付濤,林小雯,李欣培,Hasan M.B.

(1.西安博恩生物科技有限公司,西安 710077;2.西安交通大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,生物醫(yī)學(xué)信息工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西安 710049)

0 引言

細(xì)菌感染已成為醫(yī)療中的一個(gè)重要公共衛(wèi)生問題。目前,控制院內(nèi)感染和防止植入型醫(yī)療器械表面形成微生物被膜最有效的方法是:在醫(yī)療器械表面涂覆抗菌涂層[1-2]。銀被證明是一種有效的抗菌材料,對多種耐藥菌具有廣譜抗菌作用[3]。研究者把銀添加到氣相沉積陶瓷薄膜,特別是類金剛石碳(diamond-like carbon,DLC)薄膜中,以期結(jié)合DLC膜優(yōu)異的力學(xué)性能、良好的化學(xué)惰性及生物相容性和納米銀的優(yōu)異抗菌功能[4-7],用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。然而,銀在薄膜沉積和陳化過程中會(huì)從碳及其它陶瓷基體中析出[6,8-10],影響膜層的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和生物相容性。

研究表明,在磁控濺射過程中加入乙炔、甲烷氣體,可以在DLC薄膜中引入C—H鍵,即產(chǎn)生氫化[8,11-13]。但是,乙炔前驅(qū)體對含銀DLC薄膜銀析出和抗菌性能的影響還未見報(bào)道。本研究采用磁控濺射方法制備了含銀的氫化DLC薄膜,通過控制乙炔流速和銀靶電流調(diào)節(jié)膜層顯微結(jié)構(gòu),著重探究了乙炔前驅(qū)體對薄膜表面形貌、顯微硬度和抗菌性能的影響。

1 實(shí)驗(yàn)方法

本研究采用磁控濺射鍍膜機(jī)在拋光的316L不銹鋼片(11 mm×11 mm×0.5 mm)和硅片上沉積含銀的DLC薄膜?；w經(jīng)過脫脂、超聲清洗后,在流動(dòng)的氮?dú)庵写蹈?然后固定在樣品架上。鍍膜機(jī)含有3個(gè)石墨靶、2個(gè)鉻靶和1個(gè)銀靶(純度>99.9%)?；w經(jīng)過等離子體清洗和沉積Cr-C中間層(厚約0.4 μm)后,沉積含銀DLC薄膜,參數(shù)分別為:氬氣流速80 sccm,石墨靶電流4.5 A,銀靶電流0、0.2、0.4和0.6 A,乙炔流速0、10、20、30和40 sccm,偏置電壓-60 V,基體支架轉(zhuǎn)速10 rpm。涂層試樣分別記為DLC(無氫薄膜)和SxCy(含氫薄膜,x、y分別代表銀靶電流和乙炔流速,見表1)。此外,本研究還制備了純銀薄膜試樣作為對照樣。

表1 DLC和含銀DLC試樣參數(shù)

采用色差計(jì)(CS-210)測定試樣的Lab值,其中L代表亮度;采用表面輪廓儀和臺(tái)階法(Bruker DektakXT)測量薄膜的厚度;采用掃描電鏡(SEM,Gemini 500)觀察表面形貌,并用電子能譜(EDX)檢測元素組成;采用拉曼光譜(背散射, 波長633 nm, 入射功率17 mW, Horiba Jobin YvonHR800)分析薄膜的顯微結(jié)構(gòu);采用顯微硬度計(jì)(Fischerscope H100C,維氏金剛石金字塔壓頭, 試驗(yàn)載荷20 mN)測定薄膜的硬度。

大腸桿菌是一種典型的革蘭氏陰性菌,常見于生物材料相關(guān)感染部位,是醫(yī)院獲得性感染的來源之一。因此,本研究采用平板計(jì)數(shù)法評價(jià)薄膜試樣對大腸桿菌的抑菌性能。取50 μL大腸桿菌懸浮液加入到5 mL液體LB培養(yǎng)基中,過夜培養(yǎng)至對數(shù)期。將10 μL大腸桿菌懸浮液滴在紫外光滅菌后的試樣表面,并快速用無菌過濾膜覆蓋表面。在室溫下暗處放置3 h后,用3 mL滅菌水沖洗試樣,充分振蕩,收集存活的細(xì)菌。把100 μL的細(xì)菌懸浮液滴加在固體LB培養(yǎng)基上,用無菌涂布器均勻涂布,37 ℃有氧培養(yǎng)24 h后,觀察和拍照。DLC和銀膜試樣分別作為陰性對照和陽性對照。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)和成分分析

所有試樣的膜層都具有良好的附著性,表面平滑。無氫DLC膜呈黑色,但加入銀后(試樣S0.2C0和S0.4C0),黑度有所降低,亮度值L見表1。在恒定銀電流(0.2和0.4 A)下,在沉積氣氛中加入乙炔前驅(qū)體,膜亮度降低,這與銀含量下降、乙炔引起膜層結(jié)構(gòu)改變有關(guān)。其中,試樣S0.2C40的亮度最低(L=35.5),即黑度最高。然而,所有含銀試樣的亮度都較高,特別是試樣S0.4C0和S0.6C30,其銀靶電流/乙炔流速比相對較高。這表明在薄膜沉積(襯底溫度約120°C)和陳化期間膜層中的銀向表面析出,由表1可知,銀的析出也提高了薄膜的導(dǎo)電性。

薄膜試樣的拉曼光譜見圖1?？梢?試樣DLC、S0.2C0、S0.2C10、S0.2C20和S0.2C30具有典型的DLC拉曼光譜,但是試樣S0.2C40的光譜受到激光照射產(chǎn)生的熒光信號的影響。D峰(約在1 350 cm-1)和G峰(約在1 550～1 600 cm-1)均是碳原子晶體的拉曼特征峰,D峰代表的是碳原子晶體的缺陷,G峰代表的是碳原子sp2雜化的面內(nèi)伸縮振動(dòng)[12,14]。采用XPS PeakFit軟件對拉曼光譜進(jìn)行擬合,可得到G峰位置、半高寬(FWHM)和ID/IG面積比。隨著C2H2流量的增加(試樣S0.2C0-S0.2C30, 見表2),G峰變寬、向低波數(shù)移動(dòng),同時(shí)ID/IG比值下降。半高寬增加可能與sp2結(jié)合的碳簇平均晶體尺寸的下降有關(guān)[15]。而G峰向低波數(shù)移動(dòng)、ID/IG比值下降,則可能表明隨著C2H2流量的增加,膜層的sp2/sp3比下降(即sp2鍵轉(zhuǎn)化為sp3鍵)[15-16]。相應(yīng)地,隨著C2H2流量的增加,由于sp3鍵和C—H鍵含量升高,薄膜由導(dǎo)電變?yōu)椴粚?dǎo)電(S0.2C20-S0.2C40, 見表1)。

圖1 硅基體上DLC-Ag薄膜試樣的拉曼光譜

表2 DLC-Ag薄膜試樣的G峰位置、半高寬和ID/IG比

隨著銀靶電流的升高,薄膜的G峰位置、半高寬(FWHM)和ID/IG比呈現(xiàn)相反的變化趨勢(S0.2C30、S0.4C30和S0.6C30,見表2)。銀靶電流的升高將促進(jìn)sp3鍵向sp2鍵的轉(zhuǎn)變,這與文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致。相應(yīng)地,由于銀含量和sp2鍵含量的增加,DLC-Ag薄膜從不導(dǎo)電轉(zhuǎn)變?yōu)閷?dǎo)電(見表1)。

薄膜試樣的SEM表面圖像見圖2?？梢?在銀靶電流0.2 A時(shí),薄膜表面銀顆粒的尺寸和分布都不均勻。當(dāng)乙炔流量為30 sccm時(shí),銀顆粒數(shù)量和尺寸明顯減少,見圖2(a)、(b),這與文獻(xiàn)報(bào)道的銀顆粒數(shù)量和尺寸隨乙炔流量升高而降低的結(jié)果一致[11,17]。在銀靶電流升高到0.4 A時(shí),由于膜層銀含量較高、銀顆粒距離近而發(fā)生Ostwald熟化,晶粒的長大使顆粒數(shù)量減少。因此,當(dāng)乙炔流量為30 sccm時(shí),銀顆粒的尺寸減小,但數(shù)量卻增多,見圖2(c)、(d)。色差測試時(shí),薄膜的亮度與銀顆粒的反光現(xiàn)象有關(guān)。因此,L值與測試區(qū)域表面銀顆粒的總表面積相對應(yīng)。特別地,試樣S0.4C30的銀含量(6.3 at%,見表1)僅為試樣S0.4C0(13.5 at%)的一半,但前者表面銀顆粒的總表面積和L值遠(yuǎn)低于后者。當(dāng)鍍膜氣氛中添加乙炔時(shí),在試樣轉(zhuǎn)到銀靶對應(yīng)位置時(shí),銀和碳?xì)浣M分同時(shí)沉積,使得銀的擴(kuò)散和析出得到有效抑制。

圖2 不銹鋼基體上薄膜試樣的SEM形貌

2.2 硬度和抗菌性能

銀和乙炔前驅(qū)體的加入降低了DLC薄膜的顯微硬度,但由表1可知,所有薄膜試樣的硬度都在820 HV以上,遠(yuǎn)高于不銹鋼基體(約250 HV)。

本研究采用瓊脂平板計(jì)數(shù)法評價(jià)薄膜試樣對大腸桿菌的抗菌性能,材料與細(xì)菌的作用時(shí)間為3 h。測試結(jié)果見圖3,可見無氫DLC薄膜表面細(xì)菌能夠正常生長,含銀薄膜試樣S0.2C0、S0.2C30、S0.4C0和S0.4C30的細(xì)菌菌落明顯減少,且薄膜試樣S0.2C0、S0.4C0和S0.4C30的抗菌活性優(yōu)于銀膜。銀納米顆?？赏ㄟ^表面氧化釋放銀離子。銀離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),使細(xì)胞產(chǎn)生活性氧,起到抗菌作用。據(jù)報(bào)道,DLC-Ag薄膜在鹽溶液中可形成C-Ag微電偶,銀作為陽極,增強(qiáng)了銀離子的釋放[18]。

圖3 不銹鋼基體薄膜試樣對大腸桿菌的平板計(jì)數(shù)法抗菌測試結(jié)果

在DLC膜中加入銀會(huì)影響薄膜的力學(xué)性能、抗菌性能及細(xì)胞相容性。例如,把含銀DLC薄膜的銀含量提高到2 at%以上時(shí),膜層對大腸桿菌有較好的殺菌性能,但成骨細(xì)胞的活性下降[6];用于促進(jìn)骨整合的殺菌DLC涂層,其銀含量應(yīng)不高于10 at%[7]。此外,由于銀在碳中的溶解度低,且二者無法形成碳化物,DLC-Ag薄膜在沉積和陳化過程中會(huì)形成復(fù)合結(jié)構(gòu)。銀在薄膜表面的偏析和富集將改變DLC-Ag膜的外觀和生物學(xué)性能。本研究在沉積氣氛中添加乙炔,膜層中的銀被稀釋,使銀偏析得到有效抑制,有利于抑制膜層銀離子釋放、增強(qiáng)薄膜抗菌持久性和改善細(xì)胞相容性。

3 結(jié)論

本研究在不同銀靶電流下,加入乙炔前驅(qū)體,采用磁控濺射法制備了DLC-Ag薄膜。隨著銀含量的增加,銀的析出增強(qiáng)、含銀薄膜更亮、導(dǎo)電性更好、硬度降低。乙炔前驅(qū)體的加入,降低了銀含量,抑制了銀析出,使含銀薄膜變暗,導(dǎo)電性下降。即使銀含量最低的試樣(0.8 at%)也表現(xiàn)出對大腸桿菌的良好抗菌性能。本研究的含銀DLC薄膜具有高硬度、高黑度和良好的抗菌性能,在生物醫(yī)學(xué)器件等領(lǐng)域?qū)⒕哂休^好的應(yīng)用前景。