王禹清，張露，郭松偉，李晨，陸柯，張慶祥

（山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355）

支氣管哮喘（bronchial asthma，BA），簡稱哮喘，是一種由多種免疫細胞及其因子介導的伴有反復發(fā)作的喘息、氣急、胸悶或咳嗽等臨床特征的具有復雜免疫機制的慢性氣道炎癥，受遺傳因素、環(huán)境因素和免疫因素的多重影響［1-2］。根據2019年最新流行病學調查顯示，我國20 歲以上成人哮喘患病率已高達4.2%，全國患病總人數已達4 570 萬［3］，目前隨著人口老齡化和社會環(huán)境問題，哮喘的患病人數在我國仍在逐年增長。研究認為，哮喘的發(fā)生伴隨著T 淋巴細胞向輔助性T 淋巴細胞2（T helper cell 2，Th2）導向分化，并釋放一系列相關細胞因子，從而擾亂Th1/Th2 平衡，啟動過敏性哮喘的免疫反應［4-5］。近年來隨著免疫學調查不斷深入，發(fā)現(xiàn)Th17/調節(jié)性T 細胞（Treg）之間的平衡也在哮喘發(fā)病機制中起作用，其中Th17 主要釋放促炎因子，如IL－17、IL－21、IL－22等，特別是機體中IL－17的表達水平與哮喘患者的嚴重程度呈正相關，另外，IL－17 的過度表達還會增強Th2 型細胞的免疫應答，從而加劇機體免疫反應，引發(fā)更嚴重的哮喘［6-10］，相反，Treg 主要促進如IL－10、TGF－β 等抑炎因子的產生，研究表明，IL－10 能夠同時抑制先天性和適應性免疫反應，從而防止哮喘病情加重，另外，仍有研究表明TGF－β 可以協(xié)同IL－6，使初始T 細胞向Th17 導向分化，而當機體組織缺乏IL－6 時，初始T 細胞則向Treg導向分化，因此，TGF－β 與IL－6 間可能存在某種平衡，以維持Th17/Treg間的免疫平衡關系。

而在針對痰熱哮喘的臨床治療中，定喘湯和宣白承氣湯皆作為經典有效方劑被廣泛應用，定喘湯中的有效成分可以起到宣降肺氣、清熱化痰之效，且有研究證明定喘湯可以通過調節(jié)人體免疫平衡達到緩解哮喘癥狀的作用；而宣白承氣湯則可以通過通腑泄熱的方式緩解哮喘。且現(xiàn)代網絡藥理學研究更進一步表明，宣白承氣湯可能通過調節(jié)Th17/Treg 靶點進而調節(jié)機體免疫失衡狀態(tài)，起到緩解哮喘癥狀的目的［11］，但其具體作用機制目前并未有涉足，因此本實驗采用常規(guī)OVA 哮喘病理模型制法聯(lián)合中醫(yī)痰熱腑實證型刺激制備哮喘痰熱腑實證候大鼠模型，探討宣白承氣湯對痰熱腑實證哮喘大鼠的干預作用及其對Th17/Treg 免疫失衡的影響，為宣白承氣湯在臨床上的有效應用提供新的思路。

1 材料

1.1 實驗動物

5～6周SPF級Wistar雄性大鼠50只，體質量140～160 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物使用許可證號：北京SCXK（京）2021－0011。于山東中醫(yī)藥大學動物實驗中心飼養(yǎng)，動物房溫度（23 ± 2）℃，相對濕度20%～40%，晝夜12 h 明暗交替，食水自由攝取。研究用實驗動物的使用與操作均符合山東中醫(yī)藥大學動物保護委員會（編號：SDUTCM20201204001）關于實驗動物操作與動物福利的要求。

1.2 實驗試劑、藥品與儀器

1%戊巴比妥鈉溶液（Sigma，批號：201912）；多聚甲醛（上海國藥集團化學試劑，批號：30525－89－4）；無水乙醇（上海國藥集團化學試劑，批號：100092683）；卵清白蛋白（美國Sigma 公司，批號：A8040）；氫氧化鋁（上海國藥集團化學試劑有限公司，批號：20200226）；復方地芬諾酯片（常州康普藥業(yè)有限公司，批號：1701023）；地塞米松（Solarbio，批號：D8040）；定喘湯水煎劑（炙麻黃9 g，白果9 g，款冬花9 g，清半夏9 g，桑白皮9 g，蘇子6 g，杏仁4.5 g，黃芩6 g，甘草3 g）購自山東新中魯中醫(yī)院中藥房；宣白承氣湯水煎劑（生石膏15 g，杏仁6 g，瓜蔞皮4.5 g，生大黃9 g）購自山東新中魯中醫(yī)院中藥房。

壓縮空氣霧化器（江蘇魚躍醫(yī)療設備股份有限公司，型號：403K）；大鼠IL－6 ELISA 試劑盒（CSB E04640r，批號：CUSABIO）；大鼠TGF-β ELISA 試劑盒（CUSABIO，貨號：CSB－E04727r）；大鼠IL－17 ELISA試劑盒（CUSABIO，貨號：CSB－E07451r）；大鼠IL－10試劑盒（CUSABIO，貨號：CSB－E04595r，）；恒溫鼓風箱；離心機（Techcomp，型號：CT15RT）；移液器（Eppendorf）；酶標儀（BIO－RAD，型號：iMARK）；超純水儀（Millipor synergy）；超低溫冰箱（Thermo forma 900 series）；八連排槍（Thermo）；排槍槽；恒溫箱（華德利，型號：PWT－P42）。

2 方法

2.1 動物分組

將50 只大鼠采用隨機數表法分為空白對照組（A組）、模型組（B 組）、定喘湯組（C 組）、宣白承氣湯組（D組）和地塞米松組（E組），每組10只。

2.2 動物造模

2.2.1 建立哮喘模型

各組大鼠適應性飼養(yǎng)1 周后開始正式實驗，適應性飼養(yǎng)期間各組大鼠給予普通飼料、普通飲水。正式實驗第1～35天為造模期，第22～35天為給藥期。

實驗開始第1天、第8天和第15天，B、C、D、E組大鼠分別給予腹腔注射抗原液（含卵清白蛋白100 mg 及氫氧化鋁100 mg）1 mL致敏，第22天用濃度為1%的卵清白蛋白霧化激發(fā)，30 min/次，1 次/d，連續(xù)14 d。A 組大鼠腹腔注射及霧化激發(fā)均以等量生理鹽水代替。

2.2.2 建立痰熱腑實證模型

參考文獻［12-15］，B、C、D、E 組大鼠自實驗第1天開始予高脂高糖低纖維飼料（脂肪15%，蔗糖15%，纖維3%）喂養(yǎng)，購于北京科澳協(xié)力飼料有限公司，許可證號：SCXK（京）2019－0003），并將特制脂肪乳（每500 mL含豬油20 g、膽固醇10 g、豬膽鹽2 g、吐溫80 20 mL、1，2丙二醛20 mL）按5 mL/kg 加至大鼠日常飲水中，至第35 天實驗結束；并于實驗第8 天開始用濃度15 mg/kg的復方地芬諾酯混懸液1.5 mL/（100 g·d）干預灌胃，至第35天實驗結束；第22天開始將造模組大鼠放入恒溫鼓風箱，溫度設置為（38 ± 2）℃，濕度35%～45%，30 min/次，2次/d，至實驗結束。

2.3 藥物干預

實驗第22 天開始，C、D 組大鼠分別給予定喘湯1.5 mL/（100 g·d）（其中含生藥量0.067 g/mL）、宣白承氣湯1.5 mL/（100 g·d）（其中含生藥量0.036 g/mL）煎劑灌胃，E 組用地塞米松溶液0.05 mg/（100 g·d）灌胃，持續(xù)用藥至第35 天實驗結束。A、B 組大鼠用0.9%氯化鈉溶液1.5 mL/（100 g·d）代替灌胃。

2.4 觀察指標

2.4.1 大鼠的一般情況

觀測并記錄實驗各組大鼠一般情況（包括精神狀態(tài)、皮毛色澤），呼吸狀況（包括口、鼻等部位的分泌物、咳喘情況）、排泄狀況（包括大便量、色、質改變）。

2.4.2 大鼠肺泡灌洗液的收集

經藥物干預14 d后，將大鼠沿腹部正中線剪開至胸部，暴露肺組織與氣管，首先結扎右肺，其次用2 mL 注射器將PBS經氣管緩慢推注至左肺，配合按摩將左肺中的灌洗液進行回抽，此步驟共操作3次，最后回收BALF約6 mL 至EP 管，放入離心機以1 500 r/min，4 ℃離心15 min，分離上清液保存至-80 ℃冰箱，待檢相關因子。

2.4.3 大鼠肺組織的收集

經藥物干預14 d 后，將大鼠沿腹部正中線剪開至胸部，暴露肺組織后迅速剪下右肺，置于4%多聚甲醛固定液中備用。

2.4.4 大鼠肺組織HE染色

將置于4%多聚甲醛固定液中24 h 以上的肺組織進行梯度脫水、石蠟包埋、常規(guī)切片、HE 染色及封片，在光學顯微鏡（NIKON，H550S）下觀察各組大鼠肺組織病理變化情況，并采集圖像分析。

2.4.5 BALF中IL－6、TGF－β、IL－17、IL－10含量

取“3.2”項中保存于-80 ℃冰箱的大鼠BALF，提前放置于4 ℃環(huán)境中解凍，嚴格按照ELISA 試劑盒說明書檢測IL－6、TGF－β、IL－17、IL－10在BALF中的含量。

2.5 統(tǒng)計學方法

各組實驗計量數據均用（±s）表示，用SPSS 26.0軟件對數據進行統(tǒng)計學分析并用GraphPad Prism 9.0作圖。滿足正態(tài)分布和方差齊性分析的各組數據，運用one－way ANOVA 檢驗組間差異，運用SNK－q 檢驗進行兩兩間比較。P＜ 0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠一般情況比較

A 組大鼠毛發(fā)柔順光澤，口耳鼻顏色紅潤，無異常出血情況，無異常分泌物產生，四肢溫和，精神狀態(tài)良好，呼吸節(jié)律均勻平穩(wěn)，大便量多，且質地濕潤。

與A組相比，B組大鼠毛發(fā)枯燥凌亂，精神狀態(tài)差，口鼻及耳尖較紅，耳部毛細血管明顯，偶有鼻出血現(xiàn)象，呼吸節(jié)律加快，并可聞及哮鳴音，抓撓口鼻頻率高，周圍可見淡黃色黏性分泌物，大便量少且質地堅硬。

與B 組相比，C 組大鼠整體精神狀態(tài)良好，毛發(fā)較平整，口鼻黏性分泌物減少，偶有喘息氣急、搔鼻、打噴嚏，呼吸節(jié)律隨藥物持續(xù)服用時間延長而呈現(xiàn)平穩(wěn)狀態(tài)，大便量稍有增多且質地變軟；D 組大鼠整體狀態(tài)良好，毛發(fā)光澤平整，口鼻黏性分泌物減少，出血癥狀減少，呼吸較平穩(wěn)，且哮鳴音減少，大便質軟量多；E 組大鼠用藥1 周后各項狀態(tài)較為穩(wěn)定，繼續(xù)用藥后大鼠性情暴躁，肌肉僵直，皮膚松垮，毛發(fā)雜亂枯燥，便稀量多。見表1。

表1 各組大鼠一般情況比較

3.2 肺組織病理學改變

鏡下觀察：A 組未見炎性細胞浸潤，肺泡擴張良好、支氣管黏膜正常；B 組可見肺泡壁大面積增厚，肺泡腔受擠壓而塌陷，并伴有大量嗜酸性粒細胞及淋巴細胞浸潤，偶見支氣管周圍淋巴細胞灶性浸潤，細支氣管上皮細胞脫落，杯狀細胞增生等典型支氣管哮喘病理表現(xiàn)。

與B 組相比，用藥后C 組可見淋巴細胞及粒細胞浸潤減少，肺泡壁小面積增厚，細支氣管上皮細胞脫落；D 組可見淋巴細胞及粒細胞浸潤減少，少量細支氣管上皮細胞脫落；E 組可見少量淋巴細胞浸潤，大面積肺泡壁增厚，細支氣管上皮細胞脫落。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理結果（HE，× 20）

3.3 BALF中IL－6、TGF－β、IL－17、IL－10水平

與A 組相比，B 組大鼠Th17 細胞因子IL－17 水平顯著上升（P＜ 0.01），IL－6水平顯著上升（P＜ 0.01），相反，Treg 細胞因子TGF－β 和IL－10 水平顯著下降（P均 ＜ 0.01）；經給藥治療后，C、D、E 組IL－17、IL－6 水平均顯著下降（P均 ＜ 0.01），IL－10 水平均顯著上升（P均 ＜ 0.01），但TGF－β 水平以D 組上升最為明顯（P＜ 0.01），C 組次之（P＜ 0.05），E 組上升不明顯，差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。見表2。

表2 BALF中IL－6、TGF－β、IL－17、IL－10水平比較（±s，pg/mL）

表2 BALF中IL－6、TGF－β、IL－17、IL－10水平比較（±s，pg/mL）

注：與A組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與B組比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01；與C組比較，$$P ＜ 0.01；與D組比較，△△P ＜ 0.01。

IL－10 10.54 ± 0.87 1.40 ± 0.35**5.27 ± 0.77**##16.62 ± 2.43**##$$45.75 ± 3.06**##$$△△組別A組B組C組D組E組IL－6 0.05 ± 0.01 0.39 ± 0.07**0.18 ± 0.02**##0.12 ± 0.02*##0.24 ± 0.04**##△△TGF－β 123.55 ± 8.16 99.99 ± 2.42**109.20 ± 2.32**#113.03 ± 4.37**##102.15 ± 1.42**△△IL－17 85.47 ± 3.31 124.55 ± 1.37**86.99 ± 2.35##87.15 ± 1.71##104.50 ± 4.87**##$$△△

4 討論

研究表明，在支氣管哮喘的形成過程中，T淋巴細胞扮演著相當重的要角色，研究證明，哮喘的發(fā)生除伴隨Th1/Th2平衡被擾動外，還存在著另一種平衡，即 Th17/Treg免疫平衡也在哮喘的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。Th17和Treg細胞都由初始T淋巴細胞分化而來，但其分化完成后在機體中卻行使著幾乎完全相反的效用［16］，其中Th17表達特異性轉錄因子ROR－γt，主要釋放促炎因子如IL－17、IL－21、IL－22等，特別是機體中IL－17 的表達水平與哮喘患者的嚴重程度呈正相關，而IL－17 的過度表達還會增強Th2 型細胞的免疫應答，從而影響Th1/Th2 免疫平衡，進一步加劇機體免疫反應，引發(fā)更嚴重的哮喘［8-10］。相反，Treg 主要促進如IL－10、TGF－β等抑炎因子的產生，表達特異性轉錄因子Foxp3。研究表明，IL－10能夠同時抑制先天性和適應性免疫反應，恢復上皮細胞完整性，加快組織愈合速度，抑制嗜酸性粒細胞的活化和遷移，從而達到防治哮喘的作用［17］。TGF－β是一個多效性的細胞因子，能夠引起多種細胞反應，包括細胞的生長、分化、遷移和凋亡等，且不同表達水平的TGF－β在初始T細胞向Th17細胞分化的過程中發(fā)揮著不同作用，過高濃度的TGF－β將反向調節(jié)T淋巴細胞，從而抑制其向Th17分化，而中等濃度的TGF－β與IL－6共同作用將會使初始T細胞定向分化為Th17［18-19］。

哮喘屬“哮病”“喘證”范疇，其病機不外乎機體素有痰飲內伏于肺，即張仲景在《金匱要略》中所言：“膈上病痰，滿喘，咳唾……必有伏飲”，再由外邪、飲食不節(jié)、情志不遂等因素誘發(fā)所致，如《癥因脈治·哮病》所言：“偶有七情之犯，飲食之傷，或外有時令之風寒束其肌表，則哮喘之癥作矣”。其證型雖并不統(tǒng)一，但總體不外乎寒熱虛實，其中痰熱壅肺證在臨床調查中被普遍采納，其癥狀常表現(xiàn)為痰鳴如吼、喘息氣粗、痰黃黏稠等一派實熱之象，除此之外，由于肺與大腸相表里，肺氣不宣可致大腸傳導失司，還會出現(xiàn)大便燥結的癥狀，反之大腸腑氣不通也會影響到肺氣的宣降功能，引起喘咳胸悶，加重哮喘，造成痰熱兼腑實的征象。近年來，由于生活條件的改變，造成人們飲食結構發(fā)生變化，痰熱腑實型哮喘的患者發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上漲的趨勢。

因此，由“肺與大腸相表里”引發(fā)的“肺腸合病”，理應“肺腸合治”。其中最有代表性的莫過于吳鞠通所創(chuàng)宣白承氣湯，該方僅用石膏、大黃、杏仁、瓜蔞四藥，上能祛痰定喘，下能通腑血熱，是“肺腸合治”的代表方劑。且臨床上多采用此方治療痰熱壅盛或伴有腑實證的肺系疾病，如廖文豪［20］運用宣白承氣湯加減方治療臨床急性加重期慢性阻塞性肺疾病肺熱腑實證，發(fā)現(xiàn)其可以改善患者臨床癥狀及肺功能指標并降低炎癥因子分泌；包春秀等［21］應用加味宣白承氣湯聯(lián)合西醫(yī)常規(guī)療法治療痰熱閉肺型肺炎支原體肺炎，發(fā)現(xiàn)其可以促進腸道sIgA分泌，修復腸黏膜免疫屏障，從而改善肺部炎癥狀態(tài)；李娥等［22］采用宣白承氣湯加減輔助治療痰熱壅肺型重癥肺炎使患者全身炎癥反應程度降低；蔡海榮等［23］發(fā)現(xiàn)宣白承氣湯可以緩解重癥肺炎患者高熱、氣喘、咳嗽等癥并且對炎癥因子具有明顯抑制作用。

現(xiàn)代藥理學研究表明，宣白承氣湯可以通過調節(jié)免疫細胞分化治療哮喘［11］，因此課題組在此基礎上模擬建立痰熱腑實型哮喘模型，研究發(fā)現(xiàn)模型大鼠肺組織HE 染色出現(xiàn)了炎性細胞浸潤、氣道上皮損傷脫落、肺泡壁增厚、杯狀細胞增生等典型哮喘病理改變，且Th17 細胞因子IL－17 顯著升高，IL－6 顯著升高，Treg細胞因子TGF－β、IL－10 顯著降低，而經宣白承氣湯治療后，肺組織炎性細胞浸潤明顯減輕，肺泡擴張良好，肺泡壁增厚得到緩解，氣道上皮損傷明顯減輕，同時能夠顯著上調TGF－β 和IL－10 水平，下調IL－17和IL－6水平，從而糾正Th17/Treg失衡狀態(tài)，起到減輕哮喘癥狀治療哮喘的作用。

綜上所述，宣白承氣湯可能通過調節(jié)Th17/Treg 免疫平衡及相關細胞因子表達水平達到減輕哮喘癥狀、改善肺部炎癥的目的。