陳文善，陳泊霖，盧 群，劉建虎*，何 滔，楊 峰

(1.長(zhǎng)江上游珍稀特有魚(yú)類(lèi)國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)云南管護(hù)局，云南 昭通 657000；2.西南大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，重慶 400715；3.樅陽(yáng)南方材料有限公司，安徽 銅陵 246700)

生物通過(guò)產(chǎn)生糞便、尿液、唾液、皮膚細(xì)胞的方式將DNA排出或脫落到周?chē)h(huán)境中，這類(lèi)大量存在于環(huán)境中的DNA片段總和被稱(chēng)為環(huán)境DNA (Environmental DNA，eDNA)[6]。eDNA技術(shù)是指直接從水體、土壤、沉積物等環(huán)境樣本中提取DNA片段，然后通過(guò)DNA測(cè)序和qPCR等分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)來(lái)定性或定量目標(biāo)生物，從而確定目標(biāo)生物在該環(huán)境中的分布及功能特征的研究方法。該方法應(yīng)用在魚(yú)類(lèi)資源調(diào)查上具有一定的創(chuàng)新性，調(diào)查過(guò)程不依賴(lài)動(dòng)物樣本，不受禁捕的限制，可以大量采樣[7]；eDNA技術(shù)進(jìn)行資源調(diào)查相對(duì)傳統(tǒng)調(diào)查成本較低，對(duì)分類(lèi)學(xué)鑒定專(zhuān)業(yè)知識(shí)要求較低，生態(tài)環(huán)境侵入性低、影響較小[8]；eDNA技術(shù)能檢測(cè)出傳統(tǒng)魚(yú)類(lèi)多樣性調(diào)查手段難以捕獲的物種，但因假陽(yáng)性和DNA污染等情況的存在，其適合作為魚(yú)類(lèi)資源調(diào)查的一個(gè)重要補(bǔ)充手段[9]。利用eDNA進(jìn)行資源調(diào)查不能完全替代傳統(tǒng)的魚(yú)類(lèi)調(diào)查方法，但該技術(shù)具有對(duì)生物體以及生態(tài)環(huán)境無(wú)害、操作簡(jiǎn)單、高靈敏度以及高檢測(cè)率等諸多優(yōu)勢(shì)，隨著數(shù)據(jù)庫(kù)的持續(xù)完善，其適用性會(huì)越來(lái)越強(qiáng)[10]。

本次調(diào)查采用傳統(tǒng)捕撈方式和采集水樣檢測(cè)環(huán)境DNA相結(jié)合的技術(shù)方法，于2020—2021年對(duì)赤水河河源段的魚(yú)類(lèi)資源現(xiàn)狀進(jìn)行調(diào)查，分析其種類(lèi)組成和數(shù)量結(jié)構(gòu)、優(yōu)勢(shì)種、生物多樣性及魚(yú)類(lèi)棲息分布狀況，既彌補(bǔ)了傳統(tǒng)捕撈方法調(diào)查不夠全面的不足，也在一定程度解決了eENA技術(shù)出現(xiàn)假陽(yáng)性的問(wèn)題，旨在為保護(hù)區(qū)魚(yú)類(lèi)生物多樣性保護(hù)提供管理依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在赤水河河源段的保護(hù)區(qū)水域布設(shè)18個(gè)調(diào)查站位(表1)，其中赤水河干流10個(gè)、支流8個(gè)，利用籠壺、拋撒掩網(wǎng)和定置三重刺網(wǎng)3種類(lèi)型漁具對(duì)該區(qū)域的魚(yú)類(lèi)進(jìn)行捕撈。同時(shí)在赤水河河源段主要支流及干流設(shè)置的18個(gè)采樣點(diǎn)中選取7個(gè)點(diǎn)(魚(yú)洞、羅甸、小三峽、天生橋、石坎、河口、苦竹塘)采集eDNA水樣。

表1 赤水河河源段魚(yú)類(lèi)資源調(diào)查站位分布表Tab.1 Characteristics of biodiversity monitoring stations

續(xù)表1

1.2 樣品鑒定與檢測(cè)

對(duì)采集到的漁獲物進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)鑒定，并測(cè)量體長(zhǎng)和體質(zhì)量，對(duì)于疑難物種采用甲醛固定后帶回鑒定。標(biāo)本鑒定和分類(lèi)主要依據(jù)《四川魚(yú)類(lèi)志》[11]、《長(zhǎng)江魚(yú)類(lèi)》[12]、《貴州魚(yú)類(lèi)志》[13]、《中國(guó)內(nèi)陸?hù)~(yú)類(lèi)物種與分布》[14]。

eDNA水樣按照Omega Soil DNA Kit試劑盒提取DNA，同時(shí)利用液氮進(jìn)行保存，再帶回實(shí)驗(yàn)室，并利用MiFish引物擴(kuò)增，通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶檢測(cè)濃度。如滿(mǎn)足條件則運(yùn)用高通量測(cè)序 (High-throughput sequencing，HTS)技術(shù)，同時(shí)對(duì)環(huán)境樣本中存在的多個(gè)物種進(jìn)行識(shí)別[15]。滿(mǎn)足檢測(cè)條件后隨機(jī)檢測(cè)樣本OTU數(shù)并繪制OTU稀疏曲線，若有OTU無(wú)法比對(duì)至種的水平，則向上一級(jí)如屬、科等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)[16]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用相對(duì)重要性指數(shù)(IRI)[17]計(jì)算魚(yú)類(lèi)群落優(yōu)勢(shì)種的成分：

IRI=(N+W)×F

(1)

式(1)中：N為某種魚(yú)類(lèi)尾數(shù)占總尾數(shù)的百分比；W為某種魚(yú)類(lèi)重量占總重量的百分比；F為某種魚(yú)類(lèi)在調(diào)查站位出現(xiàn)的次數(shù)占在總站位中的百分比。將IRI>1 000的種類(lèi)作為優(yōu)勢(shì)種；100

采用Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H′)[18]、Margalef種類(lèi)豐富度指數(shù)(D)[19]和Pielou均勻度指數(shù)(J)[20]研究調(diào)查海域魚(yú)類(lèi)群落的生物多樣性，計(jì)算公式如下：

(2)

D=(S-1)∕lnW

(3)

J=H′/lnS

(4)

式(2)～(4)中：S為調(diào)查所獲魚(yú)類(lèi)種數(shù)；W為該調(diào)查總漁獲重量；Pi為第i種重量占總漁獲重量的比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 種類(lèi)組成

表2 調(diào)查期漁獲物名錄Tab.2 List of catch during monitoring period

續(xù)表2

表3 漁獲物結(jié)構(gòu)Tab.3 Structure of the catch

eDNA技術(shù)分析檢測(cè)出魚(yú)類(lèi)4目8科38屬40種，其中石坎共有魚(yú)類(lèi)3目8科17屬17種；河口共有4目8科20屬21種；苦竹塘共有3目7科17屬17種；小三峽共有4目8科25屬28種；天生橋共有3目7科18屬18種；羅甸共有3目7科30屬34種；魚(yú)洞共有4目8科19屬19種(表4)。

表4 基于eDNA檢測(cè)各站位的魚(yú)類(lèi)序列比對(duì)結(jié)果Tab.4 Sequence alignment results of fish based on eDNA detection at each station

2.2 魚(yú)類(lèi)資源分布特征

本次調(diào)查以2020年為主，因甲方資金問(wèn)題，而順延至來(lái)年，但2021年采樣期間為雨季，因此漁獲物少，導(dǎo)致無(wú)法作多樣性分析。在2020年度調(diào)查期間采集魚(yú)類(lèi)19種，占本次調(diào)查總數(shù)的82.6%，其中銅車(chē)河采集魚(yú)類(lèi)13種，占總數(shù)的56.5%；倒流河采集魚(yú)類(lèi)5種，占總數(shù)的21.7%；石坎河采集魚(yú)類(lèi)3種，占總數(shù)的13.0%。各河段魚(yú)類(lèi)組成存在差異，干流>銅車(chē)河>倒流河>石坎河，干流魚(yú)類(lèi)物種更加豐富。

調(diào)查期間干流各個(gè)站點(diǎn)平均魚(yú)類(lèi)捕獲重量為2 636 g，個(gè)體全長(zhǎng)分布在2.1～37.0 cm之間，大個(gè)體占比較高；銅車(chē)河站點(diǎn)平均魚(yú)類(lèi)漁獲重量為748 g，個(gè)體全長(zhǎng)分布在2.8～22.5 cm之間；倒流河站點(diǎn)平均魚(yú)類(lèi)漁獲重量為242 g，個(gè)體全長(zhǎng)分布在4.6～13.5 cm之間；石坎河上游各個(gè)站點(diǎn)平均魚(yú)類(lèi)漁獲重量為58.5 g，個(gè)體全長(zhǎng)分布在4.0～15.0 cm之間；支流受流量、餌料生物及生態(tài)環(huán)境因素影響，其魚(yú)類(lèi)個(gè)體整體偏小。干、支流在魚(yú)類(lèi)資源量方面存在差異。

2.3 魚(yú)類(lèi)多樣性分析

Shannon-Wiener多樣性指數(shù)基于物種數(shù)量反映群落種類(lèi)多樣性，群落中生物種類(lèi)增多代表了群落的復(fù)雜程度增高，即H′值愈大，群落所含的信息量愈大[18]。2020—2021年度調(diào)查河段漁獲物Shannon-Wiener多樣性指數(shù)為2.99，表明該河段總體魚(yú)類(lèi)資源相對(duì)豐富，群落結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定。Margalef豐富度指數(shù)指一個(gè)群落或環(huán)境中物種數(shù)目的多寡，亦表示生物群聚(或樣品)中種類(lèi)豐富度程度的指數(shù)[19-21]。調(diào)查河段總漁獲物Margalef豐富度指數(shù)(D)為3.31，表明調(diào)查區(qū)域魚(yú)類(lèi)資源種類(lèi)數(shù)相對(duì)豐富，生物多樣性結(jié)構(gòu)相對(duì)完好，魚(yú)類(lèi)組成及種群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。Pielou均勻度指數(shù)(J)是一個(gè)用于反映物種個(gè)體數(shù)目在群落中分配的均勻程的指數(shù)[19-21]，調(diào)查河段總漁獲物均勻度指數(shù)為0.66，種群結(jié)構(gòu)分布較均勻，群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定(表5)。

表5 漁獲物生物多樣性指數(shù)Tab.5 Biodiversity indexes of catches

基于eDNA檢測(cè)各站位的魚(yú)類(lèi)群落多樣性指數(shù)分析結(jié)果如表6所示，從中可知，魚(yú)洞、羅甸和小三峽的魚(yú)類(lèi)多樣性更加豐富，魚(yú)洞位于調(diào)查區(qū)干流上游，羅甸位于調(diào)查區(qū)干流中游，小三峽位于調(diào)查區(qū)干流下游，其他采樣點(diǎn)則是分布于主要支流。調(diào)查區(qū)域干流的魚(yú)類(lèi)資源比支流區(qū)域更豐富，魚(yú)類(lèi)多樣性也更高。

表6 基于eDNA檢測(cè)各站位的魚(yú)類(lèi)群落多樣性指數(shù)Tab.6 Fish community diversity indexes based on eDNA detection at each station

3 討論

本次eDNA調(diào)查，共檢測(cè)出4目8科28屬40種?？紤]到網(wǎng)具、捕魚(yú)技術(shù)、魚(yú)類(lèi)生活習(xí)性和魚(yú)類(lèi)數(shù)量等因素，利用eDNA檢測(cè)的種類(lèi)數(shù)較傳統(tǒng)捕撈方式更加全面。郭寧寧等[24]利用eDNA技術(shù)于2021年9月對(duì)赤水河流域開(kāi)展了魚(yú)類(lèi)多樣性、分布及其特征調(diào)查，設(shè)置了52個(gè)采樣點(diǎn)，其采樣點(diǎn)設(shè)置比本研究eDNA技術(shù)調(diào)查采樣點(diǎn)(7個(gè))多45個(gè)，共調(diào)查到6目18科62屬77種魚(yú)類(lèi)，比本次河源段調(diào)查(40種)多出37種。經(jīng)分析，存在差異可能是郭寧寧等[24]調(diào)查的范圍更大，調(diào)查頻次更加密集，且調(diào)查區(qū)域不同導(dǎo)致的。本次調(diào)查區(qū)域部分支流存在水量較少等情況，幾條支流存在只有雨季才有的現(xiàn)象，這部分支流的魚(yú)類(lèi)多樣性不高，魚(yú)類(lèi)資源不夠豐富，導(dǎo)致調(diào)查出的魚(yú)類(lèi)種類(lèi)數(shù)量較少。本研究eDNA分析結(jié)果顯示，羅甸和小三峽的魚(yú)類(lèi)種類(lèi)最多，分別為34種和28種，其中羅甸采樣點(diǎn)處于妥泥河河口處，小三峽處于干流下流區(qū)域。干流區(qū)域的魚(yú)類(lèi)種類(lèi)更加豐富，與漁獲物種類(lèi)分析結(jié)果一致。

在2020—2021年調(diào)查過(guò)程中，小三峽、魚(yú)洞調(diào)查點(diǎn)基因含量水平較高，物種相對(duì)豐富，而且小三峽段還檢測(cè)到部分洄游性魚(yú)類(lèi)基因片段，證明赤水河下游魚(yú)類(lèi)在繁殖季節(jié)可上溯至此，下一步應(yīng)有針對(duì)性地加強(qiáng)重點(diǎn)物種調(diào)查，加強(qiáng)保護(hù)措施。在上游魚(yú)洞調(diào)查水域檢測(cè)到有銅魚(yú)基因片段信息，可能是放流品種在此區(qū)域活動(dòng)停留導(dǎo)致的。在檢測(cè)過(guò)程中檢測(cè)到四大家魚(yú)、鯉、鯽和鱘魚(yú)，可能是養(yǎng)殖或者食用品種基因片段混雜導(dǎo)致的。考慮到采樣點(diǎn)的分布集中在干、支流區(qū)域，因此分別對(duì)干、支流的資源量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)干、支流在魚(yú)類(lèi)資源量方面存在顯著差異，干流的魚(yú)類(lèi)種類(lèi)數(shù)目比支流更加豐富，同時(shí)在干、支流的同種類(lèi)魚(yú)類(lèi)中，干流的魚(yú)體顯著大于支流，推測(cè)是受流量、餌料生物、生態(tài)環(huán)境因素和保護(hù)力度的影響。在后期魚(yú)類(lèi)多樣性保護(hù)上，應(yīng)加強(qiáng)干流保護(hù)區(qū)核心區(qū)的保護(hù)，逐步加強(qiáng)支流資源量恢復(fù)措施，提升整體資源水平。