趙圓圓 樊雪瑩 成啟明* 陳 超 陳玉連 李茂雅 雷 耀 王佳楚函 何湘江 王志軍 劉鷹昊

(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,貴陽 550025;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院,草地資源教育部重點實驗室,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼草栽培、加工與高效利用重點實驗室,呼和浩特 010021;3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所,呼和浩特 010010)

近年來,隨著畜牧業(yè)的高速發(fā)展,動物飼料的供需關(guān)系逐漸失衡,飼料的供不應(yīng)求狀況是畜牧業(yè)急需解決的問題,開發(fā)和利用非常規(guī)飼料是目前有效解決飼料短缺的途徑之一[1]。我國貴州地區(qū)四季分明,雨季較多,冬季牧草緊缺,青貯調(diào)制可提高牧草利用率和適口性,是解決青綠飼料季節(jié)性不均衡問題的重要方法[2]。

芭蕉(MusabasjooSieb. Et Zucc.)是芭蕉科芭蕉屬植物,是生長于熱帶的多年生草本植物之一,在我國貴州、廣東、廣西、海南、四川、云南和臺灣等地均有分布[3]。芭蕉的果肉、花、葉和根中均含有豐富的糖類、氨基酸、纖維素、礦物質(zhì)、微量元素及多種化合物成分[4],而芭蕉葉作為廢棄物,對其進(jìn)行飼料化利用不僅可以緩解我國部分地區(qū)青綠飼料不足的問題,也能緩解資源浪費(fèi)的問題[5]。芭蕉葉所含粗蛋白質(zhì)(CP)(6.45% DM)和水溶性碳水化合物(WSC)較低,但其中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量較高,分別為53.35% DM和32.13% DM,單獨青貯會導(dǎo)致青貯品質(zhì)不佳,所以需要選取另一種材料來進(jìn)行養(yǎng)分互補(bǔ),從而改善芭蕉葉的青貯品質(zhì)[6]。

酒糟是釀酒過程中高粱、小麥等原料經(jīng)過蒸煮、發(fā)酵和蒸餾出酒后留下的固體廢棄物,具有產(chǎn)量巨大、含水率高、酸度大及易腐爛變質(zhì)的特點,如果處理不當(dāng)會嚴(yán)重污染生態(tài)環(huán)境[7]。由于茅臺酒糟中含有較高的蛋白質(zhì)、粗纖維和豐富的水解氨基酸[8],具有良好的飼用價值,可通過青貯的方式利用茅臺酒糟,緩解飼草緊缺問題,減少環(huán)境污染[9]。原現(xiàn)軍等[10]研究表明,在箭筈豌豆與葦狀羊茅(3∶7)混合青貯中添加10%青稞酒糟即能夠提高混合青貯發(fā)酵品質(zhì)。任海偉等[11]研究表明,在白酒糟與菊芋渣混合比例為1.2∶1和1∶1.5時,能夠有效改善青貯發(fā)酵品質(zhì),提高飼用價值。由此推測,茅臺酒糟與芭蕉葉混合青貯可能能獲得優(yōu)質(zhì)的青貯飼料,而此前關(guān)于茅臺酒糟與芭蕉葉混合青貯的研究還未見報道。

因此,本試驗通過研究茅臺酒糟與芭蕉葉不同混合比例對其青貯品質(zhì)的影響,并通過對其養(yǎng)分含量、發(fā)酵品質(zhì)和微生物群落等指標(biāo)進(jìn)行綜合分析,篩選出茅臺酒糟與芭蕉葉混合青貯的最適比例,旨在為芭蕉葉和茅臺酒糟的飼料化利用提供科學(xué)依據(jù),為緩解我國飼草資源緊缺和生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)青貯產(chǎn)品提供參考,同時為茅臺酒糟的后續(xù)處理提供一個解決方案,緩解茅臺酒糟對環(huán)境的污染問題。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗材料為在貴州省關(guān)嶺縣種植的芭蕉上采集的芭蕉葉,以及從貴州省仁懷市茅臺鎮(zhèn)茅臺集團(tuán)酒廠取回的茅臺酒糟。茅臺酒糟和芭蕉葉養(yǎng)分含量見表1。

表1 茅臺酒糟和芭蕉葉養(yǎng)分含量

1.2 試驗設(shè)計

以鮮重為基礎(chǔ),本試驗共設(shè)置6個茅臺酒糟與芭蕉葉的混合比例,分別為:100%芭蕉葉單獨青貯(BCK組)、20%茅臺酒糟與80%芭蕉葉混合青貯(J20B80組)、40%茅臺酒糟與60%芭蕉葉混合青貯(J40B60組)、60%茅臺酒糟與40%芭蕉葉混合青貯(J60B40組)、80%茅臺酒糟與20%芭蕉葉混合青貯(J80B20組)以及100%茅臺酒糟單獨青貯(JCK組)。青貯60 d后,對各處理青貯飼料的養(yǎng)分含量、發(fā)酵品質(zhì)和微生物群落進(jìn)行測定,每個處理設(shè)置3個重復(fù)。

1.3 青貯調(diào)制

將收獲的新鮮芭蕉葉切成2～3 cm長小段,新鮮茅臺酒糟經(jīng)風(fēng)干晾曬后,按照試驗設(shè)計比例將茅臺酒糟與芭蕉葉充分混勻后,稱取300 g,裝入聚乙烯袋中,用真空機(jī)抽真空密封青貯。青貯袋封口后置于室溫下避光保存60 d。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 養(yǎng)分含量和發(fā)酵品質(zhì)測定

青貯開袋后稱取120 g左右的樣品于65 ℃烘48 h至恒重。將烘干的青貯料打為草粉后,裝于自封袋中保存,用于后續(xù)養(yǎng)分含量的測定;青貯開袋后取10 g樣品,加入90 mL蒸餾水進(jìn)行破壁,用4層紗布過濾后,得青貯提取液,于-20 ℃保存,用于發(fā)酵品質(zhì)的測定。

pH采用精密pH計進(jìn)行測定,氨態(tài)氮(NH3-N)含量采用苯酚-次氯酸鹽比色法[12]進(jìn)行測定,乳酸(lactic acid,LA)、乙酸(acetic acid,AA)、丙酸(propionic acid,PA)和丁酸(butyric acid,BA)含量采用DB15/T 1458—2018方法[13]進(jìn)行測定。CP含量采用凱氏定氮法使用定氮儀KN680進(jìn)行測定[14],WSC含量采用蒽酮-硫酸法[15]進(jìn)行測定,NDF和ADF含量采用濾袋分析法[16]使用自動纖維分析儀(ANKOM A-200i)進(jìn)行測定。

1.4.2 微生物群落分析

青貯結(jié)束后進(jìn)行開袋,每袋取出10 g樣品,放入90 mL無菌蒸餾水中,用低溫振蕩器在4 ℃、180 r/min下?lián)u勻30 min,然后用4層紗布過濾得到濾液,再使用冷凍離心機(jī)在4 ℃、8 000 r/min離心15 min,最終獲得富含微生物的沉積物。使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit試劑盒提取青貯飼料中的微生物總DNA,進(jìn)行16S rDNA基因擴(kuò)增子測序和真菌轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)擴(kuò)增子測序。16S rDNA基因擴(kuò)增子測序采用的引物序列為:338F,5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′;806R,5′-GGACTACHVHHHTWTCTAAT-3′;ITS擴(kuò)增子測序采用的引物序列為:SSU0817F,5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′;1196R,5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′。將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化,采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫。使用MiSeq測序儀進(jìn)行2×300 bp的雙端測序并對結(jié)果進(jìn)行分析[17]。使用QIIME軟件進(jìn)行各分類水平的分類學(xué)組成分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2019對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理,再使用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法多重比較,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同混合比例茅臺酒糟與芭蕉葉對其青貯飼料養(yǎng)分含量的影響

由表2可知,JCK組、J60B40組、J80B20組、J40B60組和J20B80組青貯飼料CP含量均顯著高于BCK組(P<0.05),分別提高了94.60%、88.19%、86.66%、67.92%和40.30%;混合青貯組中,J60B40組CP含量最高,顯著高于J20B80組和J40B60組(P<0.05)。J60B40組、J40B60組、J80B20組和J20B80組青貯飼料WSC含量與BCK組相比均無顯著差異(P>0.05);JCK組WSC含量最高,顯著高于其他組(P<0.05)。JCK組青貯飼料NDF和ADF含量顯著低于其他組(P<0.05);隨著茅臺酒糟添加比例的提高,青貯飼料NDF含量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢;J40B60組ADF含量最高,顯著高于其他組(P<0.05),之后隨著茅臺酒糟添加比例的提高,青貯飼料ADF含量逐漸降低。由表1和表2對比可知,茅臺酒糟和芭蕉葉青貯飼料CP和NDF含量比原料中CP和NDF含量均有所下降。

表2 混合青貯飼料養(yǎng)分含量

2.2 不同混合比例茅臺酒糟與芭蕉葉對其青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響

由表3可知,BCK組青貯飼料pH最高,顯著高于其他組(P<0.05);各混合青貯組pH均顯著高于JCK組(P<0.05)。J60B40組青貯飼料NH3-N含量最低,顯著低于除JCK組外的其他組(P<0.05);J20B80組、J40B60組和J80B20組之間NH3-N含量均無顯著差異(P>0.05)。J60B40組和J80B20組青貯飼料LA含量顯著高于其他組(P<0.05),J20B80組、JCK組和BCK組之間LA含量均無顯著差異(P>0.05);隨著茅臺酒糟添加比例的提高,青貯飼料LA含量呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。有趣的是,在JCK組青貯飼料中未檢測到AA;J40B60組AA含量最高,顯著高于其他組(P<0.05);BCK組、J20B80組、J60B40組和J80B20組之間AA含量均無顯著差異(P>0.05)。J40B60組和J80B20組青貯飼料PA含量較高,顯著高于其他組(P<0.05);J60B40組PA含量顯著高于J20B80組、JCK組和BCK組(P<0.05)。所有組青貯飼料中均未檢測到BA。

表3 混合青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)

2.3 不同混合比例茅臺酒糟與芭蕉葉對其青貯飼料微生物群落的影響

如圖1-A所示,僅JCK組青貯飼料的優(yōu)勢菌門為變形菌門(Proteobacteria),其余各組的優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門(Firmicutes),其次是變形菌門;除此之外,各組還存在少量的擬桿菌門(Bacteroidota)和放線菌門(Actinobacteria);JCK組和J80B20組均存在少量的疣微菌門(Verrucomicrobiota)。

圖1 混合青貯飼料細(xì)菌在門(A)和屬(B)水平上的分布

如圖1-B所示,J60B40組和J80B20組青貯飼料的優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬(Lactobacillus),相對豐度分別為72.76%和50.92%;J40B60組的優(yōu)勢菌屬為腸球菌屬(Enterococcus),其余組的優(yōu)勢菌屬均為其他(others);J40B60組和J20B80組乳桿菌屬的相對豐度低于BCK組和JCK組,而腸球菌屬的相對豐度高于其他組。

如圖2-A所示,僅J40B60組青貯飼料的優(yōu)勢菌門為其他(others),其余各組的優(yōu)勢菌門均為子囊菌門(Ascomycota),且JCK組子囊菌門的相對豐度最高,達(dá)到98.25%。J80B20組、J60B40組、J40B60組、J20B80組和BCK組均含有少量的擔(dān)子菌門(Basidiomycota),相對豐度分別為8.06%、16.86%、3.95%、3.18%和3.34%。

圖2 混合青貯飼料真菌在門(A)和屬(B)水平上的分布

如圖2-B所示,所有組青貯飼料的優(yōu)勢菌屬均為其他(others),其次是畢赤酵母屬(Pichia),相對豐度分別為J80B20組24.29%、J60B40組32.57%、J40B60組13.10%、J20B80組37.61%、BCK組30.48%以及JCK組21.38%;所有組均含有少量的裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)。此外,JCK組含有相對豐度為23.03%的Kazachstania-Candidaclade,J60B40組含有相對豐度為8.72%的Wickerhamomyces-Candidaclade。

3 討 論

3.1 不同混合比例茅臺酒糟與芭蕉葉對其青貯飼料養(yǎng)分含量的影響

本試驗中,新鮮茅臺酒糟的各養(yǎng)分含量均優(yōu)于新鮮芭蕉葉,因此將兩者進(jìn)行混合青貯能夠提高芭蕉葉的青貯品質(zhì)。牧草種類、CP含量和WSC含量等因素都會影響青貯飼料的營養(yǎng)品質(zhì)[18]。本研究結(jié)果顯示,單一茅臺酒糟青貯飼料(JCK組)的CP含量較高(19.11% DM),而單一芭蕉葉發(fā)酵飼料(BCK組)的CP含量較低(9.82% DM),茅臺酒糟與芭蕉葉混合青貯后克服了芭蕉葉在CP含量上的不足,使混合青貯飼料中CP含量高于單一芭蕉青貯,這與陳冬梅等[19]、劉雯雯等[20]的研究結(jié)果一致?；旌锨噘ACP含量增高可能與混合青貯組pH降低和LA含量升高有關(guān),酒糟中殘留的乙醇可促進(jìn)LA發(fā)酵,使pH下降,進(jìn)而抑制蛋白酶活性,從而降低蛋白質(zhì)分解[21]。WSC是青貯發(fā)酵的重要底物,要有足夠的可溶性糖分,乳酸菌才能產(chǎn)生足夠數(shù)量的LA[22]。本研究中,混合青貯組青貯飼料中WSC含量與BCK組沒有顯著性差異,這與韓健寶[23]在添加啤酒糟對稻秸與桔子皮、干蘋果渣和苜?；旌锨噘A研究中的結(jié)果一致。此外,本試驗中單一茅臺酒糟青貯飼料的NDF含量較低,而單一芭蕉葉發(fā)酵飼料的NDF含量較高,通過在芭蕉葉中添加不同比例的茅臺酒糟,混合青貯組的NDF含量隨著茅臺酒糟添加比例的提高而不斷降低,這與賴思蓉等[24]的結(jié)果一致,即添加一定比例的酒糟能使NDF含量顯著降低。由于J60B40組青貯飼料CP含量高,NDF和ADF含量低,所以J60B40組的青貯營養(yǎng)品質(zhì)最好。青貯60 d后,茅臺酒糟和芭蕉葉的CP和NDF含量比原料中的CP和NDF含量均有所下降,其原因是好氧腐敗菌在發(fā)酵初期利用青貯袋中殘留的氧氣大量繁殖,從而消耗了青貯原料的營養(yǎng)物質(zhì)。

3.2 不同混合比例茅臺酒糟與芭蕉葉對其青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響

研究表明,pH是反映青貯飼料優(yōu)劣的一個重要指標(biāo),較低的pH可以確保青貯飼料良好的保存,優(yōu)質(zhì)青貯飼料的pH在3.8～4.2[25]。本研究結(jié)果顯示,4個混合青貯組青貯飼料pH(4.05～4.11)都符合優(yōu)質(zhì)青貯飼料標(biāo)準(zhǔn),且都顯著低于BCK組,而顯著高于JCK組。J40B60組、J60B40組和J80B20組青貯飼料LA含量顯著高于BCK組,由此可見,在芭蕉葉中添加一定比例的茅臺酒糟能夠提高青貯飼料LA含量,這與李茂雅等[26]的研究結(jié)果一致,且其中J60B40組LA含量最高。PA在青貯過程中能夠提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性[27],本試驗中混合青貯組青貯飼料PA含量均顯著高于BCK組,說明茅臺酒糟與芭蕉葉混合青貯可能會提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。研究表明,青貯發(fā)酵前期以同型乳酸菌發(fā)酵為主,后期以異型乳酸菌發(fā)酵為主,由于后期異型乳酸發(fā)酵菌的存在,所以會導(dǎo)致部分LA轉(zhuǎn)化為AA,從而導(dǎo)致AA含量升高[28]。本試驗中,所有組青貯飼料LA/AA值均大于3,說明可能均以同型乳酸菌發(fā)酵為主。NH3-N含量越高,說明蛋白質(zhì)分解越多,意味著青貯過程中養(yǎng)分保存不好[29]。本試驗中,茅臺酒糟與芭蕉葉混合青貯組青貯飼料NH3-N含量均低于BCK組,表明在芭蕉葉中添加茅臺酒糟進(jìn)行混合青貯能夠減少蛋白質(zhì)分解,有效保存青貯中的養(yǎng)分。綜上可知,由于J60B40組青貯飼料的LA含量最高,PA含量較高,AA含量最低,且NH3-N含量最低,所以J60B40組的青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)最好。

3.3 不同混合比例茅臺酒糟與芭蕉葉對其青貯飼料微生物群落的影響

微生物種類和數(shù)量的變化會導(dǎo)致青貯品質(zhì)發(fā)生變化。厚壁菌門中的細(xì)菌可以降解纖維素、淀粉和蛋白質(zhì)等物質(zhì);變形菌門中的細(xì)菌會跟乳酸菌競爭發(fā)酵底物,影響青貯的發(fā)酵品質(zhì)[30]。本研究中,JCK組青貯飼料的優(yōu)勢菌門為變形菌門,其余組的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門,其次是變形菌門,這與黃媛等[31]的研究結(jié)果一致。由此表明,茅臺酒糟與芭蕉混合青貯能夠抑制青貯飼料中的有害菌,促進(jìn)有益菌的生長。從屬水平看,茅臺酒糟或芭蕉單獨青貯組的優(yōu)勢菌屬均為其他,乳桿菌屬和腸球菌屬等有益菌屬相對豐度較低,不適宜青貯[32]。J60B40組和J80B20組的優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬,相對豐度分別為72.76%和50.92%;而J40B60組的優(yōu)勢菌屬為腸球菌屬,因此得出在芭蕉葉中添加40%的茅臺酒糟能夠提高混合青貯飼料中的腸球菌屬相對豐度。從微生物多樣性的角度來看,茅臺酒糟與芭蕉葉混合比例為6∶4時有益微生物相對豐度較高,其青貯品質(zhì)較好。

青貯過程中有氧暴露會產(chǎn)生真菌[33]。目前關(guān)于青貯飼料中的真菌群落研究較少。在本研究中,從門水平真菌群落看,除J40B60組外,其余組青貯飼料的優(yōu)勢菌門均為子囊菌門,這與孫安琪[34]的研究結(jié)果一致。相較于BCK組,混合青貯組青貯飼料的子囊菌門相對豐度均有一定程度的降低。從屬水平真菌群落看,所有組青貯飼料的優(yōu)勢菌屬均為其他,其次是畢赤酵母屬,且均含有少量的裂殖酵母屬。研究表明,畢赤酵母屬在青貯過程中可以利用LA進(jìn)行發(fā)酵[35]。酵母菌和霉菌被認(rèn)為是與青貯有氧變質(zhì)有關(guān)的主要微生物,會導(dǎo)致營養(yǎng)和能量損失[36]。本試驗中,未檢測出超過1%的霉菌,但有較多的酵母菌,其中J40B60組的酵母菌相對豐度較低。

4 結(jié) 論

將茅臺酒糟與芭蕉葉按一定比例混合青貯后能提高其青貯飼料營養(yǎng)品質(zhì)和發(fā)酵品質(zhì),其中二者比例為6∶4時,青貯飼料CP和LA含量較高,pH以及NH3-N和NDF含量較低;混合青貯組青貯飼料中乳桿菌屬等有益菌的相對豐度較高,不明菌群和有害菌的相對豐度較低。結(jié)合養(yǎng)分含量、發(fā)酵品質(zhì)和微生物群落等指標(biāo)綜合分析,茅臺酒糟與芭蕉葉混合比例為6∶4時,其混合青貯發(fā)酵品質(zhì)較好。