吳秋妃 楊程 張淑巖 韋露 馮美利 李睿 周麗霞 曹紅星

摘??要：油棕（Elaeis?guineensis?Jacq.）是世界上生產(chǎn)效率最高的產(chǎn)油植物，果實(shí)發(fā)育是形成產(chǎn)量的基礎(chǔ)，但采收24?h后會(huì)出現(xiàn)酸敗現(xiàn)象，嚴(yán)重影響棕櫚油品質(zhì)，目前對(duì)果肉發(fā)育和采后的游離脂肪酸代謝物合成差異的關(guān)鍵調(diào)控基因及途徑尚未明確。本研究以油棕果實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料，果實(shí)取自授粉后95?d（MS1）﹑125?d（MS2）、185?d（MS3）、采收后24?h（MS4）、采收后36?h（MS5）5個(gè)時(shí)期。采用第二代高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)（RNA-Seq）和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜代謝組學(xué)技術(shù)（LC-MS/MS），對(duì)其發(fā)育和采后的果實(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和代謝組測(cè)定與分析。結(jié)果表明：無(wú)籽種油棕在脂肪酸積累中后期不飽和脂肪酸顯著高于飽和脂肪酸，在油棕果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，LACS4、LACS4-X1、FATA、FATB、KASⅠ、KASⅡ、SAD1在果肉中高表達(dá)且與果肉中油酸、亞油酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、亞麻酸呈正相關(guān)關(guān)系，DGAT、PDAT在果肉中高表達(dá)且與上述6種脂肪酸含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明上述酶基因的表達(dá)可能對(duì)油棕果實(shí)脂肪酸的合成和累積分別具有促進(jìn)和抑制作用，推測(cè)LACS4、LACS4-X1、FATA、FATB、KASⅠ、KASⅡ、SAD1可能是不飽和脂肪酸含量較高的關(guān)鍵基因；在果實(shí)采后貯藏過(guò)程中，GDSL2、GDSL7、SAD2、LACS9酶基因和GDSL1、KAT分別與油酸呈極顯著正、負(fù)相關(guān)關(guān)系，與棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸呈負(fù)、正相關(guān)，推測(cè)在酸敗過(guò)程GDSL2、GDSL7、SAD2、LACS9酶基因可能促進(jìn)油酸生成，抑制棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸合成，GDSL1、KAT酶基因反之，推測(cè)GDSL2、GDSL7、SAD2、LACS9可能是導(dǎo)致油棕采后酸敗的關(guān)鍵基因。本研究結(jié)果旨在利用分子生物技術(shù)提升高不飽和脂肪酸含量和改變脂肪酸組成提供備選基因，為篩選高不飽和脂肪酸和耐貯藏的品種提供理論參考。

關(guān)鍵詞：油棕；游離脂肪酸；合成；轉(zhuǎn)錄組學(xué)；代謝組學(xué)中圖分類號(hào)：S565.9??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Differential?Analysis?of?Fatty?Acid?Synthesis，?Transcriptional?Metabolism?During?Fruit?Development?and?Postharvest?in?Oil?Palm

WU?Qiufei，?YANG?Cheng，?ZHANG?Shuyan，?WEI?Lu，?FENG?Meili，?LI?Rui，?ZHOU?Lixia，?CAO?Hongxing*

Coconut?Research?Institute，?Chinese?Academy?of?Tropical?Agricultural?Sciences?/?Hainan?Key?Laboratory?of?Tropical?Oil?Crops?Biology，?Wenchang，?Hainan?571339，?China

Abstract：?Oil?Palm?（Elaeis?guineensis?Jacq.）?is?the?most?efficient?oil-producing?plant?in?the?world.?Fruit?development?is?the?basis?of?yield?formation，?but?rancidity?occurs?after?24?h?of?harvesting，?which?seriously?affecting?the?quality?of?palm?oil.?At?present，?the?key?regulatory?genes?and?pathways?for?the?differences?in?the?synthesis?of?free?fatty?acid?metabolism?in?pulp?development?and?postharvest?fruits?have?not?been?identified.?In?this?study，?oil?palm?fruits?were?collected?from?95?days?（MS1），?125?days?（MS2），?185?days?（MS3），?24?h?（MS4）?and?36?h?（MS5）?after?pollination.?The?second?generation?high-throughput?transcriptomics?（RNA-Seq）?and?liquid?chromatography-tandem?mass?spectrometry?（LC-MS/MS）?were?used?to?analyze?the?transcriptomes?and?metabolomes?of?the?fruits?during?the?development?and?postharvest?storage.?The?unsaturated?fat?of?oil?palm?was?significantly?higher?than?that?of?fatty?acid?during?the?middle?and?late?stages?of?fatty?acid?accumulation，?LACS4，?LACS4-X1，?FATA，?FATB，?KASⅠ，?KASII，?SAD1?were?highly?expressed?in?pulp?and?were?positively?correlated?with?oleic?acid，?linoleic?acid，?palmitic?acid，?palmitoleic?acid?acid，?stearic?acid?and?linolenic?acid，?DGAT?and?PDAT?were?over-expressed?in?the?pulp?and?negatively?correlated?with?the?content?of?the?six?fatty?acids，?indicating?that?the?expression?of?the?above-mentioned?genes?may?promote?and?inhibit?the?synthesis?and?accumulation?of?the?fatty?acids?in?oil?palm?fruit，?respectively，?suggesting?that?LACS4，?LACS4-A1，?FATA，?FATB，?KASⅠ，?KASII?and?SAD1?may?be?the?key?genes?with?high?content?of?unsaturated?fat?during?postharvest?storage.?GDSL2，?GDSL7，?SAD2，?LACS9?genes?and?GDSL1，?KAT?were?positively?and?negatively?correlated?with?oleic?acid，?and?negatively?and?positively?correlated?with?palmitic?acid，?palmitoleic?acid?acid，?stearic?acid，?linoleic?acid?and?linolenic?acid，?respectively，?suggesting?that?GDSL2，?GDSL7，?SAD2?and?LACS9?might?promote?oleic?acid?production?and?inhibit?palmitic?acid，?palmitoleic?acid?acid，?stearic?acid，?linoleic?acid?and?linolenic?acid?production?during?rancidity，?while?GDSL1?and?KAT?might?inhibit?linolenic?acid?production，?suggesting?that?GDSL2，?GDSL7，?SAD2?and?LACS9?are?the?key?genes?causing?oil?palm?rancidity?after?harvest.?The?aim?of?this?study?is?to?provide?candidate?genes?for?improving?unsaturated?fat?content?and?altering?fatty?acid?composition?by?using?molecular?biotechnology，?and?to?provide?theoretical?reference?for?screening?unsaturated?fat?and?storability?varieties.

Keywords：?oil?palm;?free?fatty?acids;?synthesis;?transcriptomics;?metabolomics

DOI：?10.3969/j.issn.1000-2561.2024.02.002

油棕是世界上產(chǎn)油效率最高的熱帶木本油料作物，其產(chǎn)油量可達(dá)9?t/hm2。在中國(guó)，油棕主要分布在海南、云南、廣東等地區(qū)[1]。棕櫚油是世界上生產(chǎn)、消費(fèi)和貿(mào)易最大的植物油，可做食用油、高級(jí)人造奶油、肥皂、潤(rùn)滑油等，用途非常廣泛[2]。油棕果實(shí)的中果皮積累的油脂高達(dá)90%[3]。棕櫚油主要含棕櫚酸、硬脂酸等飽和脂肪酸（saturated?fatty?acid，?SFA）和油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸（unsaturated?fatty?acid，?UFA）。在油棕果實(shí)發(fā)育和成熟階段，脂肪酶活性增加4100倍[4]，果實(shí)采收后高脂肪酶活性促進(jìn)釋放游離脂肪酸（FFA），使油迅速酸化，油棕果穗采后24?h之內(nèi)需加工處理，否則游離脂肪酸含量升高，引起棕櫚油酸敗，油品變差[5]。

目前已有研究表明，編碼長(zhǎng)鏈脂肪?；o酶A合成酶（long?chain?acyl-CoA?synthetase，?LACS）、脂酰-?；d體蛋白硫酯酶（fatty?acyl-ACP?thioesterase，?FAT）、β-酮酰ACP合酶（β-ketoacyl-ACP?synthase，?KAS）、二酰甘油乙酰轉(zhuǎn)移酶（diacylglycerol?acyltransferase，?DGAT）、磷脂二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（phospholipid?diac?ylglycerol?acyltransferase，?PDAT）、硬脂酰－?；d體蛋白脫飽和酶基因（stearoyl-ACP?desaturase，?SAD）、GDSL脂肪酶（GDSL?esterase/lipase，?GDSL）、3-酮脂酰輔酶A硫解酶（3-ketoacyl-CoAthiolase，?KAT）等基因調(diào)控脂肪酸合成。LACS在脂質(zhì)合成和降解過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]，EgLACS4、EgLACS9與油棕油脂代謝有關(guān)[7]；FAT分為FATA和FATB兩類，在脂肪從頭合成途徑發(fā)揮重要作用，AtFATB在SFA合成中至關(guān)重要[8]，而AtFATA把油酸從ACP載體上水解成游離脂肪酸，催化質(zhì)體中脂肪酸的生物合成過(guò)程中硬脂酸和油酸的形成[9]，EgFATB基因的表達(dá)促進(jìn)油棕果肉中游離脂肪酸的生物合成[10]；KAS是啟動(dòng)脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，KASⅡ酶催化C16：0-ACP轉(zhuǎn)化為C18：0-ACP，決定C16和C18脂肪酸比例。DGAT是甘油三酯合成途徑中的限速酶，對(duì)植物甘油三酯和脂肪酸的積累至關(guān)重要[11]；PDAT是植物三酰甘油（TAG）合成的關(guān)鍵酶。大多數(shù)植物質(zhì)體中合成的脂肪酸主要是油酸[12]，重組油棕中果皮的油脂合成中，EgDGAT和EgPDAT功能相似，且發(fā)揮重要作用[13]；參與糖酵解、三羧酸循環(huán)和脂肪酸生物合成途徑的EgKASI、EgKAS基因在高產(chǎn)油棕中表達(dá)上調(diào)[14]；油料作物脂肪酸合成與代謝機(jī)制研究，可提高油料作物的含油量、品質(zhì)和提取重要的脂肪酸代謝物[15]；飽和脂肪酸所占比例的提高是由于不飽和脂肪酸減少所致[16]；KAT在脂肪酸合成和分解代謝中起至關(guān)重要的作用，是脂肪酸β-氧化的最后一步；通過(guò)分子育種或基因工程的手段下調(diào)AtGDSL酶基因家族的表達(dá)可提高油料作物種子油脂含量[17]。EgSAD1促進(jìn)油酸的合成[18]，EgSAD1可能催化棕櫚酸轉(zhuǎn)化為不飽和脂肪；隨著果實(shí)成熟，油棕不飽和脂肪酸含量升高，飽和脂肪酸含量下降，更高的C18：C16水平和更高的去飽和脂肪酸是通過(guò)降低“壞脂質(zhì)”飽和棕櫚酸（C16：0）水平獲得更健康棕櫚油的2個(gè)關(guān)鍵育種目標(biāo)[19]；油棕油酸含量與棕櫚酸呈極顯著負(fù)相關(guān)，預(yù)示著棕櫚酸含量的下降可能會(huì)促使油酸含量的升高[20]。

不同類型油棕的不飽和脂肪酸含量差異顯著，實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果顯示無(wú)籽型油棕不飽和脂肪酸高達(dá)70%。目前，關(guān)于油棕脂肪酸的變化與不同發(fā)育時(shí)期的關(guān)系及調(diào)控其脂肪酸合成的關(guān)鍵基因的研究較少，當(dāng)前研究主要集中在自然發(fā)育階段[21-22]，且油棕脂肪酸代謝相關(guān)的研究多集中在脂肪酸種類組成和關(guān)鍵基因的表達(dá)調(diào)控上，而果實(shí)發(fā)育及采后貯藏過(guò)程中關(guān)鍵酶基因與游離脂肪酸含量的關(guān)系的研究鮮有報(bào)道。本研究采用轉(zhuǎn)錄代謝聯(lián)合分析油棕果實(shí)發(fā)育和采后貯藏過(guò)程中游離脂肪酸代謝物的差異變化和差異基因，初步確定油棕果實(shí)中調(diào)控游離脂肪酸合成的關(guān)鍵候選基因，為篩選高不飽和脂肪酸和抗酸敗的品種提供理論參考，也可作為油脂品質(zhì)遺傳改良的優(yōu)異靶標(biāo)。

1??材料與方法

1.1??材料

供試材料為無(wú)籽型油棕果實(shí)，采自海南省文昌市中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所基地。選取3個(gè)自然發(fā)育時(shí)期[授粉后95?d（脂肪酸積累初期，MS1）、125?d（脂肪酸積累迅速增長(zhǎng)期，MS2）和185?d（脂肪酸積累穩(wěn)定期即采后0?h，MS3）]和2個(gè)采后貯存時(shí)期[采后24?h（MS4）、采后36?h（MS5）]的樣品，每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。將采集的樣品立刻置于液氮中冷卻，并保存于?80?℃冰箱中備用。

1.2??方法

1.2.1??脂質(zhì)和酸敗代謝組的測(cè)定及分析??參照張淑巖等[10]的方法，獲得不同樣本的質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后，對(duì)其進(jìn)行定性和定量分析。通過(guò)正交偏最小二乘法判別分析和差異倍數(shù)值相結(jié)合的方法篩選組間差異代謝物。對(duì)各游離脂肪酸代謝物含量歸一化處理，并進(jìn)行聚類熱圖分析，得到各種代謝物含量的變化趨勢(shì)。

1.2.2??總RNA提取及高通量測(cè)序??使用植物總RNA提取試劑盒提取油棕RNA。對(duì)構(gòu)建好的測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)檢，庫(kù)檢合格后，用Illumina?HiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3??轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析及差異表達(dá)基因分析??使用HISAT2將原始序列與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，采用DESeq?2軟件包分析差異表達(dá)基因（differentially?expressed?genes，?DEGs），篩選閥值為錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false?discovery?rate，?FDR）<0.05且|log2Fold?Change|≥1。對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG生物途徑顯著性富集分析。

1.2.4??轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)聯(lián)合分析??京都基因與基因組百科全書（KEGG）既是系統(tǒng)分析基因功能的數(shù)據(jù)庫(kù)，也是系統(tǒng)分析代謝功能的數(shù)據(jù)庫(kù)。將獲得的差異基因及代謝物同時(shí)映射到KEGG通路上，利用基因和代謝物在所有樣本中的定量值進(jìn)行相關(guān)性分析，選取相關(guān)性系數(shù)≥0.7的差異基因和差異代謝物用于后續(xù)分析。通過(guò)KEGG富集通路找到關(guān)鍵的候選基因并通過(guò)NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)酶基因進(jìn)行注釋。

1.3??數(shù)據(jù)處理

使用SPSS?20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）和差異顯著性檢驗(yàn)（Duncans法）。

2??結(jié)果與分析

2.1??油棕果肉的游離脂肪酸合成和酸敗分析

2.1.1??油棕游離脂肪酸含量在不同發(fā)育時(shí)期的動(dòng)態(tài)分析??由表1可知，油棕果中游離脂肪酸代謝物主要是由棕櫚酸（palmitic?acid，C16：0）、硬脂酸（stearic?acid，C18：0）等17種飽和脂肪酸和棕櫚油酸（palmitoleic?acid，C16：1）、油酸（oleic?acid，C18：1）、亞油酸（linoleic?acid，C18：2）等13種不飽和脂肪酸組成。在油棕果肉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，脂肪酸積累初期，即MS1期，主要以飽和脂肪酸（SFA）為主，占總脂肪酸的75.69%；脂肪酸積累中后期（MS3期），不飽和脂肪酸（UFA）為主要的脂肪酸類型，占總脂肪酸的81.74%；MS3～MS5不飽和脂肪酸占總脂肪酸比例呈下降趨勢(shì)，其中MS5期時(shí)，該比值下降至73.12%，而飽和脂肪酸，在MS5時(shí)期上升至26.88%（圖1A）。在MS1～MS3時(shí)期，UFA/SFA呈上升趨勢(shì)，于MS3時(shí)期達(dá)到最高值4.48，MS4～MS5時(shí)期，UFA/SFA呈下降趨勢(shì)，在MS5期為2.72（圖1B）。游離脂肪酸總含量及UFA總含量在MS1～MS3階段逐漸增加，而在MS4階段呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而在MS5階段又急劇升高，分別達(dá)到66?475.12?nmol/g和48?605.78?nmol/g。SFA含量在MS2時(shí)期先顯著增加后緩慢降低，而在MS5階段又上升至17?869.34?nmol/g（圖1C）。油酸、亞油酸、硬脂酸在MS1～MS3階段含量顯著升高，其中，油酸含量在MS4～MS5時(shí)期均減少，而亞油酸與硬脂酸含量在MS4階段減少，卻在MS5階段顯著增加。棕櫚酸含量在MS1～MS2時(shí)期增加，MS3～MS4時(shí)期減少，而MS5時(shí)期其含量又增加（圖1D）。

2.1.2??油棕果肉不同發(fā)育和酸敗時(shí)期的游離脂肪酸代謝物差異分析??將油棕果實(shí)MS1～MS5時(shí)期進(jìn)行兩兩比較，得到不同分組間游離脂肪酸代謝物的變化（圖2A）。MS1與MS2～MS5的兩兩比較中，上調(diào)的差異代謝物分別為24、23、23、25個(gè)，下調(diào)的差異代謝物分別為0、1、2、1個(gè)；MS2與MS3～MS5的比較中上調(diào)的差異代謝物分別是2、0、14個(gè)，而下調(diào)的差異代謝物分別為2、2、2個(gè)；MS3與MS4、MS5的比較顯示上調(diào)差異代謝物為0、13個(gè)，下調(diào)的分別有1、1個(gè)；MS4?vs?MS5顯示有且僅有13個(gè)上調(diào)的差異代謝物。通過(guò)韋恩圖分析發(fā)現(xiàn)，MS1?vs?MS4與MS1?vsMS5存在差異代謝物最多，為24個(gè)；MS1?vs?MS4與MS2?vs?MS5存在13個(gè)差異代謝物；MS1?vs?MS4與MS3?vs?MS5存在11個(gè)差異代謝物；MS3?vs?MS4與MS4?vs?MS5存在12個(gè)差異代謝物；MS1?vs?MS5與MS2?vs?MS5存在14個(gè)差異代謝物；MS1?vs?MS5和MS3?vs?MS5存在12個(gè)差異代謝物；MS2?vs?MS5和MS3?vs?MS5存在14個(gè)差異代謝物（圖2B）。

對(duì)油棕果肉MS1～MS5時(shí)期的各游離脂肪酸代謝物的含量進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)Z-score歸一化處理的30種游離脂肪酸被分為2組。在第1組（Group?1）中，3種游離脂肪酸在MS1～MS5的變化呈下降趨勢(shì)，即在MS1和MS2時(shí)期的含量較高，而MS5時(shí)期含量最低。第2組（Group?2）27種游離脂肪酸含量在MS1～MS5時(shí)期總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中，MS1時(shí)期含量最低，而MS5時(shí)期達(dá)最高值（圖3）。由此可知，MS4為游離脂肪酸降解穩(wěn)定時(shí)期，MS5為游離脂肪酸快速降解時(shí)期，判別依據(jù)為油酸、亞油酸、亞麻酸、棕櫚酸、硬脂酸、棕櫚油酸的含量變化。

2.2??不同發(fā)育階段的顯著差異表達(dá)基因分析

將MS1～MS5時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的原始Reads進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾、比對(duì)和拼接以及將樣品進(jìn)行兩兩分組比較，依據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)，分別得到顯著上調(diào)和下調(diào)的DEGs。如圖4所示，MS1與MS2～MS5、MS2與MS3～MS5、MS3與MS4～MS4及MS4?vs?MS5的比較結(jié)果表明，上調(diào)DEGs分別為：2681、3046、3128、3580、1982、2387、

圖4??油棕果肉不同時(shí)期的差異基因統(tǒng)計(jì)

Fig.?4??Differential?gene?statistics?of?oil?palm?pulp?in?different?periods

2902、858、1397、876個(gè)；下調(diào)DEGs分別為：3584、4110、5243、5254、2299、4347、4269、2487、2476、389個(gè)（圖4A）。隨著果肉的成熟，DEGs數(shù)量先上升再下降且表達(dá)下調(diào)基因的占比逐漸增加；隨著果實(shí)的酸敗時(shí)間增加，表達(dá)下調(diào)的DEGs數(shù)量增加，且下調(diào)的基因數(shù)量始終大于上調(diào)基因的數(shù)量，說(shuō)明大部分基因的表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。根據(jù)上述兩兩分組比較的結(jié)果繪制韋恩圖（圖4B），結(jié)果顯示，在MS1～MS5時(shí)期各分組間共同存在1710個(gè)DEGs。

2.3??代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)關(guān)聯(lián)分析

采用KEGG聯(lián)合分析脂肪酸代謝組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，30種游離脂肪酸中，有17種存在顯著差異，這些脂肪酸分別注釋到脂肪酸代謝、亞油酸代謝、脂肪酸降解、脂肪酸生物合

成及不飽和脂肪酸的生物合成等代謝通路上。其中，棕櫚油酸、油酸、棕櫚酸等6種游離脂肪酸注釋到脂肪酸生物合成途徑中，脂肪酸代謝和脂肪酸降解途徑中僅發(fā)現(xiàn)棕櫚酸這一類脂肪酸。不飽和脂肪酸的生物合成途徑相關(guān)的游離脂肪酸包括油酸、亞油酸等6種UFA與棕櫚酸、硬脂酸等5種SFA。通過(guò)比較差異表達(dá)基因的代謝途徑，脂肪酸生物合成途徑中富集了57個(gè)顯著差異表達(dá)基因，脂肪酸代謝途徑中富集了71個(gè)顯著差異表達(dá)基因，脂肪酸降解途徑中富集了50個(gè)顯著差異表達(dá)基因，亞麻酸代謝途徑中富集了59個(gè)顯著差異表達(dá)基因（圖5）。從脂肪酸生物合成、脂肪酸代謝、脂肪酸降解、不飽和脂肪酸生物合成、α-亞麻酸代謝5條途徑上共99個(gè)顯著差異表達(dá)基因，挑選了32個(gè)顯著差異基因用于后續(xù)分析。

根據(jù)32個(gè)顯著差異表達(dá)基因的Nr注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)，油棕果MS1～MS5過(guò)程中高表達(dá)量的酶基因有LACS、FAT、KAS、DGAT、PDAT、SAD、GDSL、KAT。從15個(gè)關(guān)鍵基因表達(dá)量動(dòng)態(tài)變化可知，在MS1～MS3時(shí)期，LACS4、LACS4-X1酶基因表達(dá)量的變化趨勢(shì)基本一致，均在MS3時(shí)期高表達(dá)；FATA、FATB、KASⅠ、KASⅡ、SAD1酶基因表達(dá)先上調(diào)后下調(diào)，最高表達(dá)出現(xiàn)在MS2時(shí)期；DGAT、PDAT表達(dá)量變化趨勢(shì)呈先降低后升高，在MS1時(shí)期最高，MS2時(shí)期最低。在MS3～MS5階段，隨著采后儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)，GDSL2、GDSL7基因表達(dá)量降低，MS5時(shí)期達(dá)到最低，GDSL1、KAT基因的表達(dá)與之相反；LACS9、SAD2基因在MS3期表達(dá)顯著上調(diào)，在MS4時(shí)期后表達(dá)顯著下調(diào)（圖6～圖8）。

將15個(gè)酶基因與篩選到的差異代謝物進(jìn)行相關(guān)性分析（表2和表3），結(jié)果表明，15個(gè)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量與油棕果實(shí)的6種主要游離脂肪酸含量呈顯著相關(guān)性。在MS1～MS3時(shí)期，LACS4、LACS4-X1、FATA、FATB、KASⅠ、KASⅡ、SAD1的表達(dá)與油酸、亞油酸、棕櫚油酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻酸含量呈顯著正相關(guān)，即這7個(gè)酶基因的表達(dá)對(duì)油棕果實(shí)脂肪酸的合成和累積具有促進(jìn)作用；DGAT、PDAT的表達(dá)與之相反，起到抑制作用。在MS3～MS5時(shí)期，GDSL1、KAT酶基因在油棕果實(shí)中高表達(dá)，與棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、亞油酸及亞麻酸這5種脂肪酸含量呈正相關(guān)，與油酸呈顯著負(fù)相關(guān)；GDSL2、GDSL7、SAD2、LACS9表達(dá)與上述5種脂肪酸含量呈負(fù)相關(guān)，與油酸呈極顯著正相關(guān)。說(shuō)明GDSL1、KAT的表達(dá)對(duì)這5種游離脂肪酸合成具有促進(jìn)作用，對(duì)油酸合成具有抑制作用；而GDSL2、GDSL7、SAD2、LACS9的表達(dá)抑制5種游離脂肪酸積累，而促進(jìn)油酸合成。

3??討論

油棕含油量與脂肪酸代謝相關(guān)酶基因表達(dá)水平有關(guān)[12]。油棕果實(shí)收獲后，高活性的脂肪酶會(huì)導(dǎo)致果肉產(chǎn)生大量游離脂肪酸，當(dāng)游離脂肪酸含量大于5%時(shí)，將嚴(yán)重影響商品油的質(zhì)量[8]。本研究中，在自然發(fā)育過(guò)程中，不飽和脂肪酸占比呈

上升趨勢(shì)，采后儲(chǔ)藏過(guò)程中，不飽和脂肪酸占總脂肪酸含量比呈下降趨勢(shì)，可能是在油棕果實(shí)貯藏過(guò)程中脂質(zhì)在脂肪酶的催化作用下發(fā)生水解反應(yīng)，游離脂肪酸發(fā)生降解，轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)。

UFA/SFA在自然發(fā)育時(shí)期呈上升趨勢(shì)，酸敗過(guò)程中，SFA與UFA總量在采后24?h降到最低，而在采后36?h時(shí)升高且高于剛采收時(shí)，推測(cè)24?h為油棕氧化酸敗的臨界點(diǎn)，需要后期實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

前人研究發(fā)現(xiàn)BnLACS4與AtLACS9參與甘藍(lán)型油菜及擬南芥種子脂質(zhì)生物合成[23-24]。本研究表明LACS4、LACS4-X1表達(dá)量與油棕果實(shí)成熟度密切相關(guān)，LACS4正向調(diào)控6種游離脂肪酸合成。LACS9對(duì)6種游離脂肪酸的調(diào)控表現(xiàn)出多效性，即高表達(dá)LACS9促進(jìn)油酸合成，而抑制其他5種游離脂肪酸的合成。TcFATA和TcFATB1表達(dá)量與可可果實(shí)中的油酸及棕櫚酸含量呈正相關(guān)[25]，而干擾擬南芥AtFATB1基因的表達(dá)，會(huì)降低棕櫚酸和總飽和脂肪酸的含量[8]，本研究與前人研究結(jié)果一致，即LACS9表達(dá)高，油酸含量也增加；FATA和FATB表達(dá)量變化趨勢(shì)與棕櫚酸和總飽和脂肪酸含量變化趨勢(shì)相同，說(shuō)明FATA和FATA可能是調(diào)控棕櫚酸和總飽和脂肪的關(guān)鍵酶基因。KASⅡ在許多植物中被證實(shí)能催化C16脂肪酸延長(zhǎng)，生成了C18脂肪酸，進(jìn)而促進(jìn)不同脂肪酸之間的轉(zhuǎn)換。在擬南芥、煙草、大豆中過(guò)表達(dá)KASⅡ基因，可以顯著提高硬脂酸、油酸、亞麻酸含量，降低棕櫚酸含量[26-27]，本研究結(jié)果與前人研究大體一樣，說(shuō)明KAS酶將油棕脂肪酸C16催化為C18。AsPDAT和AsDGAT共同調(diào)控白沙蒿種子TAG的合成，過(guò)表達(dá)的DGAT2、PDAT促進(jìn)亞油酸的積累[28]。本研究結(jié)果顯示，隨著果實(shí)成熟，不飽和脂肪酸含量升高，飽和脂肪酸含量下降。DGAT、PDAT表達(dá)量隨著油棕果實(shí)成熟而下降，與6個(gè)游離脂肪酸呈負(fù)相關(guān)，這與前人報(bào)道的不同，表明DGAT、PDAT在油棕中具有與其他物種不同的調(diào)控模式。SAD在調(diào)控植物油脂中飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比例中發(fā)揮重要作用[29]，提高SAD基因表達(dá)水平，可增加油酸含量[30]。本研究中，自然發(fā)育過(guò)程中SAD1隨著果實(shí)成熟表達(dá)量上升，不飽和脂肪酸上升，飽和脂肪酸下降，棕櫚酸變化趨勢(shì)相同，預(yù)示著SAD1可能催化棕櫚酸轉(zhuǎn)化為不飽和脂肪酸。隨著采后時(shí)間增加，SAD2表達(dá)下調(diào)，聯(lián)合代謝分析顯示該基因與油酸呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明SAD2低表達(dá)阻礙油棕果實(shí)油酸合成。GDSL基因能夠分解油脂，通過(guò)提高其表達(dá)量可提高油料作物種子油脂含量[17，?31-32]。GDSL還參與小麥胚芽脂質(zhì)水解酸敗反應(yīng)[33]。本研究中，GDSL1與油酸呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，即隨著采后時(shí)間延長(zhǎng)，其表達(dá)量上升，暗示GDSL1抑制油棕果實(shí)油酸氧化速率。本研究發(fā)現(xiàn)油棕GDSL家族中的GDSL1和GDSL2、GDSL7的作用不同，且GDSL1表達(dá)量明顯高于GDSL2和GDSL7，這可能是導(dǎo)致采后油棕果實(shí)油酸下降的關(guān)鍵原因，預(yù)示同一家族基因可能存在不同的生物學(xué)功能。KAT基因編碼分解硫解酶，在脂肪酸合成和分解代謝中起到至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，抑制金藻中KAT基因的表達(dá)量可提高其脂肪酸的含量[34]。本研究中，KAT隨著采后時(shí)間增加，其表達(dá)量上升，而油酸含量下降，預(yù)示KAT是影響油棕果實(shí)采后油酸氧化的關(guān)鍵酶之一。

綜上所述，推測(cè)LACS4、LACS4-X1、SAD1上調(diào)在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中促進(jìn)不飽和脂肪酸合成，DGAT、PDAT下調(diào)可能與不飽和脂肪酸積累密切相關(guān)，F(xiàn)AT和KAS基因家族促進(jìn)脂肪酸積累；GDSL1、KAT可能是抑制油酸氧化的關(guān)鍵酶基因，LACS和SAD基因家族在油棕自然發(fā)育和采后貯藏中同時(shí)調(diào)控脂肪酸代謝。本研究篩選出的LACS4、LACS4-X1、SAD1、GDSL1、DGAT、PDAT有望作為油棕油脂品質(zhì)遺傳改良的關(guān)鍵候選基因，為培育高不飽和脂肪酸和抗酸敗油棕品種提供理論基礎(chǔ)。

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