蔣之琛，劉明坤,3，王文岐，吳富村,3，李莉,3，張德超,3

（1.中國科學(xué)院海洋研究所，山東 青島 266071；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.中國科學(xué)院海洋大科學(xué)中心，山東 青島 266071；4.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266237）

長牡蠣（Crassostrea gigas）肉質(zhì)富含蛋白質(zhì)、?；撬岷途S生素及許多有利于人體健康的微量元素，具有極高的食用價(jià)值[1]，是我國近岸沿海的重要海水養(yǎng)殖種類。威海乳山地區(qū)位于山東半島的東南端，天然的地理環(huán)境優(yōu)勢使乳山成為我國北方主要牡蠣養(yǎng)殖區(qū)，年產(chǎn)量居全國首位[2]，全產(chǎn)業(yè)鏈產(chǎn)值過百億元，是乳山漁業(yè)經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)，具有非常大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開發(fā)潛力。

牡蠣屬于濾食性雙殼綱貝類，能濾食周圍水體中直徑低于50 μm 的幾乎所有微粒,包括微生物和病毒，進(jìn)食時(shí)大量海洋微生物進(jìn)入牡蠣的濾食及消化器官[3]。牡蠣的胃和鰓含有豐富的共附生微生物，可作為幾種雙殼綱貝類幼蟲變態(tài)的誘導(dǎo)劑[4]。共附生微生物還可以為雙殼綱貝類宿主提供生長因子，如維生素和氨基酸，有助于食物消化；產(chǎn)生保護(hù)宿主免受病原體感染的抗菌劑[5]。很多雙殼類軟體動(dòng)物在抵御致病細(xì)菌的同時(shí)，也會(huì)選擇與某些細(xì)菌進(jìn)行特異性互惠共生，在長久的共同演化中，牡蠣等雙殼綱貝類與共附生細(xì)菌形成了復(fù)雜多樣的種間關(guān)系[6]。

目前關(guān)于長牡蠣共附生微生物的研究較少，主要集中在養(yǎng)殖環(huán)境或養(yǎng)殖模式等因素對(duì)牡蠣的影響[7-9]。本文研究了乳山長牡蠣養(yǎng)殖區(qū)內(nèi)長牡蠣胃部與鰓部可培養(yǎng)的共附生細(xì)菌多樣性，同時(shí)篩選副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）拮抗菌，可為乳山牡蠣的生產(chǎn)管理及弧菌防治提供相關(guān)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

2020 年6 月7 日、7 月10 日、7 月30 日、8 月25 日和9 月25 日采集了山東省威海市乳山牡蠣養(yǎng)殖區(qū)的長牡蠣樣品（每批次7～10 只），放入保溫箱內(nèi)冷藏運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用滅菌海水清洗外殼后，在超凈臺(tái)無菌條件下用滅菌刀具提取牡蠣胃和鰓。

1.1.2 培養(yǎng)基和主要試劑

R2A固體培養(yǎng)基：蛋白胨0.5 g/L，酵母粉0.5 g/L，葡萄糖0.5 g/L，淀粉0.5 g/L，K2HPO40.3 g/L，MgSO40.05 g/L，丙酮酸鈉0.3 g/L，瓊脂20 g/L。過濾海水配制，pH 7.0，高壓蒸汽滅菌（115 ℃，30 min）。

2216E 固體培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/L，酵母粉1 g/L，瓊脂粉20 g/L，過濾海水配制，pH 7.6～7.8，高壓蒸汽滅菌（121 ℃，20 min）。

M1 固體培養(yǎng)基：蛋白胨2 g/L，酵母粉1 g/L，淀粉10 g/L，瓊脂20 g/L。過濾海水配制，pH 7.0，高壓蒸汽滅菌（121 ℃，20 min）。

主要試劑：細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒及PCR 相關(guān)試劑購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.3 指示菌及培養(yǎng)條件

供試指示菌副溶血性弧菌購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號(hào)為CGMCC 1.1997。使用2216E 海水培養(yǎng)基25 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 乳山長牡蠣共附生細(xì)菌的分離培養(yǎng)、鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化分析

將長牡蠣胃和鰓分別置于滅菌的玻璃勻漿器中，加入1 mL 無菌生理鹽水磨成漿，用生理鹽水進(jìn)行10 倍系列梯度稀釋，涂布在三種不同的固體培養(yǎng)基上，25 ℃倒置培養(yǎng)7 d，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等特征挑取不同單菌落，每個(gè)菌落至少純化2 次。

采用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取分離菌株的DNA，以27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1541R（5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’）為引物，PCR 擴(kuò)增得到16S rRNA 基因。PCR 反應(yīng)體系為40 μL，其中含1 μL 27F，1 μL 1541R，20 μL 2×Taq PCR Mastermix，16 μL ddH2O，2 μL 細(xì) 菌DNA模板。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min 之后，94 ℃1 min，55℃1 min，72℃1.5 min，30 次循環(huán)，72 ℃延伸1.5 min，4 ℃保藏。PCR 產(chǎn)物送至北京擎科生物有限公司測序分析，經(jīng)過與NCBI 數(shù)據(jù)庫比對(duì)，明確細(xì)菌的分類地位。利用MEGA 軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.2 副溶血性弧菌拮抗菌的篩選

采用紙片擴(kuò)散法[10]檢測抗菌效果。胃鰓分離到的不同共附生細(xì)菌與副溶血性弧菌指示菌CGMCC 1.1997 的培養(yǎng)：分別從各自斜面接種到2216E 液體培養(yǎng)基中，搖床25 ℃，160 r/min 培養(yǎng)36 h。在超凈工作臺(tái)，吸取120 μL 副溶血性弧菌指示菌菌液，用一次性無菌涂布棒均勻涂在2216E 固體培養(yǎng)基平板，靜置0.5 h。將濾紙片（滅菌烘干）浸入待測菌株發(fā)酵液，輕輕放在涂布弧菌指示菌的2216E 平板上，將浸入滅菌2216E 液體培養(yǎng)基中的濾紙片（滅菌烘干）放在同一個(gè)平板上作為空白對(duì)照。25 ℃下恒溫培養(yǎng)，如果平板出現(xiàn)抑菌圈，而空白對(duì)照無抑菌圈，則表明待測菌株對(duì)副溶血性弧菌具有拮抗作用。

1.2.3 副溶血性弧菌拮抗菌與副溶血性弧菌發(fā)酵液的OD 值和對(duì)應(yīng)活菌數(shù)預(yù)實(shí)驗(yàn)

將副溶血性弧菌拮抗菌和副溶血性弧菌CGMCC 1.1997 分別接種于25 mL 2216E 液體培養(yǎng)基，搖床25 ℃，160 r/min 培養(yǎng)24～36 h。選用600 nm 波長紫外可見分光光度計(jì)，以滅菌后未接種的2216E 培養(yǎng)基為空白對(duì)照，測定兩者發(fā)酵液的OD 值，用平板計(jì)數(shù)法檢測兩者發(fā)酵液OD 值對(duì)應(yīng)的活菌數(shù)。

1.2.4 副溶血性弧菌拮抗菌與副溶血性弧菌不同比例混合競爭培養(yǎng)

將副溶血性弧菌拮抗菌和副溶血性弧菌CGMCC 1.1997 分別接種于25 mL 2216E 液體培養(yǎng)基，搖床25 ℃，160 r/min 培養(yǎng)，測定兩者發(fā)酵液的OD 值。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將副溶血性弧菌拮抗菌和副溶血性弧菌CGMCC 1.1997 發(fā)酵液濃度調(diào)整為109CFU/mL。

將副溶血性弧菌拮抗菌和副溶血性弧菌CGMCC 1.1997 的兩種發(fā)酵液分別按1∶1 和1∶10 體積比，加入對(duì)應(yīng)的2216E 液體培養(yǎng)基中，以不加副溶血性弧菌拮抗菌為對(duì)照組，每組三個(gè)重復(fù)，振蕩培養(yǎng)24 h 后，稀釋涂布，計(jì)算副溶血性弧菌拮抗菌和副溶血性弧菌CGMCC 1.1997 濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳山長牡蠣共附生細(xì)菌的分離鑒定

從乳山5 次采集的長牡蠣樣品中，共分離獲得422 株共附生細(xì)菌，經(jīng)過形態(tài)觀察和16S rRNA 基因測序，剔除同批次重復(fù)菌株后共獲得258 株細(xì)菌，篩選后得到119 種不同菌株的16S rRNA 基因序列（系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系如圖1），上傳至NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫。其中，從長牡蠣鰓和胃分別分離到4 種和13 種弧菌，弧菌16S rRNA 基因序列登錄號(hào)分別為MW559525～MW559528 和MW559496、MW559498、MW559499、MW559503、MW559504、MW559507、MW559509、MW559510、MW559514、MW559516、MW559518、MW559521、MW 559523；除弧菌外，長牡蠣鰓和胃分別分離獲得54 種和71 種共附生細(xì)菌，16S rRNA 基因序列登錄號(hào)分別為OP522051～OP522104 和OP521932～OP522002。

圖1 長牡蠣胃和鰓共附生菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Neighbor-joining (NJ) phylogenetic tree of symbiotic bacteria isolated from stomach and gill of Pacific oyster Crassostrea gigas

2.1.1 長牡蠣鰓部共附生菌多樣性分析

5 批次的乳山長牡蠣鰓部共分離共附生細(xì)菌89 株，囊括了5 個(gè)綱39 個(gè)屬和58 個(gè)種，包括一個(gè)潛在新種ML-310。形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，菌落顏色以橘黃、米黃和白色為主，部分菌落呈現(xiàn)透明狀或半透明狀，一些菌落表面褶皺。有1 株噬瓊膠假交替單胞菌（Pseudoalteromonas agarivorans）有降解瓊脂的現(xiàn)象（圖2）；有2 株產(chǎn)黑假交替單胞菌（P.nigrifaciens）和水蛹假交替單胞菌（P.undina）可產(chǎn)生色素（圖2）。

圖2 部分菌株降解瓊脂效果與產(chǎn)色素情況Fig.2 Agar degradation and pigment production for some strains

主要類群包括變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）4 大類群。變形菌門為主要共附生細(xì)菌類群，占比約60.7%，其余三種分別占比15.7%、20.2% 和3.4% 。其 中，γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）占比44%，為主要優(yōu)勢菌類群，其次為放線菌綱（Actinobacteria）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、芽孢桿菌綱（Bacilli）和黃桿菌綱（Flavobacteriia）（圖3-A）。屬水平的多樣性如圖3-C 所示，其中塩屋埼假交替單胞菌（P.shioyasakiensis）、特基拉芽胞桿菌（Bacillus tequilensis）和藤黃微球菌（Micrococcus luteus）在3個(gè)批次以上的長牡蠣鰓部樣品中都分離到，可能是乳山長牡蠣鰓部優(yōu)勢共生菌。長牡蠣鰓部共發(fā)現(xiàn)4株不同的弧菌（圖1），分別為海濱弧菌（Vibrio litoralis）、波氏弧菌（V.pomeroyi）、塔斯曼尼亞弧菌（V.tasmaniensis）和巴西弧菌（V.brasiliensis）。

圖3 長牡蠣可培養(yǎng)共附生細(xì)菌多樣性Fig.3 Diversity of cultured symbiotic bacteria isolated from Pacific oyster Crassostrea gigas

2.1.2 長牡蠣胃部共附生細(xì)菌多樣性分析

從5 批次的乳山長牡蠣胃部共分離共附生細(xì)菌169 株，囊括了6 個(gè)綱45 個(gè)屬和84 種。形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，菌落以米黃、黃、橘色和白色為主，部分菌落呈透明或半透明狀，一些菌落表面褶皺。有4 株細(xì)菌可以產(chǎn)生色素，4 株細(xì)菌有降解瓊脂的現(xiàn)象（圖2），分別為假交替單胞菌（P.hodoensis）、海濱噬瓊膠菌（Agarivorans litoreus）、白色噬瓊膠菌（A.albus）和河口噬瓊膠菌（A.aestuarii）。胃部分離的共附生細(xì)菌主要類群包括變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門4 大類群。變形菌門為主要類群，占比約77.7%，其余三種分別占11.5%、7.2%和3.6%。γ-變形菌綱為主要優(yōu)勢類群，占63%（圖3-B），屬水平的多樣性見圖3-C。

共有4 批長牡蠣樣品的胃部分離到13 種弧菌。新喀里多尼亞弧菌（V.neocaledonicus）、燦爛弧菌（V.splendidus）、巴西弧菌（V.brasiliensis）和V.cortegadensis 出現(xiàn)批次均在3 次及以上。系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及多樣性分析結(jié)果表明，本研究分離培養(yǎng)方法獲得的絕大部分弧菌均來自于長牡蠣的胃（圖1），表明胃部分布的弧菌遠(yuǎn)多于鰓部。

2.2 副溶血性弧菌拮抗菌的篩選及混合競爭培養(yǎng)結(jié)果

紙片擴(kuò)散法檢測的119 株不同乳山長牡蠣胃鰓共附生細(xì)菌的抗弧菌效果發(fā)現(xiàn)，ML-231 殺魚假交替單胞菌（P.piscicida）對(duì)副溶血性弧菌指示株有較強(qiáng)的拮抗作用（圖4）?；旌细偁幣囵B(yǎng)后，殺魚假交替單胞菌ML-231 能明顯抑制副溶血性弧菌的生長（表1）。當(dāng)殺魚假交替單胞菌ML-231 和副溶血性弧菌按照1∶1 的濃度混合培養(yǎng)后，副溶血性弧菌的濃度由對(duì)照組的109CFU/mL 降至107CFU/mL，當(dāng)菌株ML-231 和副溶血性弧菌按照10∶1 的濃度混合培養(yǎng)后，副溶血性弧菌的濃度由對(duì)照組的109CFU/mL 降至106CFU/mL。

表1 殺魚假交替單胞菌ML-231 與副溶血性弧菌混合競爭培養(yǎng)Tab.1 Mixed culture of P.piscicida ML-231 and V.parahemolyticus

圖4 殺魚假交替單胞菌ML-231 對(duì)副溶血性弧菌的抑制圈Fig.4 Inhibition zones produced by P.piscicida ML-231 to V.parahemolyticus

3 討論

3.1 乳山長牡蠣共附生細(xì)菌多樣性

長牡蠣是世界上養(yǎng)殖量最大的經(jīng)濟(jì)貝類之一。長期高密度養(yǎng)殖及人為活動(dòng)的嚴(yán)重污染等導(dǎo)致近海區(qū)域內(nèi)養(yǎng)殖水域環(huán)境的惡化，使牡蠣等貝類對(duì)病原抵抗力下降，外界環(huán)境因子的變化和刺激同樣使得牡蠣共附生微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度發(fā)生改變。本研究分離培養(yǎng)了乳山長牡蠣胃和鰓的共附生細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)長牡蠣共附生細(xì)菌主要優(yōu)勢類群為變形菌門。Yu 等[11]采用16S rDNA 序列V3-V4 區(qū)高通量測序手段，分析廣東省三個(gè)城市（廣州、珠海和江門）水產(chǎn)市場的長牡蠣微生物群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)變形菌門為主要門。該門5 個(gè)最主要的屬包括弧菌屬和希瓦氏菌屬（Shewanella），本研究均分離得到這2 個(gè)屬的菌株。一般認(rèn)為，希瓦氏菌是牡蠣冷藏運(yùn)輸中產(chǎn)生的腐敗菌。本結(jié)果表明，希瓦氏菌存在于長牡蠣體內(nèi)，可能更適應(yīng)在低溫環(huán)境下生長繁殖，而不是外部污染的雜菌。王煥南等[12]從日照海域野生牡蠣中分離得到62 株共生細(xì)菌，大部分為變形菌門的假交替單胞菌屬，其余為弧菌屬、芽孢菌屬和交替單胞菌屬等，與本研究分離結(jié)果相似。它們可能是普遍的牡蠣共附生細(xì)菌種類。

本研究中，長牡蠣胃部共附生細(xì)菌種類較鰓部更為豐富，可能與該時(shí)期攝食的藻類等浮游生物種類豐富有關(guān)，有23 種共附生細(xì)菌在牡蠣胃部與鰓部均有存在。從胃部分離到的3 種噬瓊膠菌和1 種假交替單胞菌，具有降解瓊脂的能力。這些菌株通過產(chǎn)瓊膠酶降解瓊脂多糖，可能有助于牡蠣消化吸收攝食的藻類。從胃中分離的菌株ML-310，同分離自中國南海石磺屬無脊椎動(dòng)物的海藻桿菌（Algibacter onchidii）16S rRNA 基因序列的相似性為94.9%[13]，推測其為海藻桿菌屬的一個(gè)新種。

近些年，我國和其他很多國家面臨養(yǎng)殖牡蠣在夏季大規(guī)模死亡的問題，給相關(guān)養(yǎng)殖業(yè)帶來沉重打擊，因而調(diào)查牡蠣死亡的原因至關(guān)重要。弧菌作為長牡蠣養(yǎng)殖中的常見機(jī)會(huì)性致病細(xì)菌類群，分布區(qū)域廣，海水溫度升高更利于其生長繁殖與毒力因子表達(dá)，通常與夏季牡蠣的高死亡率有關(guān)[14]。本研究連續(xù)跟蹤乳山牡蠣養(yǎng)殖區(qū)夏季高溫期6—9 月份5個(gè)批次的長牡蠣樣品，所分離到的弧菌主要分布在長牡蠣的胃部，加之鰓部，共分離到16 種弧菌，其中很多弧菌為已報(bào)道或潛在的牡蠣病原菌，可能導(dǎo)致牡蠣染病甚至死亡[15]。據(jù)報(bào)道，胃部出現(xiàn)頻次較高的燦爛弧菌與影響全球范圍內(nèi)長牡蠣產(chǎn)量的夏季高死亡率有關(guān)[16]，從遭受“夏季死亡綜合癥”的牡蠣中分離出的燦爛弧菌GP32，注射到雙殼類動(dòng)物時(shí)顯示出高致病性并導(dǎo)致死亡[17]。高曉建等[18]發(fā)現(xiàn)，哈維氏弧菌（V.harveyi）是引起連云港養(yǎng)殖長牡蠣大規(guī)模死亡的主要病因。Wang 等[19]報(bào)道了中國北方長牡蠣夏季高溫期死亡的主要致病菌有巴西弧菌、維氏弧菌、燦爛弧菌和歐文弧菌（V.owensii）等。上述弧菌均在本研究中分離得到，其中巴西弧菌在胃和鰓均分離得到。胃分離的其他弧菌，如新喀里多尼亞弧菌（V.neocaledonicus）、沙氏弧菌（V.chagasii）和施羅氏弧菌（V.shilonii）均為水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物常見致病菌[20,21]，是長牡蠣生長過程中的潛在威脅。鰓部分離的弧菌有塔斯曼尼亞弧菌（V.tasmaniensis）能作為牡蠣血細(xì)胞的兼性細(xì)胞內(nèi)病原體，在牡蠣幼蟲死亡事件中有報(bào)道[22]。

3.2 副溶血性弧菌拮抗菌

副溶血性弧菌是貝殼常見的主要致病菌，盡管本文在長牡蠣樣品中沒有分離到這種致病菌，但從牡蠣的胃中分離的一株殺魚假交替單胞菌ML-231對(duì)副溶血性弧菌有很強(qiáng)的抑制作用。ML-231 與副溶血性弧菌不同比例混合競爭培養(yǎng)時(shí)，能有效抑制副溶血性弧菌的生長繁殖，推測殺魚假交替單胞菌ML-231 可能通過分泌胞外代謝產(chǎn)物，并利用營養(yǎng)競爭作用，抑制副溶血性弧菌的生長。有研究發(fā)現(xiàn)，假交替單胞菌某些類群對(duì)弧菌具有良好的拮抗作用[23]。王楓林等[24]報(bào)道了一株殺魚假交替單胞菌2515 對(duì)鰻弧菌（V.anguillarum）和副溶血性弧菌有拮抗作用。本研究的ML-231 為長牡蠣弧菌病生物防控提供了菌種資源。

3.3 結(jié)論

本研究通過分離培養(yǎng)的方法，分析了高溫期乳山長牡蠣胃和鰓可培養(yǎng)共附生細(xì)菌多樣性。分離菌株主要為變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門4 個(gè)類群，囊括了6 個(gè)綱，63 個(gè)屬，119 個(gè)種；長牡蠣胃部共附生細(xì)菌多樣性高于鰓部，共分離到16種弧菌。多種弧菌為已報(bào)道或潛在的牡蠣病原性細(xì)菌，可能與夏季長牡蠣的高死亡率有關(guān)；篩選出1株副溶血性弧菌拮抗菌，可對(duì)于今后乳山長牡蠣的生產(chǎn)管理及弧菌防治提供一定的參考意見。