吳雅婷，武尊，高浩峰，何學(xué)欣，程浩森，邵蓬

（天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384）

珍珠龍膽石斑魚(yú)（褐點(diǎn)石斑魚(yú)Epinephelus fuscoguttatus ♀× 鞍帶石斑魚(yú)E.lanceolatus）是一種肉質(zhì)細(xì)嫩、生長(zhǎng)速度快、抗病力強(qiáng)，具有很大潛在市場(chǎng)價(jià)值的石斑魚(yú)雜交種。研究表明，諾卡氏菌對(duì)石斑魚(yú)（Epinephelus sp.）、紅笛鯛（Lutjanus sanguineus）等主要海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)同樣具有致病性。隨著海水種苗頻繁的流通和檢驗(yàn)措施的缺乏，諾卡氏菌有蔓延和傳染其他魚(yú)類(lèi)的趨勢(shì)，發(fā)病率也日益增加[6]。

目前多用抗生素防治諾卡氏菌病，但水產(chǎn)品質(zhì)量和環(huán)境污染問(wèn)題日益突出，且不同地區(qū)、不同來(lái)源和不同宿主的菌株對(duì)某些抗生素的敏感性往往差異較大，為諾卡氏菌病的治療帶來(lái)了較大的困難。諾卡氏菌病疫苗的研究大多集中在福爾馬林滅活疫苗、弱毒疫苗等。這些傳統(tǒng)疫苗在養(yǎng)殖生產(chǎn)中均未得到大規(guī)模的推廣和應(yīng)用，且尚未見(jiàn)到口服疫苗防治的研究。從動(dòng)物福利、方便程度、節(jié)省成本等角度考慮，口服接種都是水產(chǎn)動(dòng)物比較理想的免疫接種方式?？诜庖咭话悴捎冒栾暱诜?，將疫苗口腔灌入，經(jīng)胃、腸進(jìn)入魚(yú)類(lèi)后腸部位被吸收，引發(fā)免疫應(yīng)答以研究疫苗的免疫性能。相同免疫效果下，口服免疫是水產(chǎn)養(yǎng)殖最為理想的免疫接種方式。本實(shí)驗(yàn)采用海藻酸鈉天然高分子聚合物作為諾卡氏菌全菌滅活疫苗的包被載體制作口灌疫苗，分析評(píng)價(jià)了該疫苗的安全性和保護(hù)效果，意為我國(guó)諾卡氏菌病害的防控和疫苗研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 滅活疫苗的制備

1.3 口服疫苗的制備

參照薛淑霞等[7]的專(zhuān)利，結(jié)合諾卡氏菌的形態(tài)特征及生長(zhǎng)特性等，選用海藻酸鈉作為口服疫苗的載體，制備N(xiāo)K1001 滅活疫苗微球，口灌珍珠龍膽石斑魚(yú)。操作步驟如下：

（1）將滅活的濃度為1×108CFU/mL 諾卡氏菌菌液，加入到等體積、質(zhì)量濃度為3%的海藻酸鈉水溶液中，磁力攪拌器中600 r/min，10 min；

（2）將上述溶液按體積比1∶2 加入花生油，得到水油混合物，加入水油混合物體積1%的span80，1 200 r/min 攪拌15 min；

（3）加入等體積的質(zhì)量濃度4%CaCl2水溶液混合，1 200 r/min 攪拌15 min，800 r/min 繼續(xù)攪拌1 h，形成油包水型乳液；

（4）3 000 r/min 離心4 min 去除上層油相和水相，留沉淀，重復(fù)兩次；

（5）加入35%酒精清洗油相，加入離心管2/3 左右后混勻，12 000 r/min，離心10 min，重復(fù)三次；

（6）按照去除的水相和油相的總體積一倍的比例加入超純水重懸，得懸濁液。

1.4 珍珠龍膽石斑魚(yú)的免疫及樣品采集

將健康珍珠龍膽石斑魚(yú)隨機(jī)分為兩組：實(shí)驗(yàn)組雜交石斑魚(yú)口服疫苗微球，對(duì)照組雜交石斑魚(yú)口服生理鹽水微球，每組80 尾?？紤]到免疫耐受度和口服疫苗的總量，將投喂周期定為21 d，每次口灌200 mL，灌三停四為一周，后兩次投喂可認(rèn)為是加強(qiáng)免疫和二次加強(qiáng)免疫（圖1）。

分別在第一次免疫后，第二次免疫前（1 d）；第二次免疫后，第三次免疫前（2 d）；第三次免疫后（3 d），免疫第一輪結(jié)束后（7 d）、免疫第二輪結(jié)束后（14 d）、免疫第三輪結(jié)束后（21 d）、免疫結(jié)束后一星期（28 d），按照7 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每次分別從免疫組和對(duì)照組隨機(jī)選取9 尾石斑魚(yú)分別取出頭腎、肝臟、脾臟組織，于-80 ℃保存。

1.5 免疫保護(hù)率測(cè)定

在口服免疫4 周后進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，每尾腹腔注射100 μL諾卡氏菌液，攻毒濃度為1×108CFU/mL。記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算相對(duì)免疫保護(hù)率（RPS）。

1.6 石斑魚(yú)肝臟相關(guān)免疫指標(biāo)檢測(cè)

從-80 ℃冰箱取出待檢測(cè)肝臟組織，分別測(cè)定肝臟的堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LSZ）、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性，及蛋白濃度（考馬斯亮藍(lán)法）。相關(guān)試劑配制、操作方法及計(jì)算公式參考南京建成生物工程研究所試劑盒內(nèi)的說(shuō)明書(shū)。

1.7 珍珠龍膽石斑魚(yú)免疫基因表達(dá)變化測(cè)定

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法檢測(cè)免疫基因在對(duì)照組和免疫組不同時(shí)間的表達(dá)變化。將分別提取各實(shí)驗(yàn)組魚(yú)頭腎、脾臟、肝臟組織中的RNA，反轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的cDNA，以cDNA 為模板，利用免疫相關(guān)基因的引物[8-12]，進(jìn)行PCR 反應(yīng)。按照表1 在冰上制備熒光定量反應(yīng)體系，免疫相關(guān)基因引物見(jiàn)表2。依據(jù)最佳反應(yīng)條件，以β-actin 為內(nèi)參進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)程序設(shè)定：95 ℃30 s；（95 ℃，5 s；60 ℃，30 s）40 個(gè)循環(huán)；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min，95 ℃，15 s。

表1 熒光定量反應(yīng)體系Tab.1 Fluorescence quantitative reaction system

表2 免疫相關(guān)基因引物Tab.2 Primers of immune related genes

1.8 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用2-△△CT法分析免疫基因相對(duì)表達(dá)量的變化，運(yùn)用SPSS 23.0 軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，應(yīng)用GraphPad Prism 8.4.3 制圖，用*表示數(shù)據(jù)差異顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 微球疫苗的粒徑、包封率及人工胃液腸液情況

微球成球性較高，基本呈圓形，粒徑相對(duì)均一，粒徑普遍小于50 μm，平均為（33.85±7.53）μm，外部游離菌體少（圖2）。

圖2 海藻酸鈉微球形態(tài)Fig.2 Form of sodium alginate microspheres

2.2 免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

免疫周期結(jié)束7 d 后，對(duì)免疫組和對(duì)照組的攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組在14 d 內(nèi)全部死亡，實(shí)驗(yàn)組RPS 為67%。

2.3 口服疫苗對(duì)石斑魚(yú)非特異性免疫指標(biāo)的影響

石斑魚(yú)在口服微球疫苗后，ACP 活力有兩次顯著升高（圖3）：口服疫苗第3 d 和第7 d；對(duì)照組在第2 d 顯著下降（P＜0.05），在3 d 和7 d 極顯著升高（P＜0.01），在第21 d 和28 d 顯著下降（P＜0.01），其余時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著變化；CAT 活力整體呈先升高再下降趨勢(shì)，在免疫第后1 d、2 d、3 d 和7 d 極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），在第28 d 顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），在第14 d 和28 d 無(wú)顯著變化；LZM活力整體呈下降趨勢(shì)，第1 d 和7 d 顯著性升高（P＜0.05）在第2 d、21 d 和28 d 極顯著下降（P＜0.01），其余時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著變化。SOD 活力整體變化趨勢(shì)為先降低后升高再降低的趨勢(shì)，免疫后的第1～28 d 均顯著低于對(duì)照組。

圖3 疫苗免疫后石斑魚(yú)肝臟中ACP、CAT、LZM、SOD 活性隨時(shí)間的變化Fig.3 The changes in activities of ACP,CAT,LZM and SOD in liver of the hybrid grouper after vaccination with time

2.4 口服疫苗后珍珠龍膽石斑魚(yú)部分免疫相關(guān)基因的表達(dá)

2.4.1 TLR 信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)

如圖4 所示，口服疫苗免疫后，石斑魚(yú)基因TLR2 在頭腎、脾臟、肝臟組織中的表達(dá)量均有上調(diào)趨勢(shì)，在頭腎中，除第7 d 和28 d 無(wú)顯著性變化，其余時(shí)間均檢測(cè)到顯著上調(diào)；在脾臟中，除第28 d 無(wú)顯著性變化，第14 d 顯著性上調(diào)了8 倍；在肝臟中，除第2 d 和21 d 無(wú)顯著變化，第1 d、第3 d、第7 d、第14 d 和第28 d 均檢測(cè)到顯著性上調(diào)。

圖4 口服免疫后TLR 通路相關(guān)基因在各組織中的表達(dá)量Fig.4 The expression level of TLR pathway related genes in tissues after oral vaccination

基因TLR3 在頭腎、脾臟、肝臟中的表達(dá)量均有上調(diào)趨勢(shì)，在頭腎中，除第28 d 無(wú)顯著性變化，其余時(shí)間點(diǎn)均檢測(cè)到顯著性下調(diào)；在脾臟中，除第2 d 無(wú)顯著性變化，其他時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比均檢測(cè)到顯著性上調(diào)，第21 d 顯著性上調(diào)了8.3 倍；在肝臟中，除第7 d、21 d、第28 d 無(wú)顯著性變化，第1 d、第2 d和第3 d 均檢測(cè)到顯著性上調(diào)，分別上調(diào)19.6 倍、3.0 倍和2.9 倍，而14 d 檢測(cè)到顯著性下調(diào)。

基因MyD88 在頭腎中，除第3 d 和第28 d 無(wú)顯著性變化，其余時(shí)間均檢測(cè)到顯著性上調(diào)；在脾臟中，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比均檢測(cè)到顯著性變化，第3 d、21 d 分別上調(diào)了7.8 倍和11.7 倍；在肝臟中，除7 d、14 d 無(wú)顯著性變化，第3 d 顯著性下調(diào)，第1 d、2 d、21 d 和28 d 顯著性上調(diào)，分別上調(diào)了14.5 倍、7.7 倍、6.1 倍和7.8 倍。

2.4.2 細(xì)胞因子類(lèi)相關(guān)基因表達(dá)

口服疫苗免疫后，基因IL-12p40 在石斑魚(yú)頭腎中的表達(dá)，除第28 d 無(wú)顯著性變化，其余時(shí)間均檢測(cè)到顯著性上調(diào)，第1 d、第2 d 和第3 d 分別上調(diào)了9.3 倍、8.0 倍和5.7 倍，整體趨勢(shì)呈第一天增長(zhǎng)隨后遞減；在脾臟中，除第2 d 無(wú)顯著性變化，其他時(shí)間與對(duì)照組相比均顯著性上調(diào)，第7 d 顯著性上調(diào)12 倍；在肝臟中，在14 d、28 d 均檢測(cè)到顯著性上調(diào)，分別上調(diào)2.2 倍和7.0 倍，其他時(shí)間與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（圖5）。

圖5 口服免疫后IL-12p40 和TNF-α 在各組織中的表達(dá)量Fig.5 The expression level of IL-12p40 and TNF-α genes in tissues after oral vaccination

口服疫苗免疫后，基因TNF-α 在頭腎中的表達(dá)，除第3 d 有顯著性變化，21 d 無(wú)變化，其余時(shí)間與對(duì)照組相比有微量上調(diào)，但與對(duì)照均無(wú)顯著性；在脾臟中，第1 d、21 d 和28 d 顯著性上調(diào)，分別為18 倍、48 倍和20 倍；在肝臟中，與對(duì)照組相比所有時(shí)間顯著性上調(diào)，第1 d 顯著性升高117.1 倍，整體趨勢(shì)先上升后下降，隨時(shí)間變化趨于穩(wěn)定，在第21 d和28 d 分別顯著上調(diào)24.4 倍和38.8 倍。

2.4.3 細(xì)胞表面分子相關(guān)基因表達(dá)

口服疫苗免疫后，基因MHCII 在頭腎中的表達(dá)，在第28 d 無(wú)顯著性變化，其余時(shí)間顯著性下調(diào)；在脾臟中，除第3 d、第7 d 和第21 d 無(wú)顯著性變化，其余時(shí)間顯著上調(diào)，其中第1 d 和第14 d 分別上調(diào)了19.9 倍和18.0 倍；在肝臟中，除1 d、2 d、7 d無(wú)顯著變化，3 d、14 d、21 d 和28 d 分別顯著上調(diào)4.2 倍、7.8 倍、7.6 倍和5.5 倍（圖6）。

圖6 口服免疫后雜交石斑魚(yú)MHCII 在各組織中的表達(dá)量Fig.6 The expression level of MHCII genes in different tissues after oral vaccination

2.4.4 免疫球蛋白IgM 基因表達(dá)

口服疫苗免疫后，IgM 基因在頭腎、脾臟中的表達(dá)，各時(shí)間點(diǎn)均比對(duì)照組顯著性上調(diào)；在頭腎中，在第2 d 是對(duì)照組的18.9 倍；在脾臟中，在第2 d 顯著性上調(diào)15 倍；在肝臟中，除3 d、7 d 和14 d 無(wú)顯著性變化，其他時(shí)間均顯著性上調(diào)（圖7）。

圖7 口服免疫后IgM 基因在各組織在中的表達(dá)量Fig.7 The expression level of IgM genes in tissues after oral vaccination

3 討論

非特異性免疫是魚(yú)抵擋外來(lái)病原菌至關(guān)重要的屏障，其中相關(guān)酶類(lèi)的作用是魚(yú)類(lèi)非特異性免疫的重要組成部分。酸性磷酸酶（ACP）是細(xì)胞免疫和體液免疫的綜合體現(xiàn)，反映機(jī)體對(duì)外源微生物侵染的防御力。解俊等[8]將滅活的諾卡氏菌注射入烏鱧（Channa argus）后，其血清中的酸性磷酸酶活性顯著增加。本實(shí)驗(yàn)中，免疫組與對(duì)照組相比在免疫后第3 d、7 d 顯著升高，表明口服諾卡氏菌滅活疫苗使石斑魚(yú)ACP 活性顯著增強(qiáng)，ACP 活性升高意味著巨噬細(xì)胞被激活，提升了動(dòng)物體內(nèi)的應(yīng)激水平，這與解俊等將滅活的諾卡氏菌對(duì)烏鱧免疫后的結(jié)果一致。

SOD 催化超氧化物自由基成為過(guò)氧化氫，再在CAT 的作用下將過(guò)氧化氫還原為水，是保護(hù)酶系統(tǒng)的重要組成部分。它可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬活性，增強(qiáng)機(jī)體的免疫機(jī)能。CAT 在減少活性氧自由基和維持生物體內(nèi)的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面同樣也起著至關(guān)重要的作用[14,15]。因此，常將兩種酶一起測(cè)定，其含量及活性高低間接反映養(yǎng)殖對(duì)象的健康狀態(tài)及生理狀況。李赫[16]等研究表明，在飼料中添加免疫增強(qiáng)劑，發(fā)現(xiàn)CAT 變化不顯著而SOD 活性顯著高于對(duì)照組。而在本試驗(yàn)中，CAT 活力免疫組與對(duì)照組相比第1 d、2 d、3 d、7 d、21 d 含量顯著性升高，說(shuō)明石斑魚(yú)受免疫后，增強(qiáng)了魚(yú)體的免疫水平，機(jī)體防御病害的能力得到提高，但SOD 活性在相應(yīng)時(shí)期被抑制。這與李赫測(cè)得的血清中兩種酶活性的變化趨勢(shì)相同，分析可能是因?yàn)槟承┘?xì)胞受損會(huì)使胞內(nèi)酶釋放入血，所以血清中的酶活性會(huì)升高。

溶菌酶主要由單核細(xì)胞和粒細(xì)胞產(chǎn)生，不僅能水解革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁中的粘肽，破壞和消除侵入體內(nèi)的異物，還可改善和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的消化功能，增強(qiáng)機(jī)體抵抗力[17]。魚(yú)類(lèi)不同組織中的溶菌酶（LZM）不僅在表達(dá)量上有差異，活性也有差異。LZM 廣泛分布在整個(gè)身體中。大馬哈魚(yú)（Oncorhynchus keta）血清、分泌物、黏膜和富含白細(xì)胞的組織（主要是腎和腸）中均能檢測(cè)到溶菌酶。何晟毓等[18]對(duì)大口黑鱸（Micropterus salmoides）免疫諾卡氏菌滅活疫苗，第7 d 其溶菌酶活力達(dá)到峰值，表明諾卡氏菌滅活疫苗可明顯增強(qiáng)大口黑鱸溶菌酶活力。但在本實(shí)驗(yàn)中免疫組與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，分析原因是肝臟中LZM 的含量少，影響較小。

免疫基因的表達(dá)被作為評(píng)價(jià)疫苗效果的指標(biāo)之一。Toll 樣受體（TLR）是無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中存在的單個(gè)非催化跨膜模式識(shí)別受體PRR[19]。TLR2 可以識(shí)別并對(duì)特定的革蘭氏陽(yáng)性菌均能產(chǎn)生強(qiáng)烈反應(yīng)，現(xiàn)已有大量研究證實(shí)該結(jié)論。將革蘭氏陽(yáng)性枝桿菌（Mycobacterium）感染斑馬魚(yú)（Danio rerio）后，TLR2 的表達(dá)量有顯著的變化[20]；烏鱧感染諾卡氏菌后，脾臟和頭腎中兩個(gè)TLR 受體基因表達(dá)均上調(diào)，且在感染后的96 h、144 h 呈持續(xù)上調(diào)；Byadgi 研究結(jié)果與其相似，諾卡氏菌感染大口黑鱸后TLR2 通路被激活[21]。

MyD88 是最先被發(fā)現(xiàn)的TLR 通路中的下游分子與TLR2 均為T(mén)LR 通路中的關(guān)鍵因子，不斷經(jīng)過(guò)信號(hào)的傳導(dǎo)，最終針對(duì)不同的病原產(chǎn)生不同的免疫應(yīng)答，兩者的表達(dá)量上和變化趨勢(shì)較為相似。本研究中TLR2 在腎臟、脾臟和肝臟中的表達(dá)均有顯著性升高；MyD88 轉(zhuǎn)錄量在各組織中都明顯上升，在腎臟中第14 d 轉(zhuǎn)錄量達(dá)到最高峰，脾臟中最高值出現(xiàn)在第21 d，肝臟中最高值出現(xiàn)在第1 d，表明MyD88 與TLR2 在不同組織及不同免疫時(shí)間表達(dá)不同。

TLR3 在魚(yú)類(lèi)免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)中向T 細(xì)胞提供外源抗原，可以識(shí)別入侵病原體和激活先天免疫[22]。Tan 等[23]研究證明0.2%～1%益生元的三七提取物能夠顯著提高珍珠龍膽石斑魚(yú)肝臟內(nèi)的TGF-β 和TLR3 的表達(dá)量。吳越等研究表明，甘露寡糖可以顯著提高TLR3 以及IL-8 在石斑魚(yú)腸道內(nèi)的表達(dá)；菊粉和甘露寡糖可以顯著提高石斑魚(yú)頭腎中TLR3 的表達(dá)[24]。本研究結(jié)果顯示，TLR3 在頭腎、肝臟、脾臟中表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明該口服疫苗對(duì)免疫基因的上調(diào)中起重要作用，可能增強(qiáng)石斑魚(yú)的先天免疫力。

IL-12p40 可能在引發(fā)免疫應(yīng)答中起到重要作用。張璐等[25]檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，IL-12p40 在腎中的表達(dá)最高，在腦、鰓、心和肝等組織中表達(dá)量較低，表明IL-12p40 在抵御細(xì)菌侵染中起一定作用。本實(shí)驗(yàn)中，第一次口灌后頭腎中的表達(dá)量顯著性上升，為對(duì)照組的9.3 倍，到第一周期免疫結(jié)束后保持一個(gè)較為穩(wěn)定的狀態(tài)，但在脾和肝中表達(dá)量較低。

TNF-α 作為免疫系統(tǒng)中重要的免疫細(xì)胞因子之一，在機(jī)體被感染后，可調(diào)控不同免疫途徑，介導(dǎo)其他細(xì)胞因子的合成及釋放，以及細(xì)胞的凋亡，在魚(yú)類(lèi)的免疫反應(yīng)中承擔(dān)重要作用[26]。Tanekhy 等[27]將諾卡氏菌浸泡感染牙鲆（Paralichthys olivaceus）2 h 后，頭腎和脾臟中TNF-α 基因的表達(dá)量顯著增加，在24 h 后顯著降低。在本實(shí)驗(yàn)中，TNF-α 均能在脾臟中高表達(dá)，在頭腎中表達(dá)量低于其他組織。TNF-α 在第一次口灌免疫后迅速上升，為對(duì)照組的117 倍，這種表達(dá)趨勢(shì)可能與它是前炎性細(xì)胞因子有關(guān)，揭示了它在機(jī)體開(kāi)始發(fā)生炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵作用。TNF-α 表達(dá)量的急速上升對(duì)于魚(yú)體迅速做出反應(yīng)、抵御病原入侵具有重要意義，這些結(jié)果與先前的研究結(jié)果相似，即TNF-α 在早期表達(dá)顯著。

MHC 是一組能夠編碼主要組織相容性系統(tǒng)的基因群，其編碼產(chǎn)物廣泛參與免疫反應(yīng)。在適應(yīng)性免疫中，MHC 處于中心位置[28]，能結(jié)合抗原并呈遞給T 淋巴細(xì)胞，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。Yu 等研究表明，健康大黃魚(yú)MHC II 基因在腎、腸、鰓和脾表達(dá)較強(qiáng)，在肝和肌肉中表達(dá)量最弱，注射細(xì)菌疫苗24 h后，腎、腸和脾的相對(duì)表達(dá)量發(fā)生了很大變化[29]。哈維氏弧菌（V.harveyi）滅活疫苗浸泡免疫斜帶石斑魚(yú)（Epinephelus coioides）后，MHCⅡ在鰓、脾、前腎中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組[30]；牙鲆注射愛(ài)德華氏菌疫苗后，脾臟中MHCⅠ、MHCⅡ均上調(diào)表達(dá)但MHCⅡ表達(dá)水平較高[31]。本研究中，免疫刺激后，MHCⅡ在各組織中均上調(diào)，脾中表達(dá)較強(qiáng)，但其原因與機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

IgM 主要由脾臟和淋巴結(jié)中的漿細(xì)胞分泌合成，主要參與先天免疫和體液免疫的調(diào)控。接種疫苗可提升魚(yú)類(lèi)肝臟、脾臟、頭腎、胸腺組織中IgM 高表達(dá)，但表達(dá)強(qiáng)度與組織器官類(lèi)型相關(guān)[32,33]。Nayak等[34]把亞滅活和滅活（抗原形式）的諾卡氏菌（1.2×106CFU/mL）注射進(jìn)銀鯽腹腔內(nèi)，3 d 后銀鯽的脾和頭腎中CD8α（＋）T 細(xì)胞百分比明顯提高，血液中IgM抗體數(shù)量也明顯增加，接種15 d 后銀鯽體內(nèi)抗體水平達(dá)最高，隨后下降，存活率分別為62.5%和75.0%。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，口服疫苗免疫后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比各組織IgM 的表達(dá)水平均提升，頭腎、脾臟、肝臟均在免疫后第2 d 達(dá)到峰值，IgM 表達(dá)量與組織差異相關(guān)。本研究中，口服疫苗使石斑魚(yú)頭腎、脾臟、肝臟組織中TLR2、TLR3、MyD88、TNF-α、IL-12p40、MHCII 和IgM 的表達(dá)部分顯著上調(diào)也存在顯著性下調(diào)，不同組織間表達(dá)量存在差異，說(shuō)明制備的口服疫苗有效地引起了免疫反應(yīng)，且大部分基因參于了免疫應(yīng)答。