賀夢雪 封繼宏 吳清原 馬悅寧 郭 安 張文瑞 孫增濤△

（1.天津中醫(yī)藥大學，天津 300000；2.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津 300000）

社區(qū)獲得性肺炎（CAP）是一種感染性疾病，其主要表現(xiàn)為醫(yī)院外罹患的感染性肺實質(zhì)（含肺泡壁，即廣義上的肺間質(zhì)）炎癥［1］。盡管現(xiàn)代醫(yī)學研究取得了許多進展，CAP仍然是世界范圍內(nèi)的主要健康問題，發(fā)病率和死亡率都很高［2］。雖然抗菌藥物不斷地更新迭代，CAP 的治療仍然不容樂觀。傳統(tǒng)抗生素的殺菌方式使得細菌、病毒、真菌和寄生蟲等產(chǎn)生耐藥性的速度越來越快，使感染越來越難以或不可能治療，甚至出現(xiàn)抗生素耐藥性。世界衛(wèi)生組織宣布抗生素耐藥性是全球十大公共衛(wèi)生威脅之一［3］。國外有研究者［4］在抗生素耐藥性和抗生素發(fā)現(xiàn)的新選擇中提出，通過靶向宿主而不是病原體，將重點放在宿主免疫系統(tǒng)上，通過抑菌代替殺菌的方式有望成為解決耐藥性的新方式。這與中醫(yī)藥多靶點、多途徑、多環(huán)節(jié)的治療理念有極大相似性，展現(xiàn)出了對CAP很好的治療方向與前景。

扶正解毒方全方由小柴胡湯、麻杏甘石湯、三仁湯為主化裁而來，一則祛未解之邪，二則清未解之熱，三則調(diào)不暢之氣，共同發(fā)揮健脾補肺扶助正氣，通腑泄熱調(diào)暢氣機，化濕解毒祛邪外出之功。課題前期將61 例CAP 分為試驗組與對照組，試驗組在常規(guī)西醫(yī)治療基礎上加扶正解毒方，對照組采用西醫(yī)常規(guī)治療，試驗組中醫(yī)癥狀積分、完全退熱時間、CRP降低水平均優(yōu)于對照組［5］。因此本文采用網(wǎng)絡藥理學的方法探究扶正解毒方治療CAP 的潛在作用機制，并利用分子對接技術對扶正解毒方中的有效活性成分和受體蛋白分子進行擬結合，闡述扶正解毒方多成分、多靶點、多途徑的協(xié)同作用機制，為CAP 的臨床治療提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 扶正解毒方有效成分篩選及相關靶點預測 以黨參、柴胡、黃芩、麻黃、杏仁、生石膏、虎杖、薏苡仁、豆蔻、半夏、甘草為關鍵詞輸入中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）［6］，限定搜索條件為口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18，對已發(fā)布的文獻進行檢索，以補充相關成分的信息，并且通過使用TCMSP 來預測這些成分的作用目標。將蛋白質(zhì)靶點利用UniPort 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）［7］進行矯正規(guī)范。

1.2 疾病靶點獲取在疾病基因數(shù)據(jù) GeneCards（https：//www.genecards.org）［8］（更新于2023 年3 月27日）、OMIM（https：//www.omim.org/）［9］（更新于2023 年4 月15 日）、Disgent（https：//www.disgenet.org/）中“community-acquired pneumonia”為檢索詞進行檢索，將結果合并去重后，利用UniPort數(shù)據(jù)庫進行蛋白質(zhì)靶點標準化，得到CAP靶點。

1.3 藥物和疾病共同靶點的篩選 將疾病靶點與藥物靶點進行比對篩選，去除重復靶點，獲得扶正解毒法方治療CAP 的交集基因靶點，并通過VENNY2.1.0 平臺（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）［10］繪制韋恩圖。

1.4 “成分-靶點”網(wǎng)絡構建 使用Cytoscape 3.9.1 構建“藥物活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡，并且使用Network Analyzer 插件進行拓撲分析。通過預測連接度（degree）來識別關鍵成分。

1.5 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡構建 使用STRING（https：//string-db.org）［11］數(shù)據(jù)庫，設定種族為智人，最小交互作用得分為0.9，導入藥物與疾病交集靶基因。剔除無關網(wǎng)絡的游離靶基因，初步得到PPI 網(wǎng)絡圖，利用Cytoscape 3.9.1 設置連接度（Degree）、緊密度（Closeness centrality）、介度（Betweenness centrality）進行PPI網(wǎng)絡圖優(yōu)化，篩選核心靶點。

1.6 富集分析 使用Metascape 平臺（https：//metascape.org/gp/index.html）進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析。最終的可視化結果通過微生信在線平臺進行展示。

1.7 分子對接 將連接度排名前5位的化合物成分及共同作用靶點進行分子對接?；衔锝Y構通過TCMSP 平臺搜索，蛋白結構通過PDB 數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）得到。使用CB-Dock 在線平臺（http：//cao.labshare.cn/cb-dock/）通過將化合物結構和蛋白質(zhì)結構導入平臺的方式進行分子對接和可視化。使用對接分數(shù)來評價化合物的活性。

2 結 果

2.1 扶正解毒方活性成分及其對應靶點獲取 單個中藥藥物活性成分利用TCMSP 平臺經(jīng)ADME 篩選及文獻共篩選黨參24 種、柴胡12 種、黃芩32 種、麻黃22 種、生石膏0 種、杏仁16 種、虎杖8 種、薏苡仁6 種、豆蔻11 種、半夏11 種、甘草87 種，其中共有成分25 種。使用Cytoscape3.9.1 軟件中Network analyse進行連接度值排序，由大到小排名前5 的成分為：MOL000098、MOL000006、MOL000449、MOL000422、MOL000358。各藥物對應靶點數(shù)目：黨參216 個、柴胡251 個、黃芩310 個、麻黃369 個、杏仁147 種、虎杖243個、薏苡仁38 個、豆蔻255 個、半夏120 個、甘草1 106個，去除重復值后得到223個靶點。

2.2 通過GeneCards檢索CAP相關靶點5 047個（選取score 值前1/4 的靶點為1 416）、OMIM 庫18 個、Disgent庫75個（選取score值前1/4的靶點為1 416）CAP靶點，剔除重復值后得到1 460個靶點。

2.3 收集藥物和疾病之間共同靶點 將223個藥物作用靶點和1 460 個疾病作用靶點錄入Excel 表格，合并去重后得到113 個藥物和疾病交集靶點，把藥物作用的靶點和CAP 相關的靶點錄入VENNY2.1.0 平臺，然后繪制出韋恩圖，具體結果如圖1所示。

圖1 藥物靶點和疾病靶點交集圖

2.4 化合物成分與目標蛋白靶點之間相互作用關系本藥物成分網(wǎng)絡圖共包含428 個節(jié)點、3 291 條邊，見圖2。對于構建的成分-靶點網(wǎng)絡，通過degree 值來評估每個節(jié)點在這個網(wǎng)絡中的重要程度，即與該節(jié)點相互作用的節(jié)點數(shù)量。度值越高表明該節(jié)點在網(wǎng)絡中的作用越為關鍵。通過degree值的統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)槲皮素、山柰酚、木樨草素、豆甾醇、β-谷甾醇等活性成分的度值較高，因此可能是扶正解毒方治療CAP的關鍵成分。

圖2 有效成分-靶點網(wǎng)絡圖

2.5 蛋白質(zhì)相互作用PPI 網(wǎng)絡構建 將113 個藥物疾病交集基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫進行PPI網(wǎng)絡分析，設置最小交互作用得分為0.9 分，去除無關游離基因，將上述結果導入Cytoscape 3.9.1 軟件后，繪制出PPI 網(wǎng)絡圖（見圖3），其中包括113 個節(jié)點和2 423 條邊。在這個網(wǎng)絡圖中，degree 值較高的基因包括信號轉導和轉錄激活因子蛋白激酶（Akt）1、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、胱天蛋白酶3（CASP3）、白細胞介素-1β（IL-1β）等。

圖3 PPI網(wǎng)絡圖

2.6 交集基因GO生物過程及KEGG通路富集分析使用Metascape 平臺對113 個交集作用靶點進行了GO和KEGG 富集分析，并選取了P值排名較靠前的結果（圖4～圖6）。GO 富集結果顯示，交集基因與對肽的反應、對脂多糖的反應、對無機物質(zhì)、營養(yǎng)水平、調(diào)節(jié)細胞遷移、對輻射的反應、對缺氧水平的反應、凋亡信號通路的調(diào)節(jié)、外源刺激的反應以及外界刺激反應的正向調(diào)節(jié)、負向調(diào)控細胞分化、細胞死亡的正向調(diào)節(jié)、磷酸化的正向調(diào)節(jié)、生長因子反應等生物學過程。膜筏、囊泡腔、細胞外基質(zhì)、Bcl-2家族蛋白復合物、絲氨酸蛋白酶抑制劑復合物、蛋白激酶復合物等分子功能關系密切。KEGG 富集結果顯示扶正解毒方治療CAP 通路主要涉及在腫瘤、脂質(zhì)代謝、AGE-RAGE 信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用、HIF-1 信號通路、JAK-STAT 信號通路、NF-κB 信號通路、PPAR 信號通路等幾個關鍵通路。

圖4 GO分析BP（生物過程）、CC（細胞組分）、MF（分子功能）分析圖

圖5 KEGG分析

圖6 KEGG氣泡圖

2.7 分析對接驗證 分別選取Dgree 值排名前5 的關鍵活性成分和核心靶點（及并列第5）進行分子對接驗證，結果顯示：關鍵藥效物質(zhì)與核心靶點的最低結合能均小于-5.0 kcal/mol（-20.9 kJ/mol），30 組中19 組結合能小于-7.0 kcal/mol（-29.3 kJ/mol），說明二者之間能夠穩(wěn)定的結合［12］，詳見表1。對結合度排名前10 位的成分與其對應的靶點進行了可視化分析，詳見圖7。

表1 關鍵藥物成分與核心靶點對接的Vina分數(shù)（kcal/mol）

圖7 關鍵藥效物質(zhì)-核心靶點分子對接模式圖

3 討 論

中醫(yī)并無CAP 病名，通常將其歸屬為“風溫肺熱”“外感熱病”等范疇。本課題組通過前期中醫(yī)證候調(diào)查發(fā)現(xiàn)，CAP 發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)與正虛有著密切聯(lián)系［13］。課題組認為近代“急性虛證”理念的提出明確了外感熱病中虛性病機的重要性，在外感熱病的全病程中根據(jù)其病因病機的偏性而全程固護正氣，是外感熱病的核心治法［14］。扶正解毒方由小柴胡湯、麻杏甘石湯和三仁湯化裁而來，含黨參、柴胡、黃芩、麻黃、杏仁、虎杖、薏苡仁、豆蔻、半夏、甘草等藥。關于小柴胡湯證病機，《傷寒論》第97 條云“血弱氣盡，腠理開，邪氣因入，與正氣相搏，結于脅下”，說明在機體正氣不足，不能在體表抗邪外出，正邪分爭之時，可與小柴胡湯祛邪以扶正。麻杏甘石湯為“溫病發(fā)汗逐邪之主劑”［15］，《傷寒論》記載“發(fā)汗后……汗出而喘，無大熱者，可與麻杏甘石湯”。清·俞根初在《重訂通俗傷寒論·風溫傷寒》中提出“為內(nèi)熱外寒之證者，予治甚多，重則麻杏甘石湯”“大旨以辛涼開肺為主”［16］。關于三仁湯在《溫病條辨》曰“濕溫病，汗之則神昏耳聾，甚則目瞑不欲言，下之則洞泄，潤之則病深不解，長夏深秋冬日同法，三仁湯主之”［17］。故以此三方相合，一可祛未解之邪，二則清未解之熱，三則調(diào)不暢之氣，共同發(fā)揮益氣補肺扶助正氣、通腑泄熱調(diào)暢氣機、化濕解毒祛邪外出之功。

本研究利用“藥物有效成分-靶點信息”網(wǎng)絡圖分析扶正解毒方中藥物有關活性成分，進一步分析了兩者相互作用關系。該網(wǎng)絡圖顯示degree 值排名前5 位的化學成分有槲皮素、山柰酚、木樨草素、豆甾醇、β-谷甾醇。研究表明槲皮素具有抗菌、抗病毒、化痰止咳、神經(jīng)保護、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用［18］。Lv 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在72 h 內(nèi)按12 h 間隔25 mg/kg 皮下注射槲皮素，并記錄肺炎鏈球菌所致鼻內(nèi)感染模型小鼠的96 h 存活率，結果表明槲皮素能減少細胞損傷、抑制支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子釋放、減輕模型小鼠的肺組織病理損傷，提高被感染小鼠的存活率。槲皮素衍生物的抗炎特性可以通過抑制促炎因子的mRNA表達來證明［20］。Noh等［21］研究顯示槲皮素可以通過下調(diào)CC-趨化因子受體1（CCR1）/CCR5 來緩解炎癥，抑制c-Jun氨基末端激酶（JNK）、p38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子κ-B 激酶抑制劑（IκBk）和NF-κB 降解抑制劑。山柰酚可以抑制LPS 刺激的RAW 2.2 細胞的炎癥因子的釋放，并通過蛋白印跡等方法發(fā)現(xiàn)其機制可能是通過抑制NF-κB，絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）和Akt信號通路發(fā)揮抗炎作用［22］。木樨草素也是一種具有抗炎、抗菌和抗氧化等藥理活性的天然黃酮類化合物。曲海新等［23］用氣管滴注脂多糖（LPS）溶液的方法建立ARDS 模型，對照組小鼠氣管滴注等量生理鹽水。結果顯示，木樨草素組小鼠肺組織病理損傷、炎癥因子等均有所改善，其發(fā)揮作用機制可能是通過抑制ROS/TXNIP/NLRP3 信號通路激活，減輕ARDS 小鼠氧化應激與肺部炎癥，改善肺損傷，修復肺功能。豆甾醇、β-谷甾醇在人體內(nèi)發(fā)揮多種有益作用，包括能夠發(fā)揮抗菌、抗炎、抗氧化、抗動脈粥樣硬化斑塊和抗衰老等作用［24-25］。吳力超等［26］通過網(wǎng)絡藥理學加細胞實驗驗證的方式認為豆甾醇發(fā)揮抗炎作用的機制可能是通過MAPK3 和PRKACA 等靶點發(fā)揮作用來調(diào)控雌激素信號通路。Rossi A 等［27］證明β-谷甾醇可以抑制暴露于銅綠假單胞菌的支氣管上皮細胞中趨化因子IL-8的表達；在肺部慢性感染的小鼠模型中，β-谷甾醇顯著減少了支氣管肺泡灌洗液中的白細胞募集，并減少了氣道中回收的細菌，降低了肺勻漿中參與免疫應答的關鍵細胞因子（主要是中性粒細胞趨化性）的表達；最終表明，β-谷甾醇有可能成為一種針對銅綠假單胞菌長期感染肺部中性粒細胞過度募集的新方向。

本研究在對“有效成分-靶點”和CAP 疾病潛在靶點的PPI 網(wǎng)絡分析中，發(fā)現(xiàn)聯(lián)系較高的基因有信號轉導和Akt1、IL-6、TNF、VEGFA、CASP3、IL-1β。一些研究表明，Akt1 在調(diào)節(jié)細胞存活、分化和增殖、炎癥反應的調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著廣泛的作用［28］。Tang 等［29］研究表明，小鼠巨噬細胞中的Akt1 活化增強了脂多糖誘導的炎癥反應。Zhao 等［30］研究表明Akt1 在調(diào)節(jié)低分子量透明質(zhì)酸誘導的中性粒細胞活性中起關鍵作用，并且在Akt1 基因敲除小鼠的中性粒細胞積累減少表明Akt1信號傳導選擇性地影響炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。

IL-6 因其同時具有促炎與抗炎作用，被認為是一種處在自身免疫炎癥十字路口的細胞因子［31］。Scheller等研究團隊［32］通過對IL-6 及其相對應配體的研究，認為IL-6 經(jīng)典信號傳導的是再生或抗炎作用，而IL-6的反信號傳導的是促炎反應。有研究認為IL-6 可以通過抑制CASP3-GSDME 介導的從細胞凋亡到焦亡的轉變，抑制CASP1-GSDMD 介導的肺炎球菌性肺敗血癥期間的典型焦亡，預防肺巨噬細胞死亡和肺部炎癥損傷［33］。TNF是免疫的中樞調(diào)節(jié)因子［34］，VEGFA 是血管發(fā)育的關鍵調(diào)節(jié)因子，SI 等［35］在患者中，觀察到循環(huán)VEGF-A 水平升高與VAP 消退之間存在關聯(lián)。通過對小鼠研究表明，VEGF-A 水平升高可能與肺部炎癥消退有關。IL-1β 由多種免疫細胞類型的炎癥信號誘導。過量的IL-1β 已經(jīng)被證實與膿毒癥患者死亡或膿毒癥休克直接相關［36］。

為了說明扶正解毒方潛在靶點的生物功能和作用機制，本研究進行了GO及KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)潛在靶點的生物功能主要集中在對脂多糖的反應、對調(diào)節(jié)細胞遷移、對缺氧水平的反應、凋亡信號通路的調(diào)節(jié)、外源刺激的反應以及外界刺激反應的正向調(diào)節(jié)、負向調(diào)控細胞分化、細胞死亡的正向調(diào)節(jié)、磷酸化的正向調(diào)節(jié)、生長因子反應等生物學過程。對獲得通路的分析發(fā)現(xiàn)，治療作用靶點通路主要集中在腫瘤、脂質(zhì)代謝、AGERAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用、HIF-1信號通路、JAK-STAT 信號通路、NF-κB 信號通路、PPAR 信號通路等幾個關鍵通路。其中NF-κB信號傳導途徑參與先天、適應性免疫和炎癥反應，在機體生理、病理過程中都發(fā)揮重要作用［37］。NF-κB作為炎癥反應過程中重要的轉錄因子，與細胞核內(nèi)基因特異性結合后啟動轉錄程序，調(diào)節(jié)細胞炎性因子的表達，參與調(diào)控多種炎癥疾病發(fā)生，例如加強肺組織的炎癥強度，加重肺組織的損傷［38］。NF-κB 的激活和功能受到IκB 蛋白質(zhì)家族的調(diào)控；一般情況下，未被激活的NF-κB在細胞質(zhì)中以p50/p65二聚體的形式存在，與抑制劑IκBα結合在一起，阻止NF-κB 的活化［39］。相關因子可誘導IκB 發(fā)生磷酸化，促使p65與特定DNA序列結合，導致靶基因的改變和激活更多炎癥因子的釋放與表達，進而參與肺炎過程中的肺損傷，在炎癥反應過程起核心作用［40-41］。JAK/STAT 信號通路中已鑒定出50 多種細胞因子和生長因子，例如激素、干擾素（IFN）、白細胞介素（IL）和集落刺激因子。JAK/STAT通路構成了一個快速的膜到細胞核信號模塊，并誘導癌癥和炎癥的各種關鍵介質(zhì)的表達［42］。PPAR 信號通路現(xiàn)在被認為是白細胞炎癥反應和功能的重要調(diào)節(jié)劑，其免疫調(diào)節(jié)功能已在各種情況下進行了研究，包括肺部和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細菌感染、敗血癥以及慢性肉芽腫病等疾?。?3］。同時有研究［44］認為PPAR-γ 激動劑因其抑制炎癥和增強細菌清除的能力而被建議作為細菌性肺炎的潛在輔助治療，并且研究結果支持PPAR-γ 激動劑作為免疫調(diào)節(jié)劑治療細菌性肺炎的臨床評估。課題組前期［45-46］針對扶正解毒方對NF-κB 信號通路進行了藥效學實驗驗證，發(fā)現(xiàn)扶正解毒方可以降低肺炎模型大鼠肺組織內(nèi)的NF-κB p65的蛋白表達，從而抑制NF-κB通路激活，下調(diào)TNF-α、IL-10、HMGB1等炎癥因子的釋放。后期扶正解毒方可針對JAK-STAT 信號通路、PPAR 信號通路等進行進一步實驗驗證。

將扶正解毒方主要活性成分與核心靶點進行分子對接驗證，結果同樣表明槲皮素、山柰酚、木樨草素、豆甾醇、β-谷甾醇與Akt1、IL-6、TNF、VEGFA、CASP3、IL-1β結合活性較強，提示扶正解毒方的活性成分與關鍵蛋白具有良好的結合能力，驗證了本研究結果的準確性。

綜上研究結果表明，扶正解毒方的同一化學成分可調(diào)控不同的蛋白基因靶點，同一蛋白基因靶點可作用于不同的生物過程和信號通路。這一作用網(wǎng)絡體現(xiàn)了扶正解毒方多成分、多靶點的協(xié)同作用特點。這為臨床運用扶正解毒方治療CAP 提供了科學依據(jù)，也為進一步挖掘扶正解毒方潛在作用機制提供了方向。限于中藥化學成分在煎煮時化學反應的復雜性，未能將扶正解毒方煎煮后的化學成分以及扶正解毒方入血成分納入分析，后續(xù)將進一步深入在具體動物或細胞實驗中進行探索。

利益沖突聲明：所有作者在研究過程中均無利益沖突。