王雄雄,張圣權(quán),孫靜,毛傳樨

(湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 湖北 武漢 430062)

0 引言

微管是一種具有極性的細(xì)胞骨架,由α,β蛋白亞基組成的微管蛋白二聚體,微管蛋白二聚體頭尾相接形成微管原纖維,由13根這樣的原纖維縱向排列形成微管的壁。并且微管參與細(xì)胞分裂、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌、形態(tài)構(gòu)成、組織器官發(fā)育等多種重要的生物學(xué)過(guò)程[1]。在微管的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)過(guò)程中,有兩類(lèi)蛋白參與其調(diào)節(jié)過(guò)程[2]。一類(lèi)是微管結(jié)合蛋白(microtubule associated protein, MAP)(如tau、MAP1和MAP4)和微管末端協(xié)助微管聚合的因子(如EB1和CLIP170)等;另一類(lèi)是參與微管剪切的蛋白,包括Spastin、Katanin、Fidgetin等。

Tau作為重要的微管結(jié)合蛋白,促進(jìn)微管的穩(wěn)定,主要在中樞和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中表達(dá),并富集于神經(jīng)元軸突中[3]。Tau蛋白在結(jié)構(gòu)上可以分為4個(gè)區(qū)域:N端投射區(qū)、脯氨酸富集區(qū)、微管結(jié)合結(jié)構(gòu)域、C端域。Tau對(duì)于微管的穩(wěn)定性就是通過(guò)微管結(jié)合結(jié)構(gòu)域來(lái)實(shí)現(xiàn)的,對(duì)于神經(jīng)元的發(fā)育和軸突的正常運(yùn)輸發(fā)揮著重要作用[4-5]。

早在20世紀(jì)80年代就有研究報(bào)道,不可溶和過(guò)度磷酸化的tau是神經(jīng)纖維纏結(jié)的主要成分,是阿爾茲海默癥的病理特征之一[6-9]。體外生化研究表明,過(guò)度磷酸化的tau不與微管結(jié)合,導(dǎo)致微管穩(wěn)定性降低[10-11]。此外,tau突變導(dǎo)致17號(hào)染色體相關(guān)的帕金森綜合征的額顳葉癡呆中,其中一些突變已經(jīng)被報(bào)道降低微管和tau結(jié)合親和力[12-13],強(qiáng)調(diào)了tau的正常微管穩(wěn)定性動(dòng)能喪失在神經(jīng)退行性tau蛋白病的發(fā)病機(jī)制中的重要性。除了阿爾茲海默癥外,還有一些退行性疾病有tau的包涵體,這類(lèi)tau相關(guān)的疾病統(tǒng)稱(chēng)為T(mén)auopathies[14], 如額顳葉變性癥、嗜銀顆粒病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥和慢性創(chuàng)傷性腦病等[15-17]。由于tau與很多神經(jīng)退行性疾病相關(guān),研究tau的致病機(jī)制為治療相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病提供重要依據(jù)。

之前的報(bào)道顯示,在GMR-Gal4驅(qū)動(dòng)下人的野生型tau(UAS-tau0N4R)表達(dá)可導(dǎo)致粗糙眼(rough eye)表型[18-20]。本研究通過(guò)該模型篩選微管異常的RNAi表達(dá)品系[21],并進(jìn)一步通過(guò)成蟲(chóng)盤(pán)凋亡細(xì)胞和行為學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,尋找與tau共同調(diào)控視神經(jīng)發(fā)育的基因,進(jìn)而找到直接或間接與tau互作的蛋白。從而能夠?yàn)橹委煱柶澓ＤY等和tau相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病提供潛在的藥物靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 果蠅品系

見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用果蠅品系

1.2 實(shí)驗(yàn)所用儀器

表2 實(shí)驗(yàn)所用儀器

1.3 實(shí)驗(yàn)所用抗體

見(jiàn)表3。

表3 實(shí)驗(yàn)所用抗體

1.4 實(shí)驗(yàn)所用試劑

實(shí)驗(yàn)所用試劑見(jiàn)表4。試劑配方分別見(jiàn)表5～7。

表4 實(shí)驗(yàn)所用試劑

表5 解剖液HL 3.1

表6 4%多聚甲醛固定液(PFA)

表7 1×PBS緩沖液

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 果蠅粗糙眼觀察

將羽化后的果蠅成蟲(chóng)在25 ℃,12 h光照:12 h黑暗的培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)3 d,之后在-20 ℃冰箱分別將雌雄果蠅麻醉10 min,使用LEICA M205C顯微鏡觀察并拍攝果蠅眼睛。

1.5.2 果蠅幼蟲(chóng)解剖

1)用實(shí)驗(yàn)室公用鑷子從果蠅管中取出幼蟲(chóng)(長(zhǎng)鑷子方便取出幼蟲(chóng),解剖的短鑷子難以伸到管底),用解剖液洗去附著在幼蟲(chóng)身體上的培養(yǎng)基,并將幼蟲(chóng)放置在紙巾上蘸干。

2)將幼蟲(chóng)放到樹(shù)脂解剖盤(pán)上,用解剖針?lè)謩e固定幼蟲(chóng)的頭部和尾部,然后調(diào)整針的位置,避免幼蟲(chóng)拉太長(zhǎng),后續(xù)伸展不開(kāi)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以表示，治療前后自身對(duì)照均數(shù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，2組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平α=0.05。

3)用移液槍吸取解剖液,加入到幼蟲(chóng)表面,使其完全浸沒(méi)。用解剖剪刀在幼蟲(chóng)尾部剪開(kāi)一個(gè)口子,然后用解剖剪刀沿著中線剪至頭部。

4)用鑷子輕輕挑去幼蟲(chóng)的內(nèi)臟,注意不要碰到eye disc,以免破壞組織完整性。

5)用4根解剖針?lè)謩e固定頭尾兩邊的位置,使幼蟲(chóng)平鋪開(kāi),呈現(xiàn)出片狀。

1.5.3 eye disc免疫染色

1)在解剖好的幼蟲(chóng)(保存完整的eye disc)中加入4% PFA固定液覆蓋表面,室溫固定40 min。

2)固定完后,吸去固定液,取下幼蟲(chóng)放入2 mL EP管中,加入0.2%的PBST溶液(1×PBS+0.2% TritonX-100),然后將樣品放在側(cè)擺洗脫固定液1 h,每10～15 min換一次EP中PBST溶液。

3)洗完固定液后,吸去EP管中的PBST溶液,加入200 μL 0.2% PBST+5% 山羊血清,在側(cè)擺搖床上室溫封閉40 min;封閉完后加入1∶200 Dcp1和1∶100 elav抗體(用0.2% PBST溶液配制 抗體),將樣品放入4 ℃冰箱的側(cè)擺中,對(duì)樣品進(jìn)行低溫孵育過(guò)夜。

4)待一抗孵育完成后,吸去抗體,將樣品放入室溫?fù)u床下,用0.2% PBST溶液洗脫,在此期間洗脫1 h,每10～15 min換一次EP管中PBST溶液;洗完抗體后,吸去抗體,加入1∶800 Goat anti rabbit 555和1∶800 Goat anti mouse 488二抗(用0.2% PBST溶液配制 二抗),將樣品放入4 ℃冰箱的側(cè)擺中,對(duì)樣品進(jìn)行低溫孵育過(guò)夜;并做避光處理。

5)待二抗孵育完成后,吸去二抗,將樣品放入室溫?fù)u床下,用0.2% PBST溶液洗脫二抗,在此期間洗脫1 h,每10～15 min換一次EP管中PBST溶液。

6)二抗洗脫完后,取出幼蟲(chóng),用鑷子小心地將解剖好幼蟲(chóng)上的eye disc取出,然后放在載玻片,擺放完成后,用紙巾吸去殘留在組織的PBST,小心在組織旁邊滴一滴封片油,輕輕地蓋上蓋玻片,避免有氣泡影響后續(xù)的觀察,并在蓋玻片周?chē)可现讣子?避免蓋玻片滑動(dòng)破壞組織,封片完后寫(xiě)上對(duì)應(yīng)的基因型,放入4 ℃冰箱保存,后續(xù)用共聚焦顯微鏡拍攝。

1.5.4 果蠅的睡眠監(jiān)測(cè)

本實(shí)驗(yàn)所用的睡眠監(jiān)測(cè)采用的是pySolo v2.0系統(tǒng)[22]。pySolo系統(tǒng)的工作原理是采用高分辨攝像頭來(lái)記錄每分鐘果蠅的移動(dòng)距離,以此來(lái)判定果蠅是否處于睡眠狀態(tài)。系統(tǒng)中,我們定義果蠅在靜止超過(guò)5 min時(shí)判定為睡眠狀態(tài),系統(tǒng)每次采樣16只雄果蠅,pySolo系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)就在于其高效、準(zhǔn)確、靈敏,能準(zhǔn)確反映果蠅每分鐘的活動(dòng)狀態(tài)。

1.5.5 果蠅eye disc凋亡細(xì)胞平均熒光面積比的統(tǒng)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)利用ImageJ進(jìn)行熒光定量分析,統(tǒng)計(jì)elav抗體標(biāo)記區(qū)域內(nèi)的凋亡信號(hào)(death caspase-1,Dcp1)分布面積,并用對(duì)照組對(duì)所有組別進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。同時(shí),通過(guò)t檢驗(yàn)比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異。

2 結(jié)果

2.1 以rough eye系統(tǒng)為模型進(jìn)行微管互作蛋白的篩選

我們?cè)谠缙诘膶?shí)驗(yàn)中使用C57-Gal4(在肌肉中特異性表達(dá)的Gal4)與清華大學(xué)果蠅庫(kù)中的541株RNAi基因進(jìn)行雜交,最終篩選出了45株有表型的RNAi[21]。在果蠅視網(wǎng)膜中表達(dá)人的野生型tau會(huì)導(dǎo)致中度的粗糙眼表型,其特征是果蠅單眼陣列的紊亂和眼睛大小的減小[23]。Tau誘導(dǎo)的粗糙眼表型是篩選可能增強(qiáng)或抑制tau蛋白的相關(guān)互作蛋白和和藥理學(xué)試劑的優(yōu)良系統(tǒng)[24]。有研究利用該模型篩選出了可能與tau互作的候選基因,其中與細(xì)胞骨架相關(guān)的包括微絲結(jié)合蛋白和沿微管運(yùn)輸?shù)鸟R達(dá)蛋白[24-26]。我們?cè)贕MR-Gal4驅(qū)動(dòng)下表達(dá)人的野生型tau(UAS-tau0N4R)可導(dǎo)致rough eye表型,與之前的報(bào)道一致[18-20]。為了篩選出與tau蛋白相互作用的蛋白,我們?cè)诟弑磉_(dá)tau0N4R的背景下表達(dá)之前篩選出的45株具有表型的RNAi。在進(jìn)一步的篩選中,我們篩選出了6株RNAi,這些RNAi能夠在雌性和雄性果蠅的粗糙眼表型中增強(qiáng),相關(guān)基因分別是CG32068、CG9886、CG5588、CG3298、CG7834、CG18001,如圖1所示。篩選出雌性和雄性都粗糙眼表型減弱的5株RNAi,相關(guān)基因分別是CG33102、CG16827、CG8171、CG3697、CG3325,如圖2所示。說(shuō)明CG32068、CG9886、CG5588、CG3298、CG7834、CG18001這些RNAi可能誘導(dǎo)tau毒性,導(dǎo)致感光神經(jīng)元喪失增多,粗糙眼表型增強(qiáng),而CG33102、CG16827、CG8171、CG3697、CG3325則相反。

圖1 6個(gè)基因在tau高表達(dá)背景下敲降后果蠅粗糙眼表型增強(qiáng)敲降后果蠅粗糙眼增強(qiáng)。從圖中可以看出,敲降CG32068、CG9886、CG5588、CG3298、CG7834、CG18001后粗糙眼表型增強(qiáng)。圖中對(duì)照組基因型為GMR-Gal4/+;UAS-tau0N4R/+,實(shí)驗(yàn)組為GMR-Gal4/CyO;UAS-tau0N4R背景下敲降基因

圖2 5個(gè)基因在tau高表達(dá)背景下敲降后果蠅粗糙眼表型減弱敲降后果蠅粗糙眼減弱。從圖中可以看出,敲降CG33102、CG16827、CG8171、CG3697、CG3325后粗糙眼表型減弱。圖中對(duì)照組基因型為GMR-Gal4/+;UAS-tau0N4R/+,實(shí)驗(yàn)組為GMR-Gal4/CyO;UAS-tau0N4R背景下敲降基因

2.2 敲降后影響eye disc的凋亡

發(fā)育中的果蠅眼組織,即果蠅眼睛成蟲(chóng)盤(pán),是研究不同細(xì)胞凋亡反應(yīng)的理想系統(tǒng),因?yàn)槊糠N細(xì)胞類(lèi)型的命運(yùn)是已知的,并且已有豐富的細(xì)胞標(biāo)記來(lái)跟蹤它們[27]。在早期幼蟲(chóng)階段,眼睛成蟲(chóng)盤(pán)中的細(xì)胞不斷增殖,以產(chǎn)生眼睛所需的細(xì)胞團(tuán)[27]。為了驗(yàn)證粗糙眼的表型是否會(huì)體現(xiàn)在eye disc凋亡,我們?cè)赨AS-tau0N4R背景下使用GMR-Gal4和rough eye表型增強(qiáng)的RNAi果蠅雜交,通過(guò)果蠅凋亡信號(hào)通路中的效應(yīng)caspase(Dcp1)的免疫熒光染色來(lái)檢測(cè)神經(jīng)元凋亡的程度。以elav標(biāo)記的神經(jīng)元區(qū)域?yàn)榉秶?圖3A),統(tǒng)計(jì)Dcp1信號(hào)覆蓋面積(圖3B和3C)。結(jié)果顯示,敲降CG32068、CG3298、CG7834,凋亡細(xì)胞數(shù)量增加,而敲降CG9886、CG5588、CG18001凋亡細(xì)胞數(shù)量無(wú)變化。而在另外rough eye表型減弱的RNAi中,發(fā)現(xiàn)敲降CG16827、CG8171凋亡細(xì)胞數(shù)量增加,敲降CG3697凋亡細(xì)胞數(shù)量減少,而敲降CG33102、CG3325凋亡細(xì)胞數(shù)量無(wú)變化。以上結(jié)果說(shuō)明CG32068、CG3298、CG7834、CG16827、CG8171和CG3697可能與tau有互作。

圖3 敲降后果蠅eye disc凋亡細(xì)胞染色和平均熒光面積比A)對(duì)照組果蠅的eye disc免疫染色。elav標(biāo)記所有神經(jīng)元,用紅色表示;Dcp1標(biāo)記凋亡細(xì)胞,用綠色表示。B)敲降后果蠅eye disc凋亡細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)增加或無(wú)變化的免疫染色圖。由圖可以看出,敲降CG32068、CG3298、CG7834 、CG16827、CG8171凋亡細(xì)胞數(shù)量增加,敲降CG9886、CG5588、CG18001、CG33102、CG3325無(wú)變化,而敲降CG3697凋亡細(xì)胞數(shù)量減少。圖中凋亡細(xì)胞是用抗體Dcp1標(biāo)記。C)敲降后果蠅eye disc凋亡細(xì)胞平均熒光面積比的統(tǒng)計(jì),以elav為范圍統(tǒng)計(jì)該區(qū)域的平均熒光面積,并利用t檢驗(yàn)比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異。圖中對(duì)照組基因型為GMR-Gal4/+;UAS-tau0N4R/+,實(shí)驗(yàn)組為GMR-Gal4/CyO;UAS-tau0N4R背景下敲降基因

2.3 敲降后對(duì)晝夜睡眠節(jié)律的影響

晝夜振蕩在細(xì)胞水平上由生物鐘表示,生物鐘是由環(huán)境光形成的分子程序-關(guān)鍵時(shí)鐘蛋白對(duì)光敏感,因此在光振蕩條件下,它們的水平有節(jié)奏地上升和下降[28]。由于具有粗糙眼表型增強(qiáng)的RNAi果蠅可能會(huì)導(dǎo)致感光神經(jīng)元喪失增加,因此它們的光敏感性可能會(huì)受到影響,從而進(jìn)一步影響其晝夜節(jié)律。本實(shí)驗(yàn)在25 ℃ 12 h光照:12 h黑暗條件下,利用睡眠監(jiān)測(cè)系統(tǒng)pySolo v2.0系統(tǒng),對(duì)敲降CG32068、CG9886、CG5588、CG3298、CG7834、CG18001成蟲(chóng)果蠅進(jìn)行了晝夜睡眠監(jiān)測(cè),在監(jiān)測(cè)4日后,將監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)導(dǎo)入高通量數(shù)據(jù)分析軟件RStudio對(duì)果蠅的活動(dòng)及睡眠進(jìn)行分析,分析結(jié)果如圖4所示。從果蠅睡眠曲線圖可以看出,與對(duì)照相比,在關(guān)燈后,敲降CG32068,果蠅對(duì)于光線改變不敏感,而敲降CG9886、CG5588、CG3298、CG7834、CG18001無(wú)明顯變化。綜合以上結(jié)果,說(shuō)明CG32068RNAi可能與tau互作,導(dǎo)致粗糙眼表型增強(qiáng)和eye disc凋亡細(xì)胞增加,從而導(dǎo)致感光神經(jīng)元喪失和眼睛發(fā)育缺陷,進(jìn)而導(dǎo)致對(duì)光線改變不敏感,影響果蠅的晝夜節(jié)律。

圖4 睡眠監(jiān)測(cè)模式和敲降后睡眠監(jiān)測(cè)圖在25 ℃ LD條件下,果蠅適應(yīng)2天,在第3天12 L關(guān)燈3 h, 以及在第4天的12 D開(kāi)燈3 h, 觀察突然關(guān)燈或開(kāi)燈,果蠅對(duì)光是否敏感。與對(duì)照相比,在關(guān)燈后,敲降CG32068后,果蠅對(duì)于光線改變不敏感,果蠅沒(méi)有被喚醒,而敲降CG9886、CG5588、CG3298、CG7834、CG18001明顯變化。圖中對(duì)照組基因型為GMR-Gal4/ CG31005RNAi;UAS-tau0N4R/+,實(shí)驗(yàn)組為GMR-Gal4/CyO;UAS-tau0N4R背景下敲降基因

3 討論

據(jù)研究顯示,粗糙眼表型增強(qiáng)會(huì)引發(fā)感光神經(jīng)元的喪失[29]。在本次實(shí)驗(yàn)中,篩選出的11株具有粗糙眼表型增強(qiáng)或減弱的RNAi果蠅,可能是由于對(duì)這些基因進(jìn)行敲降導(dǎo)致感光神經(jīng)元數(shù)量的增加或減少引起的。

在果蠅的早期幼蟲(chóng)階段,眼睛成蟲(chóng)盤(pán)中的細(xì)胞持續(xù)增殖,以形成眼睛所需的細(xì)胞集合[27]。在本實(shí)驗(yàn)中,篩選出5株 RNAi果蠅表現(xiàn)出凋亡細(xì)胞數(shù)量的增加,1株RNAi凋亡細(xì)胞數(shù)量減少,這可能是由于對(duì)這些基因進(jìn)行敲降導(dǎo)致細(xì)胞增殖受限或促進(jìn)所引起。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的篩選,發(fā)現(xiàn)候選基因CG32068在果蠅的成蟲(chóng)盤(pán)細(xì)胞凋亡、粗糙眼表型及行為學(xué)方面表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)和功能的一致性。進(jìn)一步查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),該基因參與了果蠅甲硫氨酸挽救途徑[30]。接下來(lái)我們計(jì)劃進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)工作:首先,通過(guò)對(duì)果蠅喂食甲硫氨酸的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證其是否可以挽救粗糙眼和凋亡等表型,并購(gòu)買(mǎi)其他的工具果蠅來(lái)驗(yàn)證前期得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其次,在C57-Gal4/CyO;UAS-tauV337 M背景下敲降該基因,觀察微管表型和進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn),以檢測(cè)該基因與微管結(jié)合蛋白tau之間的互作情況。后續(xù)的計(jì)劃正在進(jìn)行中,需要進(jìn)一步深入研究該候選基因在果蠅發(fā)育過(guò)程中的其他作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制。