宋學(xué)宏，黃芳，梁鳳玲，胡建國，陸彬，蔡春芳

（1.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215123；2.蘇州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測中心，江蘇 蘇州 215104；3.蘇州市陽澄湖大閘蟹行業(yè)協(xié)會(huì)，江蘇 蘇州 215137）

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis，以下簡稱河蟹）是我國重要的淡水養(yǎng)殖對(duì)象，2020 年全國產(chǎn)量達(dá)77.6 萬t。江蘇是河蟹的主產(chǎn)區(qū)，養(yǎng)殖產(chǎn)量（35.9 萬t）接近全國產(chǎn)量的一半，形成了包括陽澄湖大閘蟹在內(nèi)的多個(gè)知名品牌地理標(biāo)志產(chǎn)品。河蟹以其特有的鮮甜滋味著稱，不同產(chǎn)地的河蟹滋味各有特色[1]。為了保護(hù)生產(chǎn)者、經(jīng)營者和消費(fèi)者的利益，許多品牌的河蟹都配有防偽標(biāo)識(shí)，像陽澄湖大閘蟹還用不同顏色的防偽標(biāo)識(shí)來區(qū)分養(yǎng)殖水體是陽澄湖湖區(qū)（藍(lán)色）還是周邊池塘（綠色）。盡管如此，市售河蟹魚目混珠現(xiàn)象仍較突出，大閘蟹被戲稱“大雜蟹”。開發(fā)河蟹產(chǎn)地及養(yǎng)殖水體識(shí)別技術(shù)對(duì)河蟹產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展意義重大。

水生動(dòng)物具有富集礦物元素的特點(diǎn)[2,3]，不同水體中礦物元素的種類和含量差異明顯，這會(huì)影響到水生動(dòng)物體內(nèi)礦物元素指紋[4]。研究表明：用礦物元素指紋識(shí)別水生動(dòng)物產(chǎn)地具有較高的準(zhǔn)確率[5-8]。趙鑒等[9]、張政權(quán)等[10]報(bào)道元素指紋也可用于河蟹產(chǎn)地識(shí)別。但元素指紋可否用于同一地區(qū)不同養(yǎng)殖水體的河蟹的識(shí)別還鮮有研究。

水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)的礦物元素不僅可從養(yǎng)殖環(huán)境中富集，還來自人工飼料或餌料。在河蟹飼料中常添加充足的Ca、Mg、K、Na、Fe、Mn、Zn、Cu 等礦物元素[11,12]。此外，河蟹生產(chǎn)管理中還常投入硫酸銅、硫酸鋅等控制青苔與纖毛蟲的生長[13,14]，這可能干擾以礦物元素指紋為依據(jù)的產(chǎn)地識(shí)別，而以往基于元素指紋的河蟹產(chǎn)地判別技術(shù)研究中，都納入了上述部分元素[8-10]。剔除這些礦物元素對(duì)判別準(zhǔn)確率的影響尚不清楚。

本研究通過比較江蘇境內(nèi)不同產(chǎn)區(qū)及養(yǎng)殖水體的河蟹體內(nèi)礦物元素含量的差異，驗(yàn)證礦物元素指紋用于河蟹養(yǎng)殖產(chǎn)地和養(yǎng)殖水體識(shí)別的可行性，分析剔除了養(yǎng)殖中外源輸入量較大的礦物元素后對(duì)判別準(zhǔn)確率的影響，為河蟹產(chǎn)地和養(yǎng)殖水體識(shí)別技術(shù)開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及處理

2021 年10 月中旬,采集陽澄湖湖區(qū)（YCL）、陽澄湖周邊池塘（YCP）以及洪澤湖（HZL）、高郵湖（GYL）、固城湖（GCL）湖區(qū)出產(chǎn)的河蟹。根據(jù)湖泊的大小及陽澄湖流域池塘分布情況確定采樣位點(diǎn)數(shù)（表1）。鑒于河蟹對(duì)礦物元素的富集與性別不相關(guān)[15]且成蟹中雄蟹占比高，本研究僅以雄蟹為實(shí)驗(yàn)材料。從每個(gè)位點(diǎn)采集10 只附肢齊全、體質(zhì)健壯的雄蟹樣品，平均體質(zhì)量如表1 所示。將采自同一位點(diǎn)的河蟹處死后合并粉碎，速凍，保存于-20 ℃冰箱備用。

表1 實(shí)驗(yàn)用中華絨螯蟹樣品信息Tab.1 Sample information of Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis for experiment

1.2 礦物元素分析

從冰箱中取出樣品，冷凍干燥，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法（GB 5009.268）測定礦物元素。測定中，稱取樣品0.5 g（精確至0.001 g）于微波消解罐中，加入6 mL 硝酸（北京化學(xué)試劑研究所），先在石墨趕酸器（BHW-09C，海博通化學(xué)科技有限公司）上120 ℃預(yù)消解30 min，再采用微波消解儀（Mars6，美國CEM公司）進(jìn)行消解。消解程序分3 步，每步升溫時(shí)間均為5 min，控制溫度分別為120 ℃、180 ℃、190 ℃，保溫時(shí)間分別為6 min、10 min、15 min。冷卻后取出，緩慢開蓋排氣，適當(dāng)趕酸后，用超純水定容至10 mL，混勻，上機(jī)測定。所用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）為美國Thermo Fisher 公司產(chǎn)品（iCAPQ），儀器工作條件為：采用動(dòng)能歧視消除模式（KED），射頻功率1 550 W，冷卻氣流速14 L/min，輔助氣流速0.8 L/min，霧化氣流速1.0 L/min，Q Cell 氣體（He）4.5 mL/min，駐留時(shí)間0.02 s，掃描次數(shù)100次，進(jìn)樣時(shí)間45 s，蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速45 r/min。點(diǎn)燃等離子體后，儀器預(yù)熱30 min 至穩(wěn)定，引入多元素混合調(diào)諧溶液調(diào)節(jié)ICP-MS 的各項(xiàng)參數(shù)，選擇低中高質(zhì)量數(shù)元素調(diào)諧ICP-MS 的靈敏度，同時(shí)調(diào)節(jié)氧化物以及雙電荷等指標(biāo)至滿足測定要求。通過三通在線引入內(nèi)標(biāo)溶液，依次測定標(biāo)準(zhǔn)曲線、空白溶液和樣品溶液。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量法定量，使用扇貝生物成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為全程質(zhì)控樣（檢測結(jié)果均在允許誤差范圍內(nèi)）。測定的元素有Ca、Mg、K、Na、Sr、Fe、Ba、Al、Ti、Mn、Zn、Cu、As、Cr、Ni、Se、V、Pb、Ce、Y、La、Co、Nd、Eu、Hg、Sb、Dy、Pr、Gd、Cd、Sm、Er、Yb、Lu 和Tm 共35 種，所用標(biāo)樣均購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心。

1.3 數(shù)據(jù)處理

5 組河蟹體內(nèi)礦物元素含量采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所用統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS19.0。采用單因子方差分析法對(duì)5 組河蟹體內(nèi)礦物元素含量進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，差異顯著時(shí)（P＜0.05）進(jìn)行鄧肯氏多重比較。采用Fisher 判別分析法進(jìn)行產(chǎn)地和養(yǎng)殖水體識(shí)別，其中自變量采用Wilks’lambda 步進(jìn)法引入。先以全部35 種所測礦物元素作為自變量進(jìn)行判別分析，在自變量集內(nèi)剔除Ca、Mg、K、Na、Fe、Mn、Zn和Cu 共8 種人為輸入較大的礦物元素[11-14]同法運(yùn)算，比較兩者判別準(zhǔn)確率的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來源河蟹體內(nèi)礦物元素含量均值比較

由表2 可見，除了Al、Cr 和V 外，其他32 種礦物元素組間都存在顯著差異（P＜0.05）。其中，YCL 蟹的Ni 和Sb 顯著高于其他3 個(gè)湖產(chǎn)的河蟹（P＜0.05），且YCP 蟹中含量也較高，而Eu 和Lu含量顯著低于其他3 個(gè)湖產(chǎn)的河蟹（P＜0.05），且YCP 蟹中含量也較低。HZL 蟹的Sr 含量顯著高于其他各組（P＜0.05），其次是GYL 蟹。GCL 蟹中Eu、Hg、Dy、Er、Yb、Lu 和Tm 均顯著高于其他各組（P＜0.05，表2）。

表2 5 個(gè)來源的雄性中華絨螯蟹體內(nèi)礦物元素含量(mg·kg-1)Tab.2 Contents of mineral elements in male Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis from 5 origins

2.2 基于礦物元素指紋的河蟹產(chǎn)地和養(yǎng)殖水體判別分析

以35 種礦物元素為自變量進(jìn)行Fisher 判別分析，結(jié)果顯示：Ca、K、Sr、Al、Zn、Cu、As、Y、Co 和Lu這10 種元素進(jìn)入了判別模型。上述元素可以有效區(qū)分不同來源的河蟹，其中HZL 和GYL、YCL 和YCP 出產(chǎn)的河蟹在領(lǐng)域圖上距離較近，其他3 個(gè)來源的河蟹距離較遠(yuǎn)（圖1）。

圖1 基于35 種元素對(duì)5 個(gè)來源中華絨螯蟹進(jìn)行判別分析的領(lǐng)域圖Fig.1 Canonical plot scores from discriminant analysis on Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis from 5 origins based on 35 elements

對(duì)測試集樣本判別準(zhǔn)確率達(dá)98.3%，交叉驗(yàn)證正準(zhǔn)確率98.3%（表3）。其中，對(duì)產(chǎn)自YCL、YCP、GYL 和GCL 的河蟹交叉驗(yàn)證準(zhǔn)確率是100.0%。對(duì)產(chǎn)自HZL 的河蟹判別準(zhǔn)確率為88.9%，有11.1%被判入GYL。

表3 基于35 種元素對(duì)5 個(gè)來源中華絨螯蟹判別分析的準(zhǔn)確率Tab.3 Accuracy of discriminant analysis of Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis from 5 origins based on 35 elements

剔除河蟹養(yǎng)殖過程中人為輸入量較高的Ca、Mg、K、Na、Fe、Mn、Zn 和Cu 8 種元素后，用余下的27 種元素再行判別分析，Sr、As、Pb、Y、Sb 和Lu 這6種元素進(jìn)入判別分析模型，可區(qū)分不同來源的河蟹，且仍表現(xiàn)為HZL 和GYL、YCL 和YCP 出產(chǎn)的河蟹在圖上距離較近（圖2）。由表4 可見，對(duì)測試集樣本判別準(zhǔn)確率為100.0%，交叉驗(yàn)證總體準(zhǔn)確率為96.7%。從誤判情況看，產(chǎn)自HZL 的河蟹有11.1%被判入GYL，產(chǎn)自GCL 的河蟹有11.1%被判入GYL。

圖2 基于27 種元素對(duì)5 個(gè)來源中華絨螯蟹判別分析的領(lǐng)域圖Fig.2 Canonical plot scores from discriminant analysis on Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis from 5 origins based on 27 elements

表4 基于27 種元素對(duì)5 個(gè)來源中華絨螯蟹判別分析的準(zhǔn)確率Tab.4 Accuracy of discriminant analysis of Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis from 5 origins based on 27 elements

3 討論

3.1 不同來源的河蟹體內(nèi)礦物元素含量

不同水域環(huán)境影響?zhàn)B殖河蟹的礦物元素沉積。趙鑒等[9]以河蟹第三步足為材料比較了遼寧省盤錦、江蘇省洪澤湖、江蘇省興化、湖北省梁子湖產(chǎn)的河蟹體內(nèi)Na、Mg、Al、K、Ca、Mn、Fe、Cu、Zn、Sr、Ba 和Ti 共12 種元素含量，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地河蟹間Na、Mg、Al、K、Mn、Fe、Cu、Sr、Ba 和Ti 含量差異達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。張政權(quán)等[10]分析了崇明、陽澄湖和興化3 個(gè)地區(qū)河蟹肌肉組織中K、Ca、Na、Mg、Mn、Zn、Cu 和Fe 共8 種礦物元素的含量，發(fā)現(xiàn)所有元素均差異顯著（P＜0.05）。本研究檢測了5 個(gè)來源雄性河蟹全蟹樣本的35 種元素，結(jié)果表明，32 種元素差異達(dá)顯著水平（P＜0.05），與上述報(bào)道一致，表明不同產(chǎn)地河蟹體內(nèi)礦物元素差異較大，可能與養(yǎng)殖水體內(nèi)礦物元素差異有關(guān)[4]。

然而，本研究結(jié)果表明，同為陽澄湖地區(qū)，YCL出產(chǎn)的河蟹與YCP 出產(chǎn)的河蟹在24 種礦物元素上差異顯著（P＜0.05，表2），提示這些元素受生產(chǎn)方式的影響較大。究其原因，可能與蟹塘的水草有關(guān)：河蟹養(yǎng)殖水體均栽種大量水草，水草對(duì)底泥和水體中礦物元素的吸附能力較強(qiáng)[16,17]。在湖泊內(nèi)，水在不斷流動(dòng)，會(huì)使被水草吸收的礦物元素得到補(bǔ)充。而在池塘中，整個(gè)養(yǎng)殖周期中通常只是少量注水以補(bǔ)償蒸發(fā)，因此水體中部分礦物元素濃度會(huì)因水草吸附而下降，這會(huì)影響到河蟹對(duì)水體中礦物元素的直接富集。同時(shí)，在池塘半封閉環(huán)境中，水草光合作用導(dǎo)致水體pH 較高[18]，而高pH 環(huán)境影響底泥礦物元素釋放[19]以及水生植物對(duì)礦物元素的吸附[20]，這也會(huì)影響到河蟹對(duì)環(huán)境中礦物元素的富集。河蟹還會(huì)采食部分水草，水草對(duì)水體和底泥中的礦物元素富集效率越高，這些元素向河蟹體內(nèi)轉(zhuǎn)移效率也會(huì)越高。而池塘和湖泊水深差異較大，水草生長速度不同，影響草體中礦物元素的濃度。所有這些因素可能導(dǎo)致了YCL 和YCP 出產(chǎn)的河蟹體內(nèi)礦物元素含量差異較大（表2）。因此，使得用元素指紋來識(shí)別同一地區(qū)池塘和湖泊出產(chǎn)的河蟹成為可能。

在陽澄湖地區(qū)的河蟹中Ni 和Sb 含量較高，而Eu 和Lu 含量較低。HZL 蟹中Sr 含量較高，與HZL地理距離較近的GYL 蟹中含量其次。這是否具有普遍意義還有待確認(rèn)，或可成為河蟹產(chǎn)地鑒別的輔助證據(jù)。同理，GCL 蟹中Eu、Hg、Dy、Er、Yb、Lu 和Tm 均顯著高于其他各組（P＜0.05，表2），也值得關(guān)注。

3.2 采用礦物元素指紋識(shí)別河蟹產(chǎn)地和養(yǎng)殖水體的可行性

礦物元素指紋已被應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物的溯源研究。郭利攀等[5]報(bào)道基于礦物元素指紋信息的產(chǎn)地判別技術(shù)可應(yīng)用于近海3 個(gè)產(chǎn)地的4 種經(jīng)濟(jì)魚類的產(chǎn)地判別。王紫曄等[6]發(fā)現(xiàn)，礦物元素可作為大西洋鮭（Salmo salar）的特征元素來表征其地理來源，而且基于礦物元素所建立的判別模型對(duì)大西洋鮭的整體及交叉驗(yàn)證判別準(zhǔn)確率均高達(dá)98.8%。楊健等[7]報(bào)道，用體內(nèi)元素的積累特征進(jìn)行大銀魚（Protosalanx hyalocranius）產(chǎn)地判別具有較高的準(zhǔn)確性。趙鑒等[9]報(bào)告基于礦物元素對(duì)盤錦、洪澤湖、興化和梁子湖河蟹的判別準(zhǔn)確率達(dá)100%。本研究結(jié)果表明，無論是否剔除養(yǎng)殖過程中人為輸入量較大的元素，識(shí)別準(zhǔn)確率均較高，與上述報(bào)道一致，表明元素指紋可用于河蟹產(chǎn)地識(shí)別。

由圖1 和圖2 可見，在判別分析領(lǐng)域圖上YCL出產(chǎn)的河蟹和YCP 出產(chǎn)的河蟹距離最近，地理位置上較近的GYL和HZL出產(chǎn)的河蟹在領(lǐng)域圖上分布也相對(duì)較近，這從側(cè)面證明了元素指紋具有地域特點(diǎn)[21,22]，即河蟹體內(nèi)元素指紋蘊(yùn)含了產(chǎn)地信息。但這也決定了地理尺度較小時(shí)，判別準(zhǔn)確率就會(huì)下降[8,23,24]。本研究中的河蟹均來自江蘇境內(nèi)，地理尺度較小，但兩個(gè)模型中交叉驗(yàn)證判別準(zhǔn)確率分別達(dá)98.3%和96.7%。YCP 蟹采自距離YCL 3 km 內(nèi)的池塘，盡管這樣，本研究2 個(gè)模型中YCP 和YCL 出產(chǎn)的河蟹判別準(zhǔn)確率均達(dá)100%（表3，表4），表明元素指紋不僅可用于小尺度領(lǐng)域內(nèi)河蟹產(chǎn)地的識(shí)別，對(duì)同一地區(qū)池塘和湖泊養(yǎng)殖的河蟹也能有效識(shí)別。

3.3 剔除養(yǎng)殖過程中人為輸入量大的元素對(duì)河蟹來源識(shí)別的影響

河蟹飼料中常添加大量的Ca、Mg、K、Na、Fe、Mn、Zn 和Cu 等元素[11,12]，蟹塘水草管理和病害防控過程中還會(huì)輸入銅和鋅[13,14]，這可能會(huì)影響河蟹體內(nèi)這些元素的含量。本研究結(jié)果表明，用全部35 種元素對(duì)5 個(gè)來源的河蟹進(jìn)行判別時(shí)，11.1%的HZL出產(chǎn)的河蟹被判入了地理距離較近的GYL，其他產(chǎn)地的河蟹判別準(zhǔn)確率均為100%（表3），暗示人為輸入的礦物元素對(duì)判別準(zhǔn)確率影響較小。剔除這8 種元素后的判別分析結(jié)果顯示，除了仍有11.1%的HZL 出產(chǎn)的河蟹被判入GYL 外，還有11.1%的GCL出產(chǎn)的河蟹被判入地理距離較遠(yuǎn)的GYL，導(dǎo)致交叉驗(yàn)證準(zhǔn)確率從98.3%降為96.7%（表4）。其原因可能是河蟹體內(nèi)Ca、K、Cu、Zn 等元素受產(chǎn)地水土中含量的影響更大。判別模型能自動(dòng)剔除不適用的變量，元素越多，變量篩選的余地越大，判別準(zhǔn)確率也會(huì)越高。因此，在以元素指紋作為產(chǎn)地判別依據(jù)時(shí)，應(yīng)盡可能增加檢測元素的種類。

3.4 結(jié)論

可用礦物元素指紋識(shí)別河蟹產(chǎn)地和養(yǎng)殖水體。河蟹養(yǎng)殖過程中人為輸入量較大的元素對(duì)產(chǎn)地和養(yǎng)殖方式識(shí)別準(zhǔn)確率無負(fù)面影響。

致謝：蘇州大學(xué)食品質(zhì)量與安全專業(yè)2018 級(jí)汪旻卿、張禧騰、許戊江、張思宇等同學(xué)參與了部分研究工作，在此表示感謝！