宋麗云，宋麗青，戴薇，曾頻頻，譚立明

1南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330008；2贛州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，贛州 341000；3贛州市人民醫(yī)院急診科，贛州 341000

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見(jiàn)的自身免疫性疾病，以慢性炎癥性滑膜炎為主要病理特征，常表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎癥，部分患者也可并發(fā)肺部、心臟等關(guān)節(jié)外疾病[1]。目前RA 診斷以臨床特征、實(shí)驗(yàn)室和影像學(xué)檢查為依據(jù)，但是RA 的臨床表現(xiàn)復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)室診斷指標(biāo)臨床評(píng)價(jià)不一，因此臨床工作中對(duì)RA 的診斷仍存在不足。近年有研究認(rèn)為，信號(hào)素3A（Semaphorin 3A，Sema3A）蛋白與RA[2]有密切聯(lián)系。信號(hào)素是一類(lèi)含有Sema 結(jié)構(gòu)域的膜結(jié)合型或者分泌型的糖蛋白家族，Sema3A 最先被發(fā)現(xiàn)，且被證明可以調(diào)控和引導(dǎo)神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)[3]。本研究通過(guò)檢測(cè)RA 患者、非RA 患者及健康對(duì)照者血清中Sema3A 的表達(dá)，并聯(lián)合抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體（anti-cyclic citrulline polypeptide antibody，anti-CCP）、類(lèi)風(fēng)濕因子（rheumatoid factor，RF）等指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析來(lái)探討血清Sema3A 對(duì)RA 的診斷及鑒別診斷價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 隨機(jī)選取2021 年1 月至2021 年12 月在贛州市人民醫(yī)院門(mén)診或住院確診的103 例RA 患者，其中男性23 例，女性80 例，年齡30～76 歲，平均（51.18±10.71）歲，病程0.10～30.00 年，且根據(jù)歐洲風(fēng)濕病聯(lián)合會(huì)推薦的RA 疾病活動(dòng)指數(shù)DAS28評(píng)分[4]，將RA 組患者分為兩個(gè)亞組：疾病活動(dòng)組（n=51，DAS28 ≥2.6 分）、疾病非活動(dòng)組（n=52，DAS28 ＜2.6 分）。選取93 例非RA 患者，其中骨關(guān)節(jié)炎（osteo arthritis，OA）33 例，男10 例，女23 例，年齡26～86 歲，平均（58.00±12.72）歲；痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎（gout arthritis，GA）30 例，男8 例，女22 例，年齡33～76 歲，平均（49.06±16.11）歲；強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS)30 例，男9 例，女21 例，年齡23～71 歲，平均（48.17±16.44）歲。所有入組病例均符合相應(yīng)疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5-8]。50 例健康對(duì)照組（healthy controls，HC）來(lái)自贛州市人民醫(yī)院體檢科的健康人群，各系統(tǒng)檢查無(wú)明顯異常，其中男10 例，女40 例，年齡30～60 歲，平均年齡（41.10±7.90）歲。所有樣本資料均在參與者知情同意下獲得，并經(jīng)贛州市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①疾病診斷明確，符合各疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)[5-8]。②臨床資料完整。③參與者知情同意。④健康對(duì)照者各系統(tǒng)檢察無(wú)明顯異常。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他自身免疫性疾病。②合并嚴(yán)重的心腦血管疾病、肝腎功能障礙、血液系統(tǒng)疾病。③合并惡性腫瘤。④感染、腫瘤等其他原因引起的關(guān)節(jié)疼痛。⑤臨床資料缺失。

1.2 方法 標(biāo)本采集：采集入選對(duì)象空腹8 h 以上靜脈血（3.00±0.30）ml，室溫下放置15～30 min，自然凝固后，1024×g 離心15 min，分離血清保存至 -80℃，避免反復(fù)凍融，以備檢測(cè)。

試劑、儀器和方法：Sema3A、anti-CCP 和抗RA33 抗體（anti-RA33 antibody，anti-RA33）檢測(cè)均采用ELISA 法，試劑分別購(gòu)自泉州市睿信生物科技有限公司、德國(guó)雅仕通系統(tǒng)有限兩合公司和深圳市亞輝龍生物科技有限公司，儀器使用安圖Phomo 酶標(biāo)儀。RF 和C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）采用散射比濁法，儀器使用貝克曼公司特定蛋白儀IMAGE800，使用儀器配套試劑。紅細(xì)胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）檢測(cè)采用魏氏法。所有檢測(cè)操作均嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)和贛州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科作業(yè)指導(dǎo)書(shū)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用K-S 檢驗(yàn)和Levene's 檢驗(yàn)分別對(duì)數(shù)據(jù)正態(tài)性和方差齊性進(jìn)行檢驗(yàn)。正態(tài)分布用±s表示，多組間比較用方差分析，兩組正態(tài)分布資料比較用t檢驗(yàn)；偏態(tài)分布資料用中位數(shù)（四分位間距）[M（QR）]表示。各組間年齡、患者血清Sema3A 比較用t檢驗(yàn)，性別比例差異用χ2檢驗(yàn)，anti-CCP、RF 和anti-RA33水平與其他各組之間的比較用非參數(shù)Kruskal-wallis 檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman 相關(guān)系數(shù)，繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線(xiàn)分析各指標(biāo)對(duì)RA 患者的診斷價(jià)值，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清Sema3A、anti-CCP、RF 和anti-RA33水平比較 各組間年齡比較用t檢驗(yàn)，性別比例差異用χ2檢驗(yàn)，結(jié)果不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。RA組Sema3A、anti-CCP、RF 和anti-RA33 表達(dá)水平分別為（27.15±8.19）ng/ml、（131.31±399.50）U/ml、（105.90±167.50）U/ml 和（30.80±23.80）U/ml，與非RA 組和HC 組比較，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。非RA組Sema3A、anti-CCP、RF、anti-RA33 表達(dá)水平與HC 組比較，除Sema3A 外其他均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 各標(biāo)志在各組間表達(dá)水平的比較

2.2 繪制受試者工作特征曲線(xiàn)（ROC）Sema3A 對(duì)RA診斷的曲線(xiàn)下面積為0.76，標(biāo)準(zhǔn)誤為0.03，95%可信區(qū)間（95%CI）為0.70～0.82。比較各標(biāo)志物診斷RA的曲線(xiàn)和曲線(xiàn)下面積可知，Sema3A 診斷RA 曲線(xiàn)下面積比anti-CCP 和RF 更低，比anti-RA33 更高。Sema3A與RF 和anti-RA33 聯(lián)合診斷時(shí)AUC 高于單獨(dú)診斷時(shí)。各標(biāo)志物診斷RA 的ROC 曲線(xiàn)和參數(shù)見(jiàn)圖2、表1。

表1 各標(biāo)志物診斷RA的參數(shù)

圖2 各標(biāo)志物診斷RA的ROC曲線(xiàn)

2.3 各指標(biāo)臨床評(píng)價(jià) 用ROC 曲線(xiàn)對(duì)各項(xiàng)診斷指標(biāo)進(jìn)行分析，特異度最高的是anti-CCP（Sp=0.92），靈敏度最高的是RF（Se=0.82），約登指數(shù)和曲線(xiàn)下面積最高的是anti-CCP（YDI=0.73，AUC=0.85），見(jiàn)表2。

表2 Sema3A、anti-CCP、RF和anti-RA33檢測(cè)結(jié)果的臨床評(píng)價(jià)

2.4 RA 患者血清Sema3A 水平與其他指標(biāo)的相關(guān)性 血清Sema3A 水平與年齡、病程、anti-CCP、RF和anti-RA33 無(wú)相關(guān)性，與ESR、CRP 和DAS28 呈負(fù)相關(guān)，見(jiàn)表3。2.5 RA 組疾病活動(dòng)度與Sema3A 水平的關(guān)系 RA 病情活動(dòng)組和非活動(dòng)組血清Sema3A 蛋白水平分別為（20.03±3.41）ng/ml、（34.13±4.73）ng/ml，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，相關(guān)性分析顯示血清Sema3A 與ESR、CRP、DAS28 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.54，r=-0.66，r=-0.42；P＜0.01），見(jiàn)圖3。

表3 RA患者血清Sema3A水平與其他指標(biāo)的相關(guān)性

圖3 Sema3A表達(dá)水平與RA疾病活動(dòng)度的關(guān)系

3 討論

RA 是一種系統(tǒng)性的自身免疫病，血清中可檢測(cè)到多種自身抗體，這些抗體的檢測(cè)往往是疾病診斷的關(guān)鍵。目前診斷RA 最常用的檢測(cè)指標(biāo)包括 anti-CCP、RF 和anti-RA33，但是RA 患者實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果的差異性較大，臨床上診斷仍存在不足，因此探索新的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)很有必要。anti-CCP 是環(huán)狀聚胍蛋白的多肽片段，在患者血清和關(guān)節(jié)液中均可檢測(cè)，對(duì)RA 的診斷的靈敏度和特異度都較好，對(duì)RA的疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后也具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值[9]。RF是以變性IgG 的片段為靶抗原的自身抗體，是最早用于診斷RA 的標(biāo)志物，靈敏度較高但特異性不強(qiáng)。anti-RA33 是核抗原抗體，被證實(shí)對(duì)早期的RA 具有較好的診斷價(jià)值。Sema3A 是一種分泌型的糖蛋白，廣泛表達(dá)于多種免疫細(xì)胞，如樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞、B 細(xì)胞等。Sema3A 最初的研究主要集中在對(duì)神經(jīng)細(xì)胞和組織的影響作用，近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，Sema3A 是一種免疫調(diào)節(jié)劑，它可以參與到免疫反應(yīng)的所有階段，包括早期啟動(dòng)和晚期階段。Sema3A可以通過(guò)與T 細(xì)胞表面受體結(jié)合，直接影響T 細(xì)胞的活化、增殖及細(xì)胞因子的分泌。Sema3A 也具有對(duì)破骨細(xì)胞合成、分化、遷移的抑制作用，對(duì)成骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用，相當(dāng)于雙倍促進(jìn)骨質(zhì)再生和重塑。Sema3A 還可以與VEGF 爭(zhēng)奪配體的結(jié)合，從而影響VEGF 發(fā)揮促血管生成的作用。這些都有可能是Sema3A 參與到RA 發(fā)病中的機(jī)制。

本研究中，RA 患者的血清Sema3A 檢測(cè)結(jié)果與Teng[10]和Vadasz[11]等的研究結(jié)果類(lèi)似，均表現(xiàn)為比健康對(duì)照者表達(dá)減低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本文結(jié)果顯示RA 患者血清Sema3A 與非疾病對(duì)照組相比表達(dá)減低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而Teng 等[10]比較了RA 患者和OA 患者滑膜液中Sema3A 的表達(dá)水平，Takagawa 等[12]研究RA 和OA 關(guān)節(jié)滑膜組織的Sema3A 的表達(dá)水平，結(jié)果均為RA 組表達(dá)減低，比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與本研究結(jié)果類(lèi)似。

在本研究中，將Sema3A、anti-CCP、RF 和anti-RA33 共4 個(gè)指標(biāo)對(duì)RA 的診斷效能進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，使用指標(biāo)單獨(dú)診斷時(shí)，anti-CCP 的曲線(xiàn)下面積（0.85）和特異度（0.92）最高，RF 的靈敏度最高（0.82），anti-RA33 無(wú)論是曲線(xiàn)下面積（0.70）還是靈敏度（0.61）、特異度（0.76）都是最低，與其他研究者結(jié)果大致相符[12]。Sema3A 對(duì)RA 診斷的AUC 為0.76，標(biāo)準(zhǔn)誤為0.03，95%可信區(qū)間為0.70～0.82。Sema3A 的曲線(xiàn)下面積（0.76）與RF 接近，將Sema3A 與其他指標(biāo)進(jìn)行聯(lián)合診斷時(shí)，曲線(xiàn)下面積均有升高，其中與anti-CCP 聯(lián)合時(shí)曲線(xiàn)下面積達(dá)0.92，與RF 聯(lián)合時(shí)達(dá)0.91。因此，Sema3A 對(duì)RA 具有一定的診斷價(jià)值，且聯(lián)合anti-CCP、RF、anti-RA33 時(shí)診斷價(jià)值均有所提高。

本研究根據(jù)疾病活動(dòng)度將RA 分成不同的小組，比較Sema3A 的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平隨著疾病活動(dòng)度的升高而減低。進(jìn)一步做相關(guān)性分析得出Sema3A 與疾病嚴(yán)重程度指標(biāo)，ESR、CRP、DAS28呈負(fù)相關(guān)（r=-0.54，r=-0.66，r=-0.42；P＜0.01）。說(shuō)明Sema3A 有望成為判斷RA 疾病嚴(yán)重程度的標(biāo)志物。

綜上所述，Sema3A 對(duì)RA 患者具有良好診斷價(jià)值及鑒別診斷價(jià)值，且可以用來(lái)判斷RA 疾病的嚴(yán)重程度，有望成為RA 的生物診斷標(biāo)志物。