.1??油茶IDD基因家族成員鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用擬南芥IDDs基因的氨基酸序列在油茶蛋白組數(shù)據(jù)庫(kù)初步篩選出35條候選序列，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blastp分析去除不含C2H2結(jié)構(gòu)域的序列后，最終獲得29個(gè)油茶IDD基因家族成員，暫命名為CoIDD1～29（表2）。CoIDD基因家族29個(gè)成員的理化性質(zhì)分析表明，29個(gè)IDD家族成員編碼氨基酸長(zhǎng)度在280～570個(gè)之間，氨基酸長(zhǎng)度存在較大的變化；相對(duì)分子質(zhì)量介于32027.26～63201.23?Da之間；等電點(diǎn)（pI）介于5.44～9.52之間，其中pI<7的酸性氨基酸有4個(gè)；pI>7的堿性氨基酸有25個(gè)；不穩(wěn)定系數(shù)介于37.23～69.44之間，有1個(gè)成員不穩(wěn)定系數(shù)小于40，屬于穩(wěn)定蛋白，其余成員均屬于不穩(wěn)定蛋白；29個(gè)CoIDD家族成員的平均親水系數(shù)均小于0，屬于親水性蛋白，且亞細(xì)胞定位均位于細(xì)胞核內(nèi)。

采用鄰接構(gòu)建的擬南芥和油茶的IDD基因家族氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)共分為4個(gè)進(jìn)化支（圖1）。第Ⅰ進(jìn)化支由CoIDD23/24/26/28/29五個(gè)成員組成，第Ⅱ進(jìn)化支由CoIDD5/19/21/22/27五個(gè)成員組成，前2個(gè)分支首先從IDD基因家族中分離出來(lái)，主要由油茶IDD家族成員組成，不含有擬南芥IDD家族成員，因此屬于油茶中特有的IDD蛋白。由擬南芥AtIDD14/15/16和油茶CoIDD14/15五個(gè)成員共同組成了第Ⅲ進(jìn)化支，進(jìn)化距離較近。第Ⅳ分支由眾多擬南芥AtIDDs蛋白和油茶CoIDDs蛋白共同組成，其中CoIDD6/7/17/18在該分支中更早的被分離出來(lái)，CoIDD4與AtIDD4/5/6處于同一進(jìn)化亞支內(nèi)，親緣關(guān)系較近。由此可見(jiàn)，油茶中存在與擬南芥IDD蛋白進(jìn)化距離較近的同源IDD蛋白，同時(shí)CoIDD蛋白與AtIDD蛋白也顯示了較為明顯的分化。

2.2??油茶IDD基因家族保守結(jié)構(gòu)域分析

通過(guò)MEME軟件分析IDD家族蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域的結(jié)果表明，油茶CoIDD蛋白與擬南芥AtIDD蛋白存在相似的保守結(jié)構(gòu)域。AtIDD基因所包含保守的ID-domain區(qū)域，含有一組4個(gè)串聯(lián)的鋅指結(jié)構(gòu)（ZF1～4）[15]。在CoIDD蛋白的10個(gè)保守motif中，motif?1（RFVCEICNKGFQRDQ?NLQLHRRGHNLPWK）最為保守（每個(gè)Motif中不同位置處出現(xiàn)的氨基酸種類越少，說(shuō)明該位置處保守性越高），該motif為IDD家族第1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)ZF1；motif?2（YAVQSDWKAHSKTCGTR?EYRCD）為IDD家族第3個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)ZF3；motif?3（CVHHDPSRALGDLTGIKKHFCRKHGEKKW）為IDD家族第2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)ZF2；motif?4為IDD家族第4個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)ZF4（圖2）。

油茶和擬南芥IDD蛋白的保守結(jié)構(gòu)域聯(lián)合分析結(jié)果表明，擬南芥和油茶IDD蛋白結(jié)構(gòu)域特征分化與共同構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)總體趨勢(shì)相吻合（圖3）。motif?1～4代表了IDD家族中4個(gè)串聯(lián)的鋅指結(jié)構(gòu)（ZF1～4）為最保守的結(jié)構(gòu)，在油茶和擬南芥IDD蛋白中保守存在（圖4）。

位于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)第Ⅲ進(jìn)化支的擬南芥AtIDD14/15/16和油茶CoIDD14/15特異存在motif?10（RQ?IEJAELEFANAKRIRQQAQAELEKAQALKEQATKKISSTIMQITCHSO）；位于第Ⅰ～Ⅱ進(jìn)化支內(nèi)的成員缺少了motif?5（GNPDPDAEVIALSPKTLMA?TN）和mtif?9（GGGNDGLTRDF?LGVG），這些親緣關(guān)系較近的蛋白中特異性存在或缺失的區(qū)段可能行使著特殊且重要的生物學(xué)功能。

2.3??CoIDD4理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析

擬南芥AtIDD4/5/6在擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育中扮演著重要的角色，通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育和motif分析，在油茶中鑒定到1個(gè)AtIDD4/5/6的同源基因，命名為CoIDD4。CoIDD4與AtIDD4/5/6存在高度相似的保守結(jié)構(gòu)域（圖3，圖4）。通過(guò)ORF?finder搜索發(fā)現(xiàn)CoIDD4的全長(zhǎng)ORF框包含1620?bp堿基，編碼539個(gè)氨基酸，與AtIDD4/5/6相似，該蛋白屬于堿性不穩(wěn)定親水性蛋白質(zhì)，且亞細(xì)胞定位均位于細(xì)胞核內(nèi)（表3）。

通過(guò)Phyre2軟件分析AtIDD4/5/6和CoIDD4的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明CoIDD4和AtIDD4/5/6擁有相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)，主要由無(wú)規(guī)則卷曲（random?coil）、α-螺旋（α-helix）和β-折疊（β-strand）構(gòu)成，無(wú)轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。Phyre2預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型與二級(jí)結(jié)構(gòu)相吻合（圖5）。

通過(guò)Plant-mPLoc軟件分析顯示CoIDD4和AtIDD4/5/6亞細(xì)胞定位均位于細(xì)胞核內(nèi)。通過(guò)NoD分析核定位序列，結(jié)果表明，CoIDD4的N端具有核定位信號(hào)（nuclear?localization?signal，NLS），其序列預(yù)測(cè)可信度最高的2條序列分別為HRRGHNLPWKLKQKNTKEVVKRKVYLC（可信度為0.85）和DLTGIKKHFFRKHGEKKYKCEKCS?KKYAVQSDWK（可信度為0.90）。而AtIDD4/5/6在靠近N端的一個(gè)核定位為KKKR或者KRKR，但該核定位信號(hào)在CoIDD4中并未完全吻合（圖6）。

2.4??CoIDD4系統(tǒng)發(fā)育分析

CoIDD4基因及其同源性較高的序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示（圖7），用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的物種氨基酸序列共分為兩大進(jìn)化支，CoIDD4與山茶（Camellia?sinensis）IDD5以100的自展支持率具為第一進(jìn)化支內(nèi)的一個(gè)小分支內(nèi)，證實(shí)CoIDD4與CsIDD5具有高度的同源性。CoIDD4與毛果楊（Populus?trichocarpa）、可可樹(shù)（Theobroma?cacao）、麻風(fēng)樹(shù)（Jatropha?curcas）、橡膠樹(shù)（Hevea?brasiliensis）、木薯（Manihot?esculenta）和荷花（Nelumbo?nucifera）的IDD5基因共聚為第一進(jìn)化支內(nèi)，具有一定的親緣關(guān)系。另外，芒果（Mangifera?indica）、開(kāi)心果（Pistacia?vera）、蓖麻（Ricinus?communis）和榴蓮（Durio?zibethinus）的IDD5基因與花生（Arachis?hypogaea）的IDD4基因共同聚為第二進(jìn)化支，與CoIDD4親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.5??CoIDD4基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

對(duì)CoIDD4起始密碼子上游2000?bp的啟動(dòng)子區(qū)域序列進(jìn)行順式作用元件分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CoIDD4啟動(dòng)子區(qū)包括13種類型的順式作用元件，其中CAAT-box和TATA-box兩類核心順式作用元件所占比例最大，其余順式作用元件按功能可分為植物激素響應(yīng)元件、光響應(yīng)元件和防御響應(yīng)元件幾大類。其中光響應(yīng)元件所占比例最大，如G-box、GT1-motif、TCCC-motif、GTGGC-motif和3-AF1?binding?site等。另外植物激素響應(yīng)元件也占有較大的比例，如參與脫落酸（ABA）響應(yīng)的ABRE元件，參與赤霉素（GA）響應(yīng)的TATC-box元件，參與水楊酸（SA）響應(yīng)的TCA-element元件和參與生長(zhǎng)素（IAA）響應(yīng)的TGA-element元件（圖8）。上述研究結(jié)果表明，CoIDD4存在調(diào)節(jié)光信號(hào)通路和植物激素信號(hào)通路的潛能，推測(cè)CoIDD4基因發(fā)揮著和AtIDD4相似的生物學(xué)功能，即通過(guò)調(diào)控植物內(nèi)源激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)而調(diào)控油茶的基礎(chǔ)免疫反應(yīng)。

2.6??CoIDD4基因克隆及表達(dá)分析

通過(guò)RT-PCR分別從油茶的葉片組織中擴(kuò)增到CoIDD4基因ORF框的全長(zhǎng)編碼序列，經(jīng)TA克隆測(cè)序后各獲得一條1620?bp的特異性片段（圖9）。將該序列在油茶基因組內(nèi)進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果顯示，該基因?yàn)橛筒鐲ON1個(gè)體12號(hào)染色體的一段基因（CM039316.1）。在全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組中比對(duì)到一條mRNA鏈（47?367?005～47?370?434?bp）（genemark-HiC_scaffold_12-processed-gene-473.55-?mRNA-1），包括2個(gè)外顯子（exon），其中exon1為47?370?076～473?704?34?bp，exon2為47?367?005～?47?368?265?bp；存在2個(gè)蛋白編碼區(qū)（CDS）；其中CDS1包括47?370?076～47?370?434?bp，CDS2包括47?367?005～47?368?265?bp。

采用RT-qPCR分析CoIDD4基因的組織表達(dá)情況，結(jié)果表明，在內(nèi)參基因表達(dá)量較一致的情況下，CoIDD4基因在油茶的各個(gè)組織中均有表達(dá)，且在葉片及花組織中表達(dá)量較高，而在根、莖及果組織中表達(dá)量較微弱（圖10）。推測(cè)CoIDD4基因在油茶葉片和花器官中發(fā)揮重要的作用。

3??討論

本研究通過(guò)擬南芥IDD基因家族保守結(jié)構(gòu)域，在油茶全基因組范圍內(nèi)鑒定了29個(gè)油茶IDD基因家族成員，同時(shí)通過(guò)RT-PCR克隆了與AtIDD4/5/6親緣關(guān)系較近的CoIDD4基因，分析其理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式，以期為油茶的良種選育及抗性研究提供理論基礎(chǔ)。

作為植物中C2H2家族的一個(gè)亞家族成員，IDD基因家族已經(jīng)在多個(gè)物種中被鑒定，且啟動(dòng)子區(qū)富含與植物激素響應(yīng)與逆境和抗性響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和基礎(chǔ)免疫反應(yīng)中具有重要的作用[6，?9，?15-17]。在油茶中還尚未見(jiàn)IDD基因家族的報(bào)道，基于油茶全基因組數(shù)據(jù)和前人對(duì)IDD基因家族的研究結(jié)果，本研究在油茶中鑒定了29個(gè)IDD家族成員，相對(duì)于模式植物擬南芥中16個(gè)IDD家族成員，油茶IDD基因的數(shù)量出現(xiàn)了增加，這可能與油茶長(zhǎng)期人工栽培進(jìn)行品種雜交和長(zhǎng)期適應(yīng)外界環(huán)境有關(guān)。對(duì)CoIDD家族成員的鑒定主要依據(jù)其高度保守的基因結(jié)構(gòu)域，通常認(rèn)為AtIDD家族所包含保守的ID-domain區(qū)域，含有一組４個(gè)串聯(lián)的鋅指結(jié)構(gòu)（ZF1-4）[14]，在對(duì)擬南芥和油茶IDD家族成員保守結(jié)構(gòu)域分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，motif1-4所指代的ZF1-4在AtIDD和CoIDD均保守存在，這4個(gè)motif是參與DNA-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作所必需的模塊，能準(zhǔn)確地識(shí)別靶標(biāo)并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控。其他特殊的motif在不同的亞組中特異性存在或缺失是導(dǎo)致基因功能出現(xiàn)分化的原因，這些特殊的基序可能在轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游靶標(biāo)基因的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

根據(jù)油茶和擬南芥IDD家族共建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，油茶的29個(gè)IDD基因家族成員大致分為5個(gè)亞組，除前2個(gè)亞組中不包含擬南芥IDD家族基因，其他每個(gè)亞族均含有擬南芥和油茶的IDD基因，揭示了大多數(shù)CoIDD基因與擬南芥AtIDD基因存在一定的進(jìn)化保守性。通常而言，處于同一進(jìn)化支的基因或蛋白，若相互存在較高的相似性序列，則可推測(cè)它們具有相似的生物學(xué)功能，因此，通過(guò)擬南芥和油茶IDD蛋白序列相似性預(yù)測(cè)和探討油茶IDD蛋白的功能是基因功能研究的重要切入點(diǎn)。已有研究證明擬南芥AtIDD4/5/6可能與根系的發(fā)育和葉片極性有關(guān)，并參與DELLA相互作用從而調(diào)控GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[9]，另一方面，V?LZ等[10]學(xué)者證實(shí)擬南芥idd4缺失突變對(duì)丁香假單孢菌（Pseudomonas?syringae）抗性提高，轉(zhuǎn)錄組及染色質(zhì)免疫共沉淀（chromatin?immunoprecipitation?assay，ChIP）提示IDD4作為SA的負(fù)調(diào)控因子，參與植物激素信號(hào)網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，作為基礎(chǔ)免疫應(yīng)答和病原相關(guān)分子特征激活植物的免疫反應(yīng)。本研究克隆并鑒定到１個(gè)與AtIDD4/5/6親緣關(guān)系較近的的CoIDD4基因，該基因與AtIDD4/5/6構(gòu)成一小進(jìn)化亞支，可能與AtIDD4/5/6具有相似的生物學(xué)功能。通過(guò)qRT-PCR發(fā)現(xiàn)CoIDD4基因主要在油茶的葉片組織和花器官中表達(dá)，這與AtIDD4/5/6的表達(dá)模式存在一定的相似性[7]，推測(cè)CoIDD4與AtIDD4功能相似，通過(guò)介導(dǎo)內(nèi)源植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與油茶的基礎(chǔ)免疫進(jìn)程。

順式作用元件是參與植物轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要分子開(kāi)關(guān)，處于通路的上游轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)靶向作用于下游基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件，激活下游基因的表達(dá)，從而發(fā)揮下游基因的作用。本研究預(yù)測(cè)了CoIDD4基因起始密碼子上游2?kb的啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件，一方面與光響應(yīng)相關(guān)的作用元件反復(fù)出現(xiàn)多次，顯示了CoIDD4在光響應(yīng)過(guò)程中具有重要的作用；另一方面在該區(qū)域中還有一定數(shù)量的植物激素響應(yīng)元件，包括響應(yīng)GA、IAA、ABA和SA的作用元件，其中SA信號(hào)通路常被認(rèn)為是植物免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)中重要的信號(hào)通路，植物受病原體攻擊后，SA的合成加速，并在植物體內(nèi)迅速積累，激活下游基因的表達(dá)進(jìn)而引發(fā)植物的SAR反應(yīng)[17]，CoIDD4啟動(dòng)子區(qū)域中包括了參與SA響應(yīng)的作用元件，表明CoIDD4可能參與SA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，但CoIDD4是否參與SA積累或通過(guò)SA信號(hào)通路參與油茶免疫調(diào)控還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1]?中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).?中國(guó)植物志[M].?北京：?科學(xué)出版社，?1998，?49（3）：?13.Editorial?Committee?of?Flora?of?China，?Chinese?Academy?of?Sciences.?Flora?of?China[M].?Beijing：?Science?Press，?1998，?49（3）：?13.?（in?Chinese）

[2]?HE?X?S，?XU?L?C，?PAN?C，?GONG?C，?WANG?Y?J，?LIU?X?L，?YU?Y?C.?Drought?resistance?of?Camellia?oleifera?under?drought?stress：?changes?in?physiology?and?growth?characteristic[J].?PLoS?One，?2020，?15（7）：?e0235795.

[3]?陳福，?郭曉春，?劉倬志，?張林濤.?云南省油茶產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展探析[J].?現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，?2020（12）：?252-255.CHEN?F，?GUO?X?C，?LIU?Z?Z，?ZHANG?L?T.?Analysis?on?high-quality?development?of?Camellia?oleifera?industry?in?Yunnan?province[J].?Modern?Agricultural?Science?and?Technology，?2020（12）：?252-255.?（in?Chinese）

[4]?鄭靜楠，?鹿杉，?鄭進(jìn)烜.?云南省油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀與對(duì)策研究[J].?林業(yè)調(diào)查規(guī)劃，?2021，?46（2）：?114-117.ZHENG?J?N，?LU?S，?ZHENG?J?X.?Development?status?and?countermeasure?of?Camellia?oleifera?industry?in?Yunnan?province[J].?Forest?Inventory?and?Planning，?2021，?46（2）：?114-117.?（in?Chinese）

[5]?YOSHIDA?H，?HIRANO?K，?SATO?T，?MITSUDA?N，?NOMOTO?M，?MAEO?K，?KOKETSU?E，?MITANI?R，?KAWAMURA?M，?ISHIGURO?S，?TADA?Y，?OHME-?TAKAGI?M，?MATSUOKA?M，?UEGUCHI-TANAKA?M.?DELLA?protein?functions?as?a?transcriptional?activator?through?the?DNA?binding?of?the?indeterminate?domain?family?proteins[J].?PNAS，?2014，?111（21）：?7861-7866.

[6]?SINGLETON?W?R.?Inheritance?of?indeterminate?growth?in?maize[J].?Journal?of?Heredity，?1946，?37（2）：?61-64.

[7]?張喜賢.?擬南芥鋅指蛋白AtIDD4在花絲伸長(zhǎng)過(guò)程中的作用[D].?昆明：?云南大學(xué)，?2014.ZHANG?X?X.?The?role?of?Arabidopsis?zinc?finger?protein?AtIDD4?in?filament?elongation[D].?Kunming：?Yunnan?University，?2014.?（in?Chinese）

[8]?喬菊香.?擬南芥轉(zhuǎn)錄因子AtIID5和AtIDD6在花絲伸長(zhǎng)過(guò)程中的作用分析[D].?昆明：?云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，?2019.QIAO?J?X.?Functional?analysis?of?Arabiddopsis?transcription?factor?AtIDD5?and?AtIDD6?in?filament?elongation[D].?Kunming：?Yunnan?Agricultural?University，?2019.?（in?Chinese）

[9]?COELHO?C?P，?HUANG?P，?LEE?D?Y，?Brutnell?T?P.?Making?roots，?shoots，?and?seeds：?IDD?gene?family?diversification?in?plants[J].?Trends?in?Plant?Science，?2018，?23（1）：?66-78.

[10]?V?LZ?R，?KIM?S?K，?MI?J?N，?RAWAT?A?A，?VELUCHAMY?A，?MARIAPPAN?K?G，?RAYAPURAM?N，?DAVIERE?J?M，?ACHARD?P，?BLILOU?I，?AL-BABILI?S，?BENHAMED?M，?HIRT?H.?Indeterminate-domain?4?（IDD4）?coordinates?immune?responses?with?plant-growth?in?Arabidopsis?thaliana?[J].?PLoS?Pathogens，?2019，?15（1）：?1007499.

[11]?陳驕羽.?毛竹IDD基因家族與筍芽發(fā)育的相關(guān)性研究[D].?杭州：?浙江農(nóng)林大學(xué)，?2020.CHEN?J?Y.?The?correlation?between?IDD?gene?family?and?development?of?shoot/bud?in?Phyllostachys?edulis[D].?Hangzhou：?Zhejiang?Agriculture?and?Forestry?University，?2020.?（in?Chinese）

[12]?段回春.?甘藍(lán)型油菜IDD基因家族成員鑒定及Bna.A08IDD7a基因功能分析[D].?重慶：?西南大學(xué)，?2020.DUAN?H?C.?Genome-wide?identification?of?the?INDETERMINATE?DOMAIN?（IDD）?gene?family?in?rapeseed?and?gene?function?analysis?of?Bna.?A08IDD7a[D].?Chongqing：?Southwest?University，?2020.?（in?Chinese）

[13]?LIN?P，?WANG?K?L，?WANG?Y?P，?HU?Z?K，?YAN?C，?HUANG?H，?MA?X?J，?CAO?Y?Q，?LONG?W，?LIU?W?X，?LI?X?L，?FAN?Z?Q，?LI?J?Y，?YE?N，?REN?H?D，?YAO?X?H，?YIN?H?F.?The?genome?of?oil-Camellia?and?population?genomics?analysis?provide?insights?into?seed?oil?domestication[J].?Genome?Biology，?2022，?23（1）：?14.

[14]?SEKALSKA?B，?CIECHANOWICZ?A，?DOLEGOWSKA?B，?NARUSZEWICZ?M.?Optimized?RT-PCR?method?for?assaying?expression?of?monocyte?chemotactic?protein?type?1?（MCP-1）?in?rabbit?aorta[J].?Biochemical?Genetics，?2006，?44（3/4）：?133-143.

[15]?ENGLBRECHT?C?C，?SCHOOF?H，?B?HM?S.?Conservation，?diversification?and?expansion?of?C2H2?zinc?finger?proteins?in?the?Arabidopsis?thaliana?genome[J].?BMC?Genomics，?2004，?5（1）：?39.

[16]?李云富，?王靜賢，?杜艷芳，?鄒華文，?張祖新.?玉米開(kāi)花期相關(guān)的Indeterminate?domain?（IDD）蛋白家族基因的鑒定[J].?作物學(xué)報(bào)，?2019，?45（4）：?499-507.LI?Y?F，?WANG?J?X，?DU?Y?F，?ZOU?H?W，?ZHANG?Z?X.?Identification?of?Indeterminate?domain?protein?family?genes?associated?with?flowering?time?in?maize[J].?Acta?Agronomica?Sinica，?2019，?45（4）：?499-507.?（in?Chinese）

[17]?MOORE?J?W，?LOAKE?G?J，?SPOEL?S?H.?Transcription?dynamics?in?plant?immunity[J].?Plant?Cell，?2011，?23（8）：?2809-2820.