張立東 段平平 李昌昌 胡麗紅 陸牡龍 許貴善,2*

(1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,阿拉爾 843300;2.塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,阿拉爾 843300)

優(yōu)質(zhì)飼料原料缺乏及其成本問(wèn)題一直是困擾畜牧業(yè)快速發(fā)展的重要因素[1]。緩解飼料原料供需矛盾,需要加快優(yōu)質(zhì)非常規(guī)飼料資源的開發(fā)和利用。食用菌生產(chǎn)中采集菌菇后剩余的廢棄物培養(yǎng)基,稱為菌糠(SMS),又叫菌棒、菌渣[2]。我國(guó)是食用菌生產(chǎn)大國(guó),據(jù)中國(guó)食用菌協(xié)會(huì)報(bào)道[3],2020年全國(guó)食用菌總產(chǎn)量4 061.43萬(wàn)t,比2019年增長(zhǎng)3.2%,其中平菇(Pleurotusostreatus)作為食用菌家族中的大宗品種,在2020年產(chǎn)量達(dá)到682.96萬(wàn)t。按每生產(chǎn)1 kg的食用菌產(chǎn)生3.25～5.00 kg菌糠計(jì)[4],2020年我國(guó)產(chǎn)生食用菌菌糠總量在13 199.65萬(wàn)～20 307.15萬(wàn)t,其中平菇菌糠(P.SMS)總量在2 219.62萬(wàn)～3 414.80萬(wàn)t。

目前,處理和利用菌糠的方式為焚燒、還田、開發(fā)生物質(zhì)燃料、用作飼料和提取菌糠中的活性成分。但絕大部分菌糠被焚燒或隨意丟棄,造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。菌糠本身含水量高、不易保存、粗纖維含量較高、適口性差,直接制備畜禽飼料效果不好。添加微生物發(fā)酵可以改善菌糠適口性,延長(zhǎng)菌糠儲(chǔ)存時(shí)間,且能提高菌糠的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。劉月等[5]在假絲酵母菌和嗜酸乳桿菌菌液的用量比為6.8∶1.0、水料比為1.0∶1.1、菌液接種量為6.8%條件下發(fā)酵靈芝菌糠,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后的靈芝菌糠感官品質(zhì)有較大改善,酒香味明顯,粗蛋白質(zhì)(CP)含量提高14.51%,粗纖維(CF)含量略有降低。李佳騰等[6]用混菌發(fā)酵杏鮑菇菌糠,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后的杏鮑菇菌糠CP和粗脂肪(EE)含量顯著高于原料,中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量顯著低于原料。飼料原料經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵后飼喂動(dòng)物有較好的效果。Peng等[7]研究證明,微生物發(fā)酵飼料可以通過(guò)減少致病微生物來(lái)調(diào)節(jié)盲腸微生物群,從而改善有益微生物,同時(shí)也影響免疫力及其相關(guān)基因的表達(dá)。Yan等[8]研究發(fā)現(xiàn),7.5%發(fā)酵飼料對(duì)鵝的體重和平均日增重有增加的趨勢(shì),增加擬桿菌屬的豐度,并可能影響宿主生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)狀況和腸道健康。王樂(lè)樂(lè)等[9]研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加12%的發(fā)酵木屑菌糠在一定程度上提高了綿羊免疫功能和抗氧化性能,對(duì)綿羊生長(zhǎng)性能和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率無(wú)負(fù)面影響。因此,菌糠發(fā)酵飼料具有較好的利用價(jià)值和飼喂效果。

微生物發(fā)酵飼料的品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)不僅由飼料原料和菌種決定,還與菌液接種量、物料含水量、發(fā)酵時(shí)間和溫度等條件密切相關(guān)[10]。平菇菌糠飼料的最佳發(fā)酵工藝需分別對(duì)多因素和多指標(biāo)進(jìn)行篩選評(píng)價(jià),針對(duì)多因素的篩選,正交試驗(yàn)、響應(yīng)面法的試驗(yàn)次數(shù)少且結(jié)果更準(zhǔn)確。陳詩(shī)宇等[11]采用單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化黑曲霉和乳酸桿菌二段固態(tài)發(fā)酵大豆皮和菜籽餅工藝條件,分別篩選出了黑曲霉和乳酸桿菌的最優(yōu)發(fā)酵工藝。劉戰(zhàn)霞等[12]通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)對(duì)益生菌發(fā)酵南瓜子進(jìn)行工藝優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)最優(yōu)工藝條件為發(fā)酵時(shí)間5 d、接種量5%、菌種比例1∶1、發(fā)酵溫度36 ℃。飼料價(jià)值評(píng)價(jià)需考慮營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)等多個(gè)指標(biāo),指標(biāo)間易相互影響,某一條件不一定對(duì)多個(gè)指標(biāo)同時(shí)有效。Rane等[13]運(yùn)用空間分析多影響因子法(MIF)和逼近理想解排序法(TOPSIS),考慮12個(gè)氣候、地球物理和可達(dá)性因素對(duì)壩址建設(shè)潛力進(jìn)行評(píng)價(jià),得到5個(gè)適宜建壩地點(diǎn)。王彥等[14]通過(guò)改進(jìn)TOPSIS評(píng)價(jià)不同酶、菌及復(fù)合酶菌制劑對(duì)葡萄籽混合飼料的發(fā)酵效果,發(fā)現(xiàn)在25和30 ℃下添加1×109CFU/kg的植物乳桿菌發(fā)酵15 d效果較優(yōu)。本試驗(yàn)采用TOPSIS對(duì)多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。TOPSIS是多目標(biāo)決策分析中一種常用的有效方法,通過(guò)計(jì)算評(píng)價(jià)對(duì)象與最優(yōu)解、最劣解的距離來(lái)進(jìn)行排序,若評(píng)價(jià)對(duì)象最靠近最優(yōu)解又最遠(yuǎn)離最劣解,則為最好,否則為最差[15]。

本試驗(yàn)以枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis,BS)和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum,LP)為發(fā)酵菌種,以平菇菌糠和玉米粉為發(fā)酵底物,采用單因素試驗(yàn)探究發(fā)酵條件的最適范圍,作為六因素三水平正交試驗(yàn)的水平以常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo),結(jié)合嚴(yán)少樂(lè)等[16]將熵權(quán)法內(nèi)嵌至TOPSIS中獲取指標(biāo)權(quán)重的改進(jìn)TOPSIS綜合評(píng)價(jià),探究玉米粉添加量、菌液接種量、物料含水量、菌種比例、發(fā)酵時(shí)間及發(fā)酵溫度對(duì)復(fù)合益生菌發(fā)酵平菇菌糠的影響,以期優(yōu)化菌糠飼料發(fā)酵條件,推動(dòng)菌糠資源飼料化利用,解決飼料供需矛盾。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

發(fā)酵底物為出菇三茬后的平菇菌糠,取自新疆阿拉爾市某平菇種植基地,平菇培養(yǎng)基由棉籽殼、鋸末、小麥麩、石灰等原料組成。發(fā)酵原料營(yíng)養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)菌種BS:選用LB液體培養(yǎng)基,置于37 ℃,150 r/min、恒溫?fù)u床培養(yǎng)12 h,采用稀釋平板涂布的方法進(jìn)行活菌數(shù)測(cè)定,測(cè)得活菌數(shù)≥1×1010CFU/mL;試驗(yàn)菌種LP:選用MRS液體培養(yǎng)基,置于37 ℃,厭氧、靜置培養(yǎng)12 h,采用稀釋平板涂布的方法進(jìn)行活菌數(shù)測(cè)定,測(cè)得活菌數(shù)≥1×1010CFU/mL。帶有單向透氣閥的聚乙烯發(fā)酵袋購(gòu)自浙江某塑業(yè)公司。

表1 發(fā)酵原料營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以原料平菇菌糠和輔料玉米粉作為發(fā)酵底物,自然pH條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。發(fā)酵結(jié)束后,在65 ℃烘箱中烘至恒重,在空氣中回潮24 h,粉碎過(guò)40目篩,用于測(cè)定CP、EE、NDF、ADF含量,干物質(zhì)損失率,pH和氨態(tài)氮(NH3-N)含量。

1.2.1 玉米粉添加量

玉米粉添加量以0、5%、10%、15%、20%和25%(添加的玉米粉干重與菌糠干重的比值)為單因素,每組3個(gè)重復(fù),菌液接種量12%,BS和LP菌種比例1∶1,物料含水量80%,發(fā)酵時(shí)間7 d,發(fā)酵溫度37 ℃。

1.2.2 菌液接種量

菌液接種量以4%、8%、12%、16%、20%、24%(BS和LP混合液的總體積與菌糠干重的比值)和空白(不接種菌液)為單因素,每組3個(gè)重復(fù),玉米粉添加量按優(yōu)化結(jié)果選取,BS和LP菌種比例1∶1,物料含水量80%,發(fā)酵時(shí)間7 d,發(fā)酵溫度37 ℃。

1.2.3 物料含水量

物料含水量以50%、60%、70%、80%、90%和100%(超純水和菌液總質(zhì)量與菌糠干重的比值)為單因素,每組3個(gè)重復(fù),玉米粉添加量和菌液接種量按優(yōu)化結(jié)果選取,BS和LP菌種比例1∶1,發(fā)酵時(shí)間7 d,發(fā)酵溫度37 ℃。

1.2.4 BS和LP菌種比例

菌種比例以BS和LP 2種菌種復(fù)配比例(3∶1、1∶3、1∶1、2∶1、1∶2)以及BS與LP分別單菌發(fā)酵為單因素,每組3個(gè)重復(fù),玉米粉添加量、菌液接種量和物料含水量按優(yōu)化結(jié)果選取,發(fā)酵時(shí)間7 d,發(fā)酵溫度37 ℃。

1.2.5 發(fā)酵時(shí)間

發(fā)酵時(shí)間以1、4、7、10、13和16 d(發(fā)酵飼料制作完成至將發(fā)酵袋取出培養(yǎng)箱所經(jīng)歷的時(shí)間)為單因素,每組3個(gè)重復(fù),玉米粉添加量、菌液接種量、物料含水量和BS和LP菌種比例按優(yōu)化結(jié)果選取,發(fā)酵溫度37 ℃。

1.2.6 發(fā)酵溫度

發(fā)酵溫度以25(平均室溫)、37、50和60 ℃(培養(yǎng)箱的溫度)為單因素,每組3個(gè)重復(fù),玉米粉添加量、菌液接種量、物料含水量、發(fā)酵時(shí)間和BS和LP菌種比例按優(yōu)化結(jié)果選取。

1.3 正交試驗(yàn)

綜合前人對(duì)發(fā)酵菌糠的研究以及單因素試驗(yàn),基于正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,選取玉米粉添加量、菌液接種量、物料含水量、發(fā)酵時(shí)間、BS和LP菌種比例、發(fā)酵溫度6個(gè)具有代表性因素,每個(gè)因素3個(gè)水平,本研究不考慮因子間的交互作用,僅考慮主效應(yīng),選取L18(36)正交表進(jìn)行試驗(yàn),正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。用電子秤稱取100 g平菇菌糠,按照單因素與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)算玉米粉的質(zhì)量、所需BS和LP復(fù)合菌液的體積數(shù)以及所用水的體積數(shù)(扣除菌液總體積),將菌液倒入水中搖勻,均勻?yàn)⒃诤陀衩追刍旌暇鶆虻钠焦骄飞?拌勻之后裝入聚乙烯呼吸袋中,每組3個(gè)重復(fù),單室真空包裝機(jī)抽真空后,按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)的溫度放入恒溫培養(yǎng)箱中,到試驗(yàn)設(shè)計(jì)的時(shí)間取出。取10 g樣品于250 mL錐形瓶,加入90 mL蒸餾水在4 ℃冰箱保存24 h用于測(cè)定pH及NH3-N、乳酸(LA)、乙酸(AA)、丙酸(PA)、丁酸(BA)含量。其余樣品65 ℃烘干經(jīng)中藥粉碎機(jī)粉碎后裝入自封袋用于測(cè)定CP、EE、NDF、ADF含量及干物質(zhì)損失率。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定各組營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì),根據(jù)改進(jìn)TOPSIS中應(yīng)用熵權(quán)法得到綜合評(píng)分分析發(fā)酵效果,篩選出發(fā)酵參數(shù)較優(yōu)組合。

表2 L18(36)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 營(yíng)養(yǎng)成分

飼料中DM、CP、NDF、ADF、EE含量分別參照GB/T 6435—2014、GB/T 6432—2018、GB/T 6434—2006、NY/T 1459—2007和GB/T 6433—2006的方法測(cè)定。

干物質(zhì)損失率(%)=[(發(fā)酵前DM重量-發(fā)酵后DM重量)/原料DM重量]×100。

1.4.2 發(fā)酵品質(zhì)

稱取樣品10 g,加入90 mL蒸餾水,放入4 ℃冰箱24 h后用4層紗布過(guò)濾,擠凈殘?jiān)械慕嵋?用定量濾紙過(guò)濾備用。使用pH計(jì)測(cè)定pH;采用苯酚-次氯酸鈉比色法[17]測(cè)定NH3-N含量;采用Thermo Scientific UltiMate 3000型高效液相色譜儀[UltiMate XB-C18型色譜柱;柱溫:35 ℃;流動(dòng)相:0.1 mol/L磷酸二氫鉀(KH2PO4);流速:1 mL/min]測(cè)定LA、AA、PA和BA含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016初步處理后,采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),用Duncan氏法進(jìn)行多重比較,以P<0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)合本課題組王彥等[14]TOPSIS篩選發(fā)酵參數(shù)較優(yōu)組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米粉添加量的優(yōu)化

由表3可見,隨著玉米粉添加量的增加,飼料中的CP、EE含量逐漸升高,NDF、ADF含量和pH逐漸降低,干物質(zhì)損失率先升高后降低,NH3-N含量先降低后升高,添加玉米粉5%～25%組CP含量顯著高于不添加玉米粉組(P<0.05),添加玉米粉5%～25%組的NDF含量和pH顯著低于不添加玉米粉組(P<0.05)。通過(guò)玉米粉添加量與理想添加量的接近度可知(表4),各方案與“理想解”的相對(duì)接近度C,隨著玉米粉添加量的增加而增大,即添加越多的玉米粉方案越優(yōu)。綜合考慮平菇菌糠開發(fā)利用的成本等因素,選擇5%、10%、15%玉米粉添加量為較優(yōu)水平,供正交試驗(yàn)進(jìn)一步篩選。

表3 玉米粉添加量對(duì)菌糠發(fā)酵飼料營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))

表4 玉米粉添加量與理想添加量的接近度

2.2 菌液接種量的優(yōu)化

由表5可知,隨著BS和LP復(fù)合菌液接種量的增加,飼料中的CP、EE含量先升高后降低,NDF、ADF、NH3-N含量先降低后升高,干物質(zhì)損失率逐漸升高,pH逐漸降低,菌液接種量16%組CP含量顯著高于其他各組(P<0.05),菌液接種量12%～20%組的EE含量顯著高于其他各組(P<0.05)。由表6可知,各方案與“理想解”的相對(duì)接近度由大到小排在前3的菌液接種量依次是16%、12%、20%,與營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)得出的結(jié)果一致。因此認(rèn)為,BS和LP復(fù)合菌液接種量適宜范圍是12%～20%。

表5 菌液接種量對(duì)菌糠發(fā)酵飼料營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))

表6 菌液接種量和理想接種量的接近度

2.3 物料含水量的優(yōu)化

由表7可知,隨著物料含水量的增加,飼料中的CP、EE含量先升高后降低,NDF、ADF、NH3-N含量先降低后升高,干物質(zhì)損失率逐漸升高,pH逐漸降低,物料含水量80%組的CP含量顯著高于其他各組(P<0.05)。由表8可知,各方案與“理想解”的相對(duì)接近度由大到小排在前3的物料含水量依次是80%、70%、60%,與營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)得出的結(jié)果一致。因此認(rèn)為,物料含水量的適宜水平為80%、70%、60%。

表7 物料含水量對(duì)菌糠發(fā)酵飼料營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))

表8 物料含水量與理想添加量的接近度

2.4 BS和LP菌種比例的優(yōu)化

由表9可見,BS和LP菌種比例為3∶1組的EE含量顯著高于其他各組(P<0.05),單菌BS組的NH3-N含量顯著高于其他各組(P<0.05),各組的CP、NDF含量差異不顯著(P>0.05)。由表10可知,各方案與“理想解”的相對(duì)接近度由大到小排在前3的BS和LP菌種比例依次是2∶1、3∶1、1∶1,因此認(rèn)為,BS和LP菌種比例的較優(yōu)水平為2∶1、3∶1、1∶1。

表9 BS和LP菌種比例對(duì)菌糠發(fā)酵飼料營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))

表10 BS和LP菌種比例與理想添加量的接近度

2.5 發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化

由表11可知,隨著發(fā)酵時(shí)間的增加,飼料中的CP、EE含量先升高后降低,NDF、ADF、NH3-N含量先降低后升高,干物質(zhì)損失率逐漸升高,pH逐漸降低,各組CP、EE含量差異不顯著(P>0.05),發(fā)酵7、10和13 d組的NDF含量顯著低于其他各組(P<0.05),發(fā)酵10 d組的pH與其他各組差異顯著(P<0.05)。由表12可知,各方案與“理想解”的相對(duì)接近度由大到小排在前3的發(fā)酵時(shí)間依次是4、1和10 d,但發(fā)酵1、10和7 d相對(duì)接近度相差不大,綜合營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì),發(fā)酵時(shí)間的較優(yōu)水平為7、10和13 d。

表11 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌糠發(fā)酵飼料營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))

表12 發(fā)酵時(shí)間與理想添加量的接近度

2.6 發(fā)酵溫度的優(yōu)化

由表13可見,隨著發(fā)酵溫度的增加,飼料中的CP、EE含量及干物質(zhì)損失率先升高后降低,NDF、ADF、NH3-N含量先降低后升高,pH逐漸升高。由表14可知,各方案與“理想解”的相對(duì)接近度由大到小排在前3的發(fā)酵溫度依次是37、25(室溫)、49 ℃,但49 ℃相對(duì)接近度較小,綜合營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì),發(fā)酵溫度的較優(yōu)水平為25(室溫)、37、45 ℃。

表13 發(fā)酵溫度對(duì)菌糠發(fā)酵飼料營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))

表14 發(fā)酵溫度與理想添加量的接近度

2.7 正交設(shè)計(jì)結(jié)果

由表15可知,根據(jù)改進(jìn)TOPSIS中應(yīng)用熵權(quán)法得到CP、EE、NDF、ADF含量,干物質(zhì)損失率,pH及NH3-N、LA、AA、PA、BA含量的權(quán)重值分別為0.086、0.089、0.087、0.039、0.247、0.053、0.104、0.082、0.241、0.032、0.026。綜合評(píng)分等于CP/CP最大值×0.086+EE/EE最大值×0.089+NDF/NDF最大值×0.087+ADF/ADF最大值×0.039+干物質(zhì)損失率最大值×0.247+pH/pH最大值×0.053+NH3-N/NH3-N最大值×0.104+LA/LA最大值×0.082+AA/AA最大值×0.241+PA/PA最大值×0.032+BA/BA最大值×0.026。通過(guò)極差分析得出的主次序?yàn)?A>C>D>E>B>F,綜合評(píng)分受A因素(玉米粉添加量)影響最大,并且在A1水平下較高,得到優(yōu)化組為G1(A1B1C1D1E1F1),綜合考慮單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果和實(shí)際應(yīng)用需要,選擇A2B2C2D1E2F1進(jìn)一步優(yōu)化。

表15 飼料中營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)正交試驗(yàn)結(jié)果表(干物質(zhì)基礎(chǔ))

由于G1(A1B1C1D1E1F1)在表中,單獨(dú)對(duì)A2B2C2D1E2F1做優(yōu)化試驗(yàn),結(jié)果見表16,A2B2C2D1E2F1相比于G1(A1B1C1D1E1F1)的CP、EE含量相差不大,NDF含量降低了13.90%,干物質(zhì)損失率降低了11.82%,pH降低了16.94%,A2B2C2D1E2F1的ADF、NH3-N含量分別為22.15%、6.56%,LA、AA、PA、BA含量分別為8.23、2.87、0.16和0.09 mmol/L。A2B2C2D1E2F1相比于平菇菌糠原料,CP含量升高了34.14%(6.21%),EE含量升高了19.41%(6.08%),NDF含量降低了40.38%(52.57%),ADF含量降低了44.47%(38.89%)。綜上所述,確定A2B2C2D1E2F1[即玉米添加量10%、菌液接種量16%、物料含水量80%、發(fā)酵時(shí)間7 d、BS和LP菌種比例2∶1、發(fā)酵溫度25 ℃(室溫)]為最優(yōu)組合。

表16 最優(yōu)組合篩選(干物質(zhì)基礎(chǔ))

3 討 論

利用微生物發(fā)酵非常規(guī)飼料不僅可以解決飼料資源浪費(fèi)、污染環(huán)境等問(wèn)題,還可以填補(bǔ)我國(guó)飼料供應(yīng)的缺口,具有較大的應(yīng)用前景[18-19]?；炀l(fā)酵飼料時(shí)的菌液接種量、物料含水量、菌種比例、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度以及底物的碳源氮源等,是影響飼料中微生物生長(zhǎng)和飼料發(fā)酵品質(zhì)的代謝物積累的重要因素[20-21]。菌液接種量會(huì)改變微生物的生長(zhǎng)、繁殖、代謝,從而影響發(fā)酵結(jié)果,菌液接種量過(guò)高,代謝產(chǎn)物過(guò)多會(huì)反過(guò)來(lái)抑制代謝使發(fā)酵不充分,菌液接種量過(guò)低,不能有效改善飼料品質(zhì)[22]。物料含水量過(guò)高,飼料中氧氣流通變少,影響微生物生長(zhǎng),物料含水量過(guò)低,底物溶解度太低,影響底物利用率。適宜的菌種比例可以使混菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生相互促進(jìn)作用,相反某種菌比例過(guò)高,其代謝物可能產(chǎn)生拮抗作用,抑制其他微生物的生長(zhǎng)。發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng),不僅會(huì)增加時(shí)間成本,還會(huì)增加底物的干物質(zhì)損失率,發(fā)酵時(shí)間過(guò)短,飼料發(fā)酵品質(zhì)改善不明顯。溫度主要影響發(fā)酵過(guò)程中的酶促效率,常用的芽孢桿菌和乳酸菌適宜溫度接近,只需考慮生產(chǎn)中應(yīng)用的需要即可。飼料中CP、EE、LA、AA含量等較高為宜,NDF、ADF含量,干物質(zhì)損失率,pH及NH3-N、PA、BA含量等較低為宜,本試驗(yàn)以這些指標(biāo)作為依據(jù),采用單因素與正交試驗(yàn)相結(jié)合,并用TOPSIS模型綜合評(píng)價(jià),對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)一步篩選優(yōu)化,為菌糠飼料工業(yè)化生產(chǎn)提供可能。

在微生物發(fā)酵飼料的發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)中,單因素試驗(yàn)是最能直觀反映各因素對(duì)發(fā)酵效果的影響[23]。探究玉米粉添加量的試驗(yàn)中,隨著玉米粉添加量的增加,發(fā)酵菌糠飼料中的CP、EE含量逐漸升高。裴朝東[24]用響應(yīng)面法優(yōu)化混菌發(fā)酵肉鵝青貯飼料工藝,選擇酒糟、稻殼、玉米粉、象草等4個(gè)因素為自變量因子,發(fā)現(xiàn)各試驗(yàn)組發(fā)酵后EE、CP的含量均有不同程度的增加,其中EE含量的增幅為1.34%～4.33%,CP含量的增幅為3.50%～5.10%,與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

玉米粉是菌糠發(fā)酵飼料中微生物初期的大量擴(kuò)繁的碳源和氮源,TOPSIS綜合評(píng)價(jià)得出,添加越多的玉米粉方案越優(yōu),但過(guò)多的玉米粉添加會(huì)造成菌糠資源飼料化利用的成本增加。探究菌液接種量的試驗(yàn)中,隨著菌液接種量的增加,飼料中的CP、EE含量先升高后降低。黎光楊等[25]用解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵全棉籽,發(fā)現(xiàn)隨著接種量的增加,CP含量先升高后下降,當(dāng)接種量為25%時(shí),CP含量顯著高于其余接種量,與本試驗(yàn)結(jié)果一致。接種量過(guò)大,導(dǎo)致CP、EE含量下降的原因可能是在發(fā)酵后期底物里的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足以供給大量微生物生長(zhǎng)繁殖,微生物消耗了能改善發(fā)酵效果的代謝產(chǎn)物[26]。因此菌液接種量不是越大越好,TOPSIS綜合評(píng)價(jià)也得出了相同的結(jié)果。探究物料含水量的試驗(yàn)中,隨著物料含水量的增加,飼料中的CP、EE含量先升高后降低,NDF、ADF、NH3-N含量先降低后升高。因?yàn)槲锪虾恐苯佑绊懢甑纳姝h(huán)境和活性,進(jìn)而影響產(chǎn)酶效果。含水量過(guò)低,菌株生長(zhǎng)環(huán)境缺水,菌株與底物沒(méi)能充分接觸,生長(zhǎng)緩慢,代謝能力低;含水量過(guò)高,底物黏稠,含氧量減少,菌株的生長(zhǎng)繁殖受到極大影響[27]。探究菌種比例的試驗(yàn)中,BS、LP比例2∶1明顯優(yōu)于其他各組,結(jié)果與改進(jìn)TOPSIS綜合評(píng)價(jià)一致。在適宜的比例下,多菌株發(fā)酵能夠發(fā)揮菌株間的協(xié)同作用,使發(fā)酵效果優(yōu)于單菌株發(fā)酵[28]。探究發(fā)酵時(shí)間與溫度的試驗(yàn)中,從各指標(biāo)的變化趨勢(shì)來(lái)看,時(shí)間、溫度均有適宜的范圍,溫度選擇室溫(均溫25 ℃)、37 ℃,發(fā)酵時(shí)間選擇7和10 d。微生物的生長(zhǎng)、繁殖、代謝受溫度影響較大,溫度適宜,菌活酶活高,所需發(fā)酵時(shí)間短,因此發(fā)酵溫度和時(shí)間的優(yōu)化是必要的。魏炳棟等[29]采用地衣芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌、黑曲霉4株菌混合發(fā)酵玉米蛋白粉時(shí)在33 ℃發(fā)酵84 h時(shí)達(dá)到最佳效果。與本試驗(yàn)結(jié)果不一致的原因可能是使用的菌種不同,適宜的發(fā)酵溫度也不同。

另外在正交試驗(yàn)中,對(duì)于不同的評(píng)價(jià)指標(biāo),發(fā)酵工藝影響因素的主次順序不同。本研究表明,以綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)時(shí),影響平菇菌糠發(fā)酵的主次因素分別是玉米粉添加量、物料含水量、發(fā)酵時(shí)間、BS和LP菌種比例、菌液接種量、發(fā)酵溫度。Tao等[30]和王丹媚等[31]研究表明,影響發(fā)酵的主要因素是時(shí)間、溫度、接種量;Liu等[32]研究表明,物料含水量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度是影響發(fā)酵的主要因素。吝常華等[33]的研究表明,影響發(fā)酵的主要因素有發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、料水比以及菌液接種量。產(chǎn)生不同結(jié)果的原因可能與發(fā)酵底物、菌種、各因素水平等因素有關(guān)。本試驗(yàn)綜合考慮單因素與正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果和實(shí)際應(yīng)用需要,選擇不在正交表中的A2B2C2D1E2F1,并對(duì)其進(jìn)一步優(yōu)化驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)除CP、EE含量外,其余各指標(biāo)在玉米粉添加量10%、菌液接種量16%、物料含水量80%、發(fā)酵時(shí)間7 d、BS和LP菌種比例2∶1、溫度25 ℃(室溫)條件下均有不同程度的改善。羅彥玉等[34]用一株蠟樣芽孢桿菌來(lái)固態(tài)發(fā)酵油茶餅粕,最佳工藝條件為含水量109.9%,發(fā)酵溫度31.1 ℃,接種量10.0%,發(fā)酵時(shí)間48.0 h。萬(wàn)里等[35]用乳酸菌和酵母菌發(fā)酵精補(bǔ)料,最佳發(fā)酵條件為接種量5%,接種比例2∶1、發(fā)酵溫度30 ℃、水料比1∶1。沈城等[2]采用固態(tài)發(fā)酵金針菇菌糠,發(fā)現(xiàn)最佳的發(fā)酵參數(shù)是選擇釀酒酵母、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌做發(fā)酵劑、發(fā)酵時(shí)間7 d、發(fā)酵溫度30 ℃。本試驗(yàn)部分條件與以上研究一致,部分有差別,可能與所測(cè)指標(biāo)、所選菌種、發(fā)酵底物不一致有關(guān)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)基于改進(jìn)TOPSIS,通過(guò)單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)結(jié)合探究玉米粉添加量、菌液接種量、BS和LP菌種比例、物料含水量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度對(duì)平菇菌糠發(fā)酵產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)的影響,確定了最佳發(fā)酵參數(shù):玉米粉添加量10%、菌液接種量16%、物料含水量80%、發(fā)酵時(shí)間7 d、BS和LP菌種比例2∶1、發(fā)酵溫度25 ℃(室溫)。