毛遠舟，郭巧姍，黃建鳴，鄒江，陳一丁，張可賢，舒進軍

610041 成都，四川省腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，四川省腫瘤醫(yī)院·研究所，四川省癌癥防治中心，電子科技大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 麻醉科（毛遠舟、鄒江、陳一丁、張可賢、舒進軍） ，實驗研究部（郭巧姍、黃建鳴）；610041 成都，四川省骨科醫(yī)院 麻醉科（毛遠舟）

宮頸癌是全世界范圍內(nèi)最常見的女性惡性腫瘤之一，也是女性癌癥死亡的第4大原因［1］。針對宮頸癌的治療，《宮頸癌診療指南》（2022 年版）［2］推薦，IA1 和IA2 期患者行手術(shù)治療，IB1、IB2、IIA1 和IB3 期患者行手術(shù)治療或者放療，IIA2 及以上階段的患者行同步放化治療。由此可見，放化療是宮頸癌治療的重要手段。然而，輻射抗性是放療有效性的關(guān)鍵影響因素?？朔椛淇剐?，對于提高宮頸癌治療效果意義重大。缺氧作為絕大多數(shù)實體腫瘤中廣泛存在的一種特質(zhì)，與腫瘤的增殖、分化、血管生成、能量代謝以及癌癥的耐藥性發(fā)生、患者預(yù)后較差等均密切相關(guān)［3-5］。缺氧也在多種腫瘤中被證實是放療失敗的常見原因，包括宮頸癌［6］。丙泊酚是臨床上常用的靜脈麻醉藥物，由于具有見效快、副作用少、鎮(zhèn)靜時間短等特點，被廣泛用于各種手術(shù)中。除其麻醉作用外，丙泊酚的腫瘤抑制作用已在包括宮頸癌在內(nèi)的多種腫瘤中得到深入探索［7-8］。據(jù)報道，丙泊酚聯(lián)合氯胺酮使用，可有效減輕宮頸癌患者接受高劑量率腔內(nèi)照射期間的疼痛和痛苦［9］。而且，丙泊酚促進了紫杉醇對宮頸癌細胞的化療敏感性［7］，提示丙泊酚能改善宮頸癌的藥物抗性。氯化鈷（CoCl2）處理是最常用的缺氧化學(xué)誘導(dǎo)模型，其可模擬HIF-1α 的生成［10］。本研究擬通過CoCl2誘導(dǎo)處理Hela 細胞，構(gòu)建宮頸癌細胞缺氧化學(xué)模型，旨在探討丙泊酚對氯化鈷環(huán)境下宮頸癌細胞增殖、G2/M 期阻滯和輻射抗性的作用及潛在的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人源Hela 細胞株為本實驗室保存；RPMI 1640培養(yǎng)基、熱滅活胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素購自武漢普諾賽生物有限公司；丙泊酚和CoCl2購自Sigma-Aldrich公司；結(jié)晶紫購自廣東科隆生物有限公司；甲醇購自Biosharp 公司；十二烷基硫酸鈉購自生工生物有限公司；RNaseA 和藻紅蛋白購自凱基生物有限公司；TRIzol 試劑購自無錫百泰克生物技術(shù)有限公司；Eastep RT Master Mix 試劑盒和Eastep qPCR Master Mix 試劑盒購自上海Promega；RIPA 裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑購自MCE 公司；7.5%凝膠和5%脫脂牛奶中封閉液購自Epi Zyme 公司；聚偏氟乙烯膜購自Immobilon-PSQ 公司；一抗（HIF-1α 和Tublin）購自CST 公司；二抗購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司；人VEGF Valukine ELISA 試劑盒購自R&D Systems。

1.2 細胞培養(yǎng)

人源Hela 細胞復(fù)蘇后，接種于含有10%熱滅活胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的 RPMI 1 640 培養(yǎng)基中，在37℃，5% CO2進行培養(yǎng)，每兩天換一次液。

1.3 細胞活力測定

將對數(shù)生長期的Hela 細胞接種于兩個96 孔板，每板中分別加入濃度為0 μM、200 μM、400 μM、600 μM、800 μM、1 000 μM 的丙泊酚。孵育72 h后，一個96 孔板置于常氧下，另一塊板置于300 μM CoCl2下24 h。CoCl2的作用濃度和時間參考已發(fā)表文獻［11-12］和本研究的預(yù)實驗所確定。然后用1%結(jié)晶紫染色，并在10%乙醇中固定細胞5 min。剩余的結(jié)晶紫溶液用無菌水洗掉，待96 孔板干燥后，加入1%十二烷基硫酸鈉裂解細胞，用酶標儀在A570 nm 處測定吸光度。細胞活力計算公式為：細胞活力（%）= ［光密度值（optical density，OD）實驗組-OD 空白組］/（OD 對照組- OD 空白組）×100%。

1.4 流式分析

實驗分為對照組、丙泊酚組、CoCl2組、CoCl2+丙泊酚組。CoCl2+丙泊酚組中的細胞先300 μM CoCl2處理24 h，然后再經(jīng)250 μM 丙泊酚處理至72 h；CoCl2組中的細胞先300 μM CoCl 處理24 h，然后再經(jīng)磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）處理至72 h；丙泊酚組中的細胞先PBS 處理24 h，然后再經(jīng)250 μM 丙泊酚處理至72 h；對照組中的細胞先PBS 處理24 h，然后再經(jīng)PBS 處理至72 h。各組細胞處理后，收集細胞，用預(yù)冷PBS 洗滌兩次，并在預(yù)冷的80%乙醇中固定，4℃過夜。之后，細胞在PBS 中重懸，用RNaseA 孵育去除RNA 后，20 mg /mL 藻紅蛋白染色標記DNA 含量。然后用BD Facs-Canto Ⅱ流式細胞儀分析DNA 含量來確定細胞周期分布，測定Hela 細胞在G0/G1、S 和G2/M 期的比例。

1.5 克隆形成實驗

實驗分組及細胞處理同1.4。將對數(shù)生長期的Hela 細胞接種于6 孔板，每孔接種細胞數(shù)為：0 Gy 組200 個、1 Gy 組600 個、2 Gy 組1 200 個、4 Gy組2 400 個。細胞經(jīng)250 μM 丙泊酚、300 μM CoCl2處理48 h 后，暴露于0、1、2 或4 Gy 劑量的輻射中，2 小時后更換培養(yǎng)基。室溫下使用X-RAD320 機器進行放射處理，劑量率為0.02 Gy/min，源-表面距離（source-to-surface distance，SSD）為50 cm。生長10 天后，用10% （v/v）甲醇固定菌落15 min，5%（g/v）結(jié)晶紫染色20 min。計數(shù)超過50 個細胞的菌落，菌落接種率以接種細胞中有活菌的百分率計算。對于每個輻射劑量組，細胞存活率計算為輻照細胞的接種率除以對照組的接種率。接種率計算為（菌落形成數(shù)/接種細胞數(shù)）× 100%。存活率計算為菌落數(shù)/（接種細胞數(shù)×接種效率）。將生存分數(shù)的對數(shù)與輻射劑量作圖，生成生存曲線。D0、Dq 和SF2 的取值采用單擊多靶模型。D0 為平均致死劑量，理論上是使每個細胞平均被擊中一次所需要的輻射劑量；Dq（dose quasithreshold）為準閾劑量，表征修復(fù)亞致死損傷的能力，即克服單擊多靶曲線中“肩寬”所需的劑量；SF2（survival fraction at 2 Gy）為2Gy 時存活分數(shù)，是代表細胞放射敏感性的重要指標，SF2 越大，放射抗拒性越強。

1.6 熒光定量PCR

細胞經(jīng)250 μM 丙泊酚和300 μM CoCl2處理1 h、2 h 和4 h 后收集細胞。TRIzol 提取總RNA 后，使用Eastep RT Master Mix 試劑盒合成cDNA，并使用Eastep qPCR Master Mix 試劑盒進行qPCR。采用2-ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù)，GAPDH作為內(nèi)參基因。引物由擎科生物科技公司合成，引物列表見表1。

表1 引物序列列表Table 1.Sequences of Primers Used in the Present Study

1.7 免疫印跡實驗

細胞經(jīng)250 μM 丙泊酚、300 μM CoCl2處理48 h后，收集所有細胞。使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液提取蛋白。20 μg 蛋白樣品使用7.5%凝膠，在120 V 下分離90 min，并在140 mA 下轉(zhuǎn)移1 h 到聚偏氟乙烯膜，然后在5%脫脂牛奶中封閉1 h 后， 4℃一抗孵育過夜。沖洗3 次后，將膜與二抗在室溫下孵育2 h。用Ge 發(fā)光圖像分析儀- imagequant LAS 500 對蛋白條帶進行可視化成像。

1.8 酶聯(lián)免疫吸附實驗

細胞經(jīng)250 μM 丙泊酚和300 μM CoCl2處理48 h 后，收集所有細胞。使用人VEGF Valukine ELISA試劑盒定量培養(yǎng)基中分泌蛋白VEGF的水平。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用統(tǒng)計軟件 SPSS 22.0 處理數(shù)據(jù)，以均數(shù)±標準差表示計量資料。單因素方差分析用于多組間比較。P＜ 0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 丙泊酚抑制CoCl2 處理后的Hela 細胞增殖

在常氧和CoCl2處理條件下丙泊酚均能抑制Hela 細胞增殖，且呈劑量依賴性。分析發(fā)現(xiàn)兩種處理條件下丙泊酚的IC50（P= 0.066）和IC20（P= 0.990）差異無統(tǒng)計學(xué)意義，CoCl2處理條件下丙泊酚的IC50和IC20分別是450 μM 和250 μM（圖1）。

圖1 丙泊酚抑制Hela 細胞增殖Figure 1.Propofol-Inhibited Proliferation of Hela Cells

2.2 丙泊酚誘導(dǎo)CoCl2 處理后的Hela 細胞G2/M期阻滯

與對照組相比（圖2 A，E 和F，表 2），CoCl2組（圖2B，E 和F，表 2）中G0 /G1/S 期的細胞比例顯著增加（P＜ 0.001），但G2/M 期的細胞比例顯著減少（P＜ 0.001）。丙泊酚組（圖2C，E 和F，表 2）與對照組相比，G0 / G1 / S 期的細胞比例減少（P= 0.162），G2/M 期的細胞比例增加（P= 0.058），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 CoCl2+丙泊酚組（圖2D，E 和F，表2）中G0 / G1 / S 期的細胞比例顯著低于CoCl2組（P＜ 0.001），而G2/M 期的細胞比例顯著高于CoCl2組（P＜ 0.001）。這些結(jié)果表明，丙泊酚誘導(dǎo)CoCl2處理后的Hela 細胞G2/M 期阻滯。

圖2 丙泊酚誘導(dǎo)CoCl2 處理后的Hela 細胞G2/M 期阻滯Figure 2.Propofol-Induced G2/M Phase Arrest in CoCl2-Treated Hela Cells

表2 丙泊酚誘導(dǎo)CoCl2 處理后的Hela 細胞周期分布百分比（%）Table 2.Cell Cycle Distribution of CoCl2-Treated Hela Cells after Propofol Induction （%）

2.3 丙泊酚增強CoCl2 處理后的Hela 細胞的放射致敏性

與對照組相比，丙泊酚組細胞在0、1、2、4 Gy 劑量的輻射處理后，D0（P= 0.007）、Dq（P= 0.004）和SF2 的值均降低（圖3），表明丙泊酚具有放射致敏作用。計算得到丙泊酚的放射增敏比（sensitization enhancement ratio，SER）D0 為2.230（表3）。CoCl2組的細胞在0、1、2、4 Gy 劑量輻射后，Dq（P＜ 0.001）和SF2 值均高于對照組（圖3），表明CoCl2處理增強了Hela 細胞輻射抗性。CoCl2+丙泊酚組細胞在0、1、2、4 Gy 劑量輻射后，其D0（P＜ 0.001）、Dq（P＜ 0.001）和SF2 值均低于CoCl2組（圖3），表明丙泊酚改善了CoCl2誘導(dǎo)的輻射抗性（表3）。計算得到丙泊酚+CoCl2的SERD0 為2.595（表3）。

圖3 丙泊酚增強CoCl2 處理后的Hela 細胞的放射致敏性Figure 3.Radiosensitization Enhanced by Propofol in CoCl2-Treated Hela Cells

表3 丙泊酚對CoCl2 處理后的Hela 細胞放射生物學(xué)參數(shù)的影響Table 3.Influence of Propofol on Radiobiological Parameters of CoCl2-Treated Hela Cells

2.4 丙泊酚下調(diào)CoCl2 處理后的Hela 細胞中HIF-1α 和VEGF 基因表達水平

處理2 h 和4 h 后，CoCl2組的HIF-1αmRNA 表達水平顯著高于對照組（P＜ 0.001，圖4A）。處理4 h 后，與CoCl2組相比，CoCl2+丙泊酚組的HIF-1αmRNA 表達水平顯著降低（P＜ 0.001，圖4A）。處理1 h、2 h 和4 h 后，CoCl2組的VEGFmRNA 表達水平顯著高于對照組（P＜ 0.001，圖4B）。在處理1 h（P= 0.003）和2 h（P= 0.034）后，丙泊酚組的VEGFmRNA 均顯著高于對照組（圖4B），表明丙泊酚促進了Hela 細胞中VEGF基因表達。在處理1 h（P= 0.630）、2 h（P= 0.060）和4 h（P= 0.058）后，CoCl2+丙泊酚組VEGFmRNA 表達量低于CoCl2組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖4B）。

圖4 丙泊酚下調(diào)CoCl2 處理后的Hela 細胞中HIF-1 α 和VEGF 基因表達水平Figure 4.Propofol Down-regulated the Relative mRNA Expression Level of HIF-1 α and VEGF in CoCl2-Treated Hela Cells

2.5 丙泊酚下調(diào)CoCl2 處理后的Hela 細胞中HIF-1α 和VEGF 蛋白表達水平

在對照組和丙泊酚組中，均未在Hela 細胞中檢測到HIF-1α 的明顯表達（圖5）。Hela 細胞在CoCl2處理48 h 后，HIF1α 的相對蛋白表達水平顯著增加（P＜ 0.001，圖5），而丙泊酚處理后，此增加顯著衰減（P＜ 0.001，圖5）。此外，ELISA 結(jié)果顯示，與對照組相比，VEGF 蛋白分泌水平在CoCl2和丙泊酚單獨處理48 h 后均顯著升高（P＜ 0.001，圖6）。與CoCl2組相比，CoCl2+丙泊酚組的VEGF 蛋白分泌水平顯著降低（P＜ 0.001，圖6）。

圖5 丙泊酚下調(diào)CoCl2 處理后的Hela 細胞中HIF-1α 蛋白表達水平Figure 5. Propofol Down-regulated the Protein Expression Level of HIF-1α in CoCl2-Treated Hela Cells

圖6 丙泊酚下調(diào)CoCl2 處理后的Hela 細胞中VEGF 蛋白表達水平Figure 6.Propofol Down-regulated the Protein Expression Level of VEGF in CoCl2-Treated Hela Cells

3 討 論

宮頸癌是常見的女性惡性腫瘤之一，放化療是宮頸癌治療的常規(guī)手段，輻射抗性卻極大地限制了放化療的療效。缺氧作為絕大多數(shù)實體腫瘤中廣泛存在的一種特質(zhì)，不但與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，也會促進腫瘤的輻射抗性，嚴重影響放化療的療效。丙泊酚作為臨床上常用的靜脈麻醉藥物， Jin 等［7］研究報道其促進了紫杉醇對宮頸癌細胞的化療敏感性。本研究首先通過CoCl2誘導(dǎo)在Hela 細胞上構(gòu)建了缺氧模型。CoCl2誘導(dǎo)的化學(xué)模型是最常用的缺氧模擬物。雖然它在Hela 細胞的功能和表型方面與許多缺氧誘導(dǎo)基因不重疊，但它在常氧環(huán)境中穩(wěn)定HIF-1α 數(shù)小時并增加VEGF 表達，使其適用于該項目［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚抑制CoCl2處理后的Hela 細胞的增殖，誘導(dǎo)G2/M 期阻滯，改善輻射抗性，以及下調(diào)HIF-1α 和VEGF 表達水平。

除了麻醉作用外，丙泊酚在腫瘤上的作用得到越來越多的關(guān)注［13］。Jin 等［7］報道，丙泊酚抑制了宮頸癌細胞（HeLa 和 CaSki）的增殖、遷移和侵襲，同時促進了凋亡。Du 等［8］研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚抑制了宮頸癌細胞（Caski 和SiHa）活性、克隆形成和侵襲。本研究結(jié)果顯示，丙泊酚抑制了Hela 細胞的增殖，且呈濃度依賴性。進一步研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚誘導(dǎo)了G0/G1/S 期的細胞比例顯著減少。此外，丙泊酚還濃度依賴性地抑制了CoCl2處理后的Hela 細胞增殖。CoCl2誘導(dǎo)了Hela 細胞G0/G1/S 期細胞比例的顯著增加以及G2 / M 期細胞比例的顯著減少，但丙泊酚處理反轉(zhuǎn)了此結(jié)果。綜上，丙泊酚抑制CoCl2處理后的Hela 細胞增殖，可能是通過誘導(dǎo)G2/M 期阻滯。

缺氧常見于實體瘤，包括宮頸癌。有幾個因素導(dǎo)致腫瘤的缺氧［14］。癌細胞的快速增殖導(dǎo)致對氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的需求增加，超過了供應(yīng)腫瘤的新血管的形成。此外，腫瘤血管的不規(guī)則和異常結(jié)構(gòu)導(dǎo)致氧氣輸送效率低下［15］。而且，癌細胞通常會改變新陳代謝，導(dǎo)致氧氣消耗增加［16］。腫瘤微環(huán)境中的缺氧對癌癥進展和治療耐藥性有重大影響。它影響腫瘤生物學(xué)的各個方面，包括血管生成（新血管的形成）、轉(zhuǎn)移（癌細胞擴散）、免疫抑制以及對化療和放射治療的抵抗力［3-5］。本研究發(fā)現(xiàn)，CoCl2組的細胞在0、1、2、4 Gy 劑量輻射后，Dq 和SF2 值均高于對照組，表明CoCl2處理增強了Hela 細胞輻射抗性。丙泊酚單獨處理，或者和CoCl2聯(lián)合處理，均降低了細胞在0、1、2、4 Gy 劑量輻射后的Dq、SF2 和D0值，表明丙泊酚具有放射致敏作用，且丙泊酚改善了CoCl2誘導(dǎo)的輻射抗性。

HIF-1α 是低氧環(huán)境下促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的主要調(diào)節(jié)因子，它可以促進腫瘤組織處血管生成，促進血紅蛋白生成等，給腫瘤細胞帶來氧氣供給。本研究發(fā)現(xiàn)CoCl2處理后，HIF-1α 的轉(zhuǎn)錄和翻譯表達水平均顯著上調(diào)，表明低氧誘導(dǎo)了HIF-1α 表達上調(diào)。VEGF 是HIF-1α 的主要調(diào)節(jié)因子，已被證明在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的分子發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。抑制VEGF 是癌癥治療的關(guān)鍵治療策略，當腫瘤細胞和周圍基質(zhì)分泌VEGF 時，它可以刺激內(nèi)皮細胞的增殖和存活，從而導(dǎo)致新血管的形成［17］。既往研究報道，高氧降低HIF-1α 和VEGF 水平，導(dǎo)致低氧HeLa 細胞放射敏感性增強［18］?？筕EGF 治療聯(lián)合放療和化療對宮頸癌的治療被證明是有效的［19］。Ishikawa 等［20］通過免疫組化染色分析了38名接受放射治療的FIGO ⅢB 期宮頸鱗狀細胞癌患者的HIF-1α表達水平，發(fā)現(xiàn)HIF-1α 高表達與疾病復(fù)發(fā)呈顯著正相關(guān)，且無復(fù)發(fā)生存率較低，因此，HIF-1α是預(yù)測FIGO ⅢB 期宮頸鱗狀細胞癌患者放療后的未來轉(zhuǎn)移的重要預(yù)后因素。大量體外研究表明，丙泊酚可下調(diào)HIF-1α［21-24］。關(guān)于丙泊酚抑制HIF-1α 表達的機制，有報道稱丙泊酚抑制絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activation protein kinase，MAPK）活性，MAPK 和PI3 激酶活性在決定mRNA對HIF-1α 的翻譯率中起重要作用［24］。然而，丙泊酚在20%或5% O2條件下，通過阻斷HIF-1α亞基的合成，可逆地抑制HIF-1α活性和由HIF-1α介導(dǎo)的基因表達，而丙泊酚在1% O2條件下則沒有此作用［25］。本研究結(jié)果顯示，丙泊酚下調(diào)CoCl2處理后的Hela 細胞中HIF-1α 和VEGF 基因和蛋白表達水平。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚抑制CoCl2處理后的Hela 細胞的增殖，誘導(dǎo)G2/M 期阻滯，改善輻射抗性，以及下調(diào)HIF-1α和VEGF 表達水平。然而，已知HIF 通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)調(diào)節(jié)其降解，CoCl2通過抑制脯氨酰羥化酶（prolyl-4-hydroxylases，PHD）來增加HIF 的蛋白質(zhì)含量。因此，丙泊酚對PHD 活性和蛋白酶體系統(tǒng)的影響應(yīng)進一步得以研究。此外，細胞周期結(jié)果顯示，CoCl2和/或丙泊酚處理后細胞碎片數(shù)量有明顯增多，推測藥物處理可能促進細胞凋亡，因此，后續(xù)應(yīng)通過流式細胞術(shù)對細胞凋亡做進一步分析。本研究為宮頸癌治療提供了一定的理論依據(jù)。

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