魏星旭 易夢妮 鄧 娜 藺曉源 周賽男△

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

腹瀉型腸易激綜合征（IBS-D）是以腹脹、腹痛、腹瀉等癥狀反復(fù)發(fā)作的臨床最為常見的腸易激綜合征（IBS）亞型［1］，其發(fā)病率高，機(jī)制尚未明確，仍缺乏有效的治療手段。IBS-D 中醫(yī)病位在腸，屬“泄瀉”“腹痛”等范疇，脾失健運(yùn)是其病機(jī)核心，亦與腎臟密切相關(guān)。命門火衰，火不暖土，則脾腎陽虛。四神丸是主治脾腎陽虛泄瀉的經(jīng)典名方，臨床治療IBS-D 效果確切［2-3］，但其作用機(jī)制還不明確。目前一致認(rèn)為腸道動力異常和內(nèi)臟高敏感是IBS 主要的病理生理學(xué)基礎(chǔ)，與腦腸互動失調(diào)關(guān)系密切。5-羥色胺（5-HT）是影響IBS-D腸道功能活動的重要腦腸肽，5-HT信號通路在調(diào)節(jié)胃腸功能中具有重要的生理作用。5-HT 的合成、釋放、與相應(yīng)的受體結(jié)合等信號系統(tǒng)中任一節(jié)點(diǎn)出現(xiàn)異常，都可引起胃腸運(yùn)動紊亂及內(nèi)臟高敏性［4］。為了進(jìn)一步揭示四神丸治療IBS-D 的內(nèi)臟敏感機(jī)制，本研究通過復(fù)制脾腎陽虛IBS-D大鼠模型，觀察了其對5-HT信號通路表達(dá)的影響。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠，32只，雄性，SPF級，體質(zhì)量180～220 g，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF 實驗動物中心，使用許可證號：SYXK（湘）2020-0010。經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)研究。

1.2 實驗藥物

四神丸（北京同仁堂，國藥準(zhǔn)字Z13020656，規(guī)格：27 g/瓶），用純凈水配成0.732 g/mL的藥液。匹維溴銨片（得舒特，法國蘇威制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20120127，規(guī)格：50 mg/片），用純凈水配成1.523 mg/mL 的藥液。番瀉葉購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，煎制成1.0 g/mL的藥液。

1.3 試劑與儀器

大鼠5-HT、SERT ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：ml003125、ml028312）；5-HT、5-HT4R 一抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：bs-1126R、bs-12054R）。STP-120 組織脫水機(jī)、HistoStar包埋機(jī)、HM325 輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（英國賽默飛），BX43 熒光顯微鏡（日本奧林巴斯），Enspire 多功能酶標(biāo)儀（美國Perkinelmer），Bio-Rad 蛋白印跡系統(tǒng)（美國伯樂），F(xiàn)luorChem R 超靈敏多色熒光成像分析系統(tǒng)（美國普諾森），Z32HK高速冷凍離心機(jī)（德國賀黙）。

1.4 分組與造模

將32 只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、四神丸組、得舒特組各8 只。先灌胃番瀉葉水煎液（10 mL/kg，每日1次）28 d，后連續(xù)10 d進(jìn)行避水應(yīng)激，制備脾腎陽虛型IBS-D大鼠模型［5］。

1.5 給藥方法

四神丸組給予成人等效4 倍劑量（7.32 mg/kg）的四神丸藥液，得舒特組給予成人等效劑量（15.23 mg/kg）的得舒特藥液，模型組給予等體積量（10 mL/kg）的純凈水，給藥14 d。

1.6 標(biāo)本采集與檢測

1.6.1 Bristol 糞便性狀量表評分 末次給藥后代謝籠收集大鼠糞便，按照Bristol 糞便性狀7 級評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行性狀評分［6］。

1.6.2 內(nèi)臟疼痛閾值 末次給藥后將大鼠放入自制的容器中限制活動，從肛門緩慢插入帶有球囊的導(dǎo)尿管，從20 mmHg（1 mmHg ≈0.133 kPa）開始，逐次給予遞增10 mmHg 的壓力刺激，當(dāng)大鼠背部拱起或腹部抬離臺面所對應(yīng)的壓力值即為疼痛閾值［7］。

1.6.3 ELISA 法檢測血清中5-HT、SERT 大鼠麻醉后心臟取血，離心取血清置-80 ℃冰箱保存。從冰箱中取出血清室溫復(fù)溶，嚴(yán)格按5-HT、SERT ELISA 試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行，使用450 nm 波長測量，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算所測樣品的含量。

1.6.4 免疫組化檢測結(jié)腸組織5-HT 的陽性表達(dá) 大鼠冰盒上剖腹，剪取兩段結(jié)腸PBS漂洗后，一部分裝入凍存管液氮中保存，一部分放入多聚甲醛液中固定。將用多聚甲醛固定好的結(jié)腸組織進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片，滴加5-HT一抗（1∶200）4 ℃過夜、二抗37 ℃孵育30 min，DAB 顯色，400 倍鏡下選取棕黃色染色視野拍片分析，計算其免疫陽性染色的平均OD值。

1.6.5 Western blotting 法檢測結(jié)腸組織5-HT4R 的蛋白表達(dá) 取凍存的結(jié)腸組織，依次提取蛋白，制備SDSPAGE 膠，上樣，經(jīng)電泳、濕轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入5-HT4R 一抗（1∶1 000），二抗室溫孵育、顯色。以內(nèi)參蛋白β-actin的灰度值為對照，計算5-HT4R的蛋白表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠Bristol糞便性狀量表評分比較

見表1。模型組大鼠Bristol 糞便性狀量表評分較正常組明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，四神丸組和得舒特組大鼠Bristol糞便性狀量表評分均明顯降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠Bristol糞便性狀量表評分和內(nèi)臟疼痛閾值比較（分，±s）

表1 各組大鼠Bristol糞便性狀量表評分和內(nèi)臟疼痛閾值比較（分，±s）

注：與正常組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。下同。

內(nèi)臟疼痛閾值（mmHg）94.38±4.17 48.13±3.72**88.13±5.30△△84.38±4.17△△組 別正常組模型組四神丸組得舒特組n8888 Bristol（分）4.13±0.64 6.00±0.53*3.75±0.46△4.25±0.46△

2.2 各組大鼠內(nèi)臟疼痛閾值比較

見表1。模型組大鼠內(nèi)臟疼痛閾值較正常組顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，四神丸組和得舒特組大鼠內(nèi)臟疼痛閾值均顯著升高（P＜0.01）。

2.3 各組大鼠血清5-HT、SERT含量比較

見表2。與正常組比較，模型組血清5-HT 含量顯著升高、SERT 含量顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，四神丸組和得舒特組5-HT含量降低、SERT含量升高（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清5-HT、SERT含量比較（±s）

表2 各組大鼠血清5-HT、SERT含量比較（±s）

組 別正常組模型組四神丸組得舒特組n8888 5-HT（ng/mL）6.22±0.47 11.83±0.59**7.45±0.60△8.11±0.61△SERT（pg/mL）204.32±15.97 164.08±12.77**191.03±16.40△183.13±12.79△

2.4 各組大鼠結(jié)腸組織5-HT陽性表達(dá)比較

見表3、圖1。模型組結(jié)腸組織5-HT 陽性表達(dá)較正常組顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，四神丸組和得舒特組5-HT 的陽性表達(dá)均降低（P＜0.05 或P＜0.01），且四神丸組低于得舒特組（P＜0.05）。

表3 各組大鼠結(jié)腸組織5-HT陽性和5-HT4R蛋白表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠結(jié)腸組織5-HT陽性和5-HT4R蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與得舒特組比較，*P ＜0.05。

組 別正常組模型組四神丸組得舒特組5-HT4R/β-actin 0.45±0.04 0.07±0.02**0.29±0.03*△0.14±0.03△n8888 5-HT 0.15±0.02 0.54±0.05**0.18±0.03*△△0.35±0.04△

2.5 各組大鼠結(jié)腸組織5-HT4R蛋白表達(dá)比較

見表2、圖2。模型組結(jié)腸組織5-HT4R 蛋白表達(dá)較正常組顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，四神丸組和得舒特組5-HT4R 蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05 或P＜0.01），且四神丸組高于得舒特組（P＜0.05）。

圖2 各組結(jié)腸組織5-HT4R蛋白電泳條帶

3 討 論

IBS-D 屬中醫(yī)學(xué)“泄瀉”范疇，脾腎陽虛證在泄瀉中的證型比例在9.21%以上［8］，因腎和脾乃先、后天之本，生理上相互補(bǔ)充，病理上相互影響，命門火衰，火不暖土，故見大便清稀甚至水樣便，完谷不化、腹痛喜溫、腰酸肢冷等癥狀。也有研究表明，脾腎陽虛證是IBSD 臨床最為多見的證型之一，貫穿IBS-D 發(fā)病的始終［9］。四神丸出自《內(nèi)科摘要》，為治療脾腎陽虛型泄瀉的經(jīng)典名方，臨床用于治療IBS-D 效果顯著；其重用補(bǔ)骨脂溫腎暖脾為君；臣以肉豆蔻溫脾暖胃、澀腸止瀉，吳茱萸溫中散寒；五味子酸斂固澀，合生姜溫胃散寒，大棗補(bǔ)脾養(yǎng)胃，共為佐使。Meta 分析研究表明，四神丸治療IBS-D 的臨床有效率優(yōu)于西藥組，且四神丸安全性更高［10］。

目前四神丸治療IBS-D 的實驗研究主要涉及腸黏膜屏障保護(hù)、胃腸道功能改善、腸道菌群調(diào)節(jié)相關(guān)方面［11］。IBS-D 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，而作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）與胃腸道之間信號傳導(dǎo)的腦腸軸則對調(diào)控腸道動力和內(nèi)臟敏感性起著至關(guān)重要的作用［12］。課題組前期基于腦腸軸調(diào)控紊亂在IBS-D 發(fā)病中的作用開展了大量研究工作，從腸道動力異常角度進(jìn)行了四神丸治療脾腎陽虛IBS-D 的作用機(jī)制探討。研究表明，四神丸治療脾腎陽虛型IBS-D 的作用與調(diào)節(jié)腦腸肽Ghrelin、CRF 的表達(dá)有關(guān)［5，13］。盡管如此，在脾腎相關(guān)的腦腸軸理論指導(dǎo)下［14］，四神丸治療IBS-D 的內(nèi)臟敏感機(jī)制仍亟待研究。課題組在大量的動物實驗中進(jìn)行了四神丸治療IBS-D 的量效關(guān)系研究，即四神丸高（7.32 mg/kg）、中（3.66 mg/kg）、低（1.83 mg/kg）劑量組分別給予成人等效劑量的4、2、1 倍灌胃，結(jié)果均顯示以高劑量組效果最優(yōu)［5，15-16］。因此，在已明確其量效關(guān)系的前提下本研究未做量效關(guān)系探討，而直接選取高劑量給藥。

5-HT是一種廣泛分布于胃腸道平滑肌、腸神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道傳入感覺神經(jīng)系統(tǒng)中的重要腦腸肽［17］。當(dāng)胃腸受到刺激后，5-HT可通過參與腦腸軸中化學(xué)信號的改變；當(dāng)CNS 和胃腸道5-HT 水平明顯升高，堆積后可能觸發(fā)興奮性毒性，使迷走神經(jīng)調(diào)控功能受損，引發(fā)內(nèi)臟高敏感［18］。5-HT 可通過與不同受體結(jié)合產(chǎn)生作用，從而引發(fā)IBS-D，其中5-HT4R 與IBS-D 內(nèi)臟高敏機(jī)制關(guān)系較為密切。5-HT 與5-HT4R 結(jié)合后，可開放電壓敏感性鈣通道，促進(jìn)乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)釋放，導(dǎo)致腹部疼痛不適以及內(nèi)臟敏感性增強(qiáng)等［19］。此外，腸道中5-HT4R 也可直接參與內(nèi)臟感覺信號傳遞［20］。SERT 作為5-HT 失活的重要跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，對5-HT具有高選擇性親和力，當(dāng)5-HT發(fā)揮作用后，SERT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白快速轉(zhuǎn)運(yùn)5-HT 至細(xì)胞內(nèi)失活，進(jìn)而降低細(xì)胞外液中5-HT 的濃度［21］。故SERT 基因的表達(dá)和蛋白功能的降低會導(dǎo)致5-HT 的過量累積，出現(xiàn)腦腸軸功能失調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，IBS-D 大鼠腦、腸、血清中5-HT 水平均上升，SERT 水平下降，且SERT 蛋白及基因表達(dá)降低，內(nèi)臟敏感性升高［22］。本研究顯示，IBS-D模型大鼠血清中5-HT 含量增加、SERT 含量減少，結(jié)腸組織中5-HT 的陽性表達(dá)升高、5-HT4R 的蛋白表達(dá)降低，與文獻(xiàn)報道結(jié)果一致。

本研究觀察了四神丸對IBS-D 模型大鼠5-HT 信號通路表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，IBS-D 模型大鼠Bristol糞便性狀量表評分升高，內(nèi)臟疼痛閾值降低，內(nèi)臟敏感性增強(qiáng)，說明模型大鼠出現(xiàn)了IBS-D 的內(nèi)臟高敏癥狀。經(jīng)四神丸治療后，IBS-D大鼠Bristol糞便性狀量表評分降低、內(nèi)臟疼痛閾值升高，內(nèi)臟敏感性減弱，提示四神丸可以有效改善IBS-D大鼠的內(nèi)臟高敏感。同時，其還能降低血清5-HT 水平、升高SERT 水平，減少5-HT 在結(jié)腸組織中的陽性表達(dá)，增加5-HT4R 的蛋白表達(dá)，表明四神丸改善IBS-D 大鼠內(nèi)臟高敏的作用與調(diào)控5-HT、SERT的含量及5-HT、5-HT4R的表達(dá)有關(guān)。

綜上可知，四神丸可通過調(diào)節(jié)腦腸軸5-HT信號通路，改善內(nèi)臟高敏感，達(dá)到治療IBS-D 的目的。然而其調(diào)節(jié)IBS-D內(nèi)臟敏感機(jī)制的其他途徑仍有待深入研究。