潘希望,邱模競(jìng),鄭林林,楊新博,徐 晨,李太原,胡家萍

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科,南昌 330006)

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞株:人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。主要試劑:DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco);胎牛血清(Gibco);青霉素-鏈霉素溶液(Biosharp);TSPEAR-AS2 shRNA質(zhì)粒載體(上海吉瑪基因);Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco);CCK-8試劑盒(新賽美生物科技);Lipofectamine?2000(Invitrogen);Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技);TRIzol(Invitrogen)。主要儀器:CO2培養(yǎng)箱(Thermo);酶標(biāo)儀(BIO-TEK);離心機(jī)(Eppendorf);熒光定量PCR儀(BIO-RAD);流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter);倒置顯微鏡(Nikon)。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)庫(kù)資料獲取及預(yù)處理

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/tcga)中下載452例結(jié)腸癌患者的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù),包括臨床信息、lncRNA及miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)。提取lncRNA及miRNA表達(dá)數(shù)據(jù),生成相應(yīng)的表達(dá)矩陣。保留臨床信息中患者的生存時(shí)間、生存狀態(tài)等資料。使用R軟件limma包,對(duì)下載的lncRNA和miRNA表達(dá)矩陣進(jìn)行預(yù)處理,包括數(shù)據(jù)背景校正、中位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化以及基因名轉(zhuǎn)換等。

1.2.2 差異表達(dá)分析

使用R軟件limma包對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化后lncRNA和miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析,設(shè)定閾值:|差異倍數(shù)|≥2及P<0.05,篩選結(jié)腸癌組織和癌旁組織中差異表達(dá)lncRNA(DE-lncRNA)和miRNA(DE-miRNA)。

You should look up the words.Their meanings are unclear.

1.2.3 單因素Cox回歸分析

整合結(jié)腸癌患者的臨床信息(包括生存時(shí)間和生存狀態(tài))和癌組織中DE-lncRNA及DE-miRNA表達(dá)譜,使用R軟件survival包,對(duì)DE-lncRNA和DE-miRNA進(jìn)行單因素Cox回歸分析。根據(jù)HR值和P值篩選與預(yù)后顯著相關(guān)的lncRNA和miRNA。

1.2.4 lncRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

采用miRNet數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.mirnet.ca/miRNet/home.xhtml),探究上述預(yù)后相關(guān)lncRNA和miRNA之間的相互關(guān)系,剔除癌組織和癌旁組織中表達(dá)趨勢(shì)一致的lncRNA-miRNA對(duì),構(gòu)建lncRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)。

1.2.5 功能富集分析

采用mirPath v.3軟件對(duì)lncRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行功能富集分析,包括GO分析和KEGG分析,并繪制相應(yīng)的氣泡圖。

1.2.6 預(yù)后模型構(gòu)建

使用R軟件glmnet包進(jìn)行LASSO回歸分析以構(gòu)建結(jié)腸癌患者預(yù)后模型。整合結(jié)腸癌患者的生存時(shí)間、生存狀態(tài)和差異lncRNA-miRNA的表達(dá)數(shù)據(jù);利用LASSO-Cox算法進(jìn)行變量選擇,通過(guò)十折交叉驗(yàn)證選取最優(yōu)λ值,從所有特征基因中篩選出與患者預(yù)后顯著相關(guān)的關(guān)鍵特征基因。根據(jù)特征基因的系數(shù)(Coefficients)生成預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式:風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(RiskScore)=∑Coefficients×expi(expi代表第i個(gè)特征基因的表達(dá)值)。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將所有患者分為高危組和低危組。采用survival包進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析,通過(guò)log-rank檢驗(yàn)比較2組患者的生存差異。使用survivalROC包繪制ROC曲線并計(jì)算AUC值,評(píng)估構(gòu)建的預(yù)后模型對(duì)患者生存預(yù)測(cè)的特異性和敏感性。

1.2.7 細(xì)胞分組及處理

使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞,按細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)每2～3天傳代1次。將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為對(duì)照組和TSPEAR-AS2敲減組(敲減組)。敲減組采用Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑將TSPEAR-AS2 shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至HCT116細(xì)胞,對(duì)照組加入等量培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24 h后,提取2組總RNA,采用qPCR檢測(cè)TSPEAR-AS2的表達(dá)水平,驗(yàn)證沉默效率。

1.2.8 CCK-8實(shí)驗(yàn)

將2組細(xì)胞以2×103細(xì)胞·孔-1接種于96孔板,每孔加入100 μL培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后24、48、72 h加入CCK-8試劑10 μL,孵育1 h,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm處吸光度值(OD值)。

1.2.9 劃痕實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期2組細(xì)胞接種于六孔板,每孔加入2 mL含有1×105細(xì)胞·孔-1的DMEM培養(yǎng)基。待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí),使用無(wú)菌200 μL槍頭進(jìn)行劃痕,PBS洗滌細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。在劃痕 0 h和24 h分別觀察并拍照記錄2組細(xì)胞,Image J軟件分析并計(jì)算2組細(xì)胞遷移率。

1.2.10 流式細(xì)胞術(shù)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期2組細(xì)胞接種于六孔板,每孔加入2 mL含1×105細(xì)胞·孔-1的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞,調(diào)整密度為1×106細(xì)胞·mL-1。將細(xì)胞重懸于結(jié)合緩沖液中,加入Annexin V-FITC/PI進(jìn)行染色,室溫避光孵育15 min。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)2組細(xì)胞凋亡情況。

1.2.11 qPCR實(shí)驗(yàn)

TRIzol法提取2組細(xì)胞總RNA,采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Master Mix進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。qPCR檢測(cè)TSPEAR-AS2、hsa-mir-4731-5p和hsa-mir-342-3p的表達(dá)。以GAPDH作為T(mén)SPEAR-AS2的內(nèi)參照基因,U6作為hsa-mir-4731-5p和hsa-mir-342-3p的內(nèi)參照基因。目的基因與內(nèi)參基因引物見(jiàn)表1。qPCR反應(yīng)40個(gè)循環(huán)(95 ℃ 10 s,53～58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s)。

表1 各基因引物序列

1.2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織中差異表達(dá)的lncRNA和miRNA

差異表達(dá)分析結(jié)果顯示,結(jié)腸癌組織和癌旁組織中1823個(gè)差異表達(dá)lncRNA(DE-lncRNA)和524個(gè)差異表達(dá)的miRNA(DE-miRNA),其中980個(gè)lncRNA和421個(gè)miRNA在結(jié)腸癌組織中顯著下調(diào),843個(gè)lncRNA和103個(gè)miRNA在結(jié)腸癌組織中顯著上調(diào)。見(jiàn)圖1。

A:差異表達(dá)lncRNA的火山圖。B:差異表達(dá)miRNA的火山圖。圖1 結(jié)腸癌組織中差異表達(dá)lncRNA和miRNA的火山圖

2.2 結(jié)腸癌預(yù)后相關(guān)lncRNA和miRNA

單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示,158個(gè)lncRNA和31個(gè)miRNA與預(yù)后相關(guān)。

2.3 成功構(gòu)建結(jié)腸癌預(yù)后相關(guān)的lncRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)

miRNet數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果顯示,22對(duì)與預(yù)后相關(guān)的lncRNA-miRNA存在互作,包括8個(gè)lncRNA和14個(gè)miRNA 。見(jiàn)圖2。結(jié)腸癌組織中這些lncRNA和miRNA的表達(dá)見(jiàn)圖3。與癌旁組織比較,5個(gè)lncRNA(SNHG16、LINC00894、MIR503HG、TSPEAR-AS2和LINC00858)在結(jié)腸癌組織中顯著上調(diào),3個(gè)lncRNA(CYP1B1-AS1、LINC00324和FENDRR)在結(jié)腸癌組織中顯著下調(diào);3個(gè)miRNA(hsa-mir-493、hsa-mir-495和hsa-mir-708)在結(jié)腸癌組織中顯著上調(diào),11個(gè)miRNA(hsa-mir-4731、hsa-mir-6875、hsa-mir-149、hsa-mir-342、hsa-let-7a-3、hsa-let-7e、hsa-mir-1301、hsa-mir-205、hsa-mir-488、hsa-let-7a-2和hsa-mir-193b)在結(jié)腸癌組織中顯著下調(diào)。

圖2 與預(yù)后相關(guān)的lncRNA-miRNA互作網(wǎng)絡(luò)

2.4 lncRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)的功能富集分析

GO富集分析結(jié)果顯示,lncRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)主要富集在細(xì)胞氮化合物代謝過(guò)程、離子結(jié)合、生物合成過(guò)程、細(xì)胞蛋白質(zhì)修飾過(guò)程、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素 TRK 受體信號(hào)通路、基因表達(dá)、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、共生,包括從寄生到互生的過(guò)程等生物學(xué)功能。KEGG富集結(jié)果顯示,lncRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展和預(yù)后的分子機(jī)制可能涉及癌癥中的蛋白聚糖、TGF-β信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路、GABA能突觸、晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)、黏著斑、癌癥的發(fā)病途徑等信號(hào)通路。按顯著性大小排名前30的生物學(xué)功能和信號(hào)通路氣泡圖見(jiàn)圖4。

圖4 lncRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)的功能富集分析

2.5 成功構(gòu)建預(yù)后模型

采用LASSO-Cox回歸模型,通過(guò)十折交叉驗(yàn)證,選擇最優(yōu)參數(shù)λ=0.03,最終從lncRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)中鑒定出11個(gè)能夠有效評(píng)價(jià)結(jié)腸癌預(yù)后特征的關(guān)鍵基因。見(jiàn)圖5A。以11個(gè)關(guān)鍵基因構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型,預(yù)后模型風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分計(jì)算如下:

A:LASSO回歸篩選關(guān)鍵預(yù)后基因;B:預(yù)后模型評(píng)價(jià)結(jié)腸癌患者的風(fēng)險(xiǎn)狀態(tài);C:Kaplan-Meier生存曲線;D:ROC曲線。圖5 預(yù)后模型的構(gòu)建及評(píng)估

風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=-0.032 0×FENDRR+0.016 9×LINC00894-0.007 5×LINC01842-0.305 8×SNHG16+0.965 3×TSPEAR-AS2+0.001 5×hsa-let-7e+0.016 2×hsa-mir-149+0.623 5×hsa-mir-1908+1.421 9×hsa-mir-488+0.020 8×hsa-mir-6875+0.132 0×hsa-mir-887。預(yù)后模型對(duì)結(jié)腸癌患者風(fēng)險(xiǎn)狀態(tài)的評(píng)價(jià)效果顯示,高風(fēng)險(xiǎn)組生存狀態(tài)低于低風(fēng)險(xiǎn)組。見(jiàn)圖5B。Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示,高風(fēng)險(xiǎn)組生存時(shí)間顯著短于低風(fēng)險(xiǎn)組(P<0.001)。見(jiàn)圖5C。ROC曲線結(jié)果顯示,該模型預(yù)測(cè)1年(365 d)、3年(1095 d)和5年(1825 d)生存的AUC分別為0.70、0.74和0.71。見(jiàn)圖5D。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇預(yù)后模型中風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)及表達(dá)差異最大的lncRNA(TSPEAR-AS2)進(jìn)行細(xì)胞水平驗(yàn)證。

2.6 TSPEAR-AS2敲減效率

qPCR結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,敲減組中TSPEAR-AS2的表達(dá)量顯著下降(下降71.84%,P<0.01),表明敲減效果良好,見(jiàn)圖6。

*P<0.01。圖6 2組TSPEAR-AS2表達(dá)

2.7 TSPEAR-AS2敲減對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響

與對(duì)照組比較:敲減組24、48、72 h細(xì)胞活力均顯著降低(P<0.01),見(jiàn)圖7A;敲減組細(xì)胞遷移能力顯著降低(P<0.01),見(jiàn)圖7B—C;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,敲減組凋亡細(xì)胞比例顯著增加(P<0.01),見(jiàn)圖7D—E。

A:CCK-8實(shí)驗(yàn);B:劃痕實(shí)驗(yàn)圖;C:2組相對(duì)遷移率比較。圖7 TSPEAR-AS2敲低對(duì)HCT116細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響

2.8 TSPEAR-AS2敲減對(duì)miRNA表達(dá)的影響

在lncRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)中,hsa-mir-4731-5p和hsa-mir-342-3p是TSPEAR-AS2的下游靶標(biāo)。qPCR結(jié)果顯示,下調(diào)TSPEAR-AS2表達(dá)能顯著增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞中hsa-mir-4731-5p和hsa-mir-342-3p的表達(dá)。見(jiàn)圖8。

*P<0.01。圖8 敲減TSPEAR-AS2對(duì)相關(guān)miRNA表達(dá)的影響

3 討論

lncRNA作為miRNA的分子海綿,通過(guò)與miRNA間的互補(bǔ)配對(duì),抑制miRNA的表達(dá)。lncRNA也可以作為競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA,與miRNA的靶基因mRNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,抑制miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控[4]。它們可通過(guò)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程影響腫瘤的進(jìn)程[7]。lncRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在結(jié)腸癌等腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮中重要作用[7-8]。例如,lncRNA HOTAIR高表達(dá)是結(jié)腸癌患者預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)因素,它能夠與miR-34a海綿結(jié)合而抑制其表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖,侵襲和遷移[9]。lncRNA ZFAS1通過(guò)與miR-200b和miR-200c結(jié)合,上調(diào)ZEB1表達(dá),進(jìn)而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[10]。因此,探究lncRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),對(duì)于揭示結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制以及評(píng)價(jià)結(jié)腸癌預(yù)后具有重要意義。

本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析結(jié)腸癌樣本中l(wèi)ncRNA和miRNA的差異表達(dá)譜,篩選出與預(yù)后相關(guān)的lncRNA-miRNA對(duì)。其中一些lncRNA-miRNA對(duì)在結(jié)腸癌或其他腫瘤疾病中發(fā)揮重要作用。比如,YANG等[11]研究表明,SNHG16-hsa-mir-342-3p調(diào)控機(jī)制在多發(fā)性骨髓瘤中發(fā)揮著重要作用。敲除lncRNA SNHG16可通過(guò)降低與miR-342-3p的海綿吸附作用,促進(jìn)miR-342-3p表達(dá),進(jìn)而抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖。YAN等[12]研究表明,SNHG16可能抑制miR-342-3p與EP300之間的相互作用,從而影響肺腺癌中淋巴轉(zhuǎn)移過(guò)程。XIA等[13]研究發(fā)現(xiàn),SNHG16通過(guò)與miR-205-5p結(jié)合,抑制miR-205-5p對(duì)P21激活激酶2(PAK2)的調(diào)控作用,導(dǎo)致PAK2表達(dá)增加,促進(jìn)黑色素瘤的轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)。而SNHG16高表達(dá)和miR-205-5p低表達(dá)均可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[14-15]。另,本研究功能富集分析結(jié)果顯示,這些lncRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)主要富集在TGF-β信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路等腫瘤相關(guān)的生物學(xué)功能和信號(hào)途徑。有研究[16]發(fā)現(xiàn),TGF-β信號(hào)通路激活可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,增加其侵襲和轉(zhuǎn)移能力。ErbB信號(hào)通路的活化能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、抗凋亡、促血管生成等作用[17]。而Hippo通路失活會(huì)導(dǎo)致YAP/TAZ的持續(xù)激活,促進(jìn)結(jié)腸癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[18]。而且,本研究基于這些lncRNA和miRNA構(gòu)建的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型能較好地評(píng)價(jià)結(jié)腸癌患者的生存狀態(tài)。

已有研究[19-20]表明TSPEAR-AS2在乳腺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌和胃癌中高表達(dá),而敲低TSPEAR-AS2可改善這些腫瘤進(jìn)程,抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。本研究以TSPEAR-AS2為代表,分析lncRNA在結(jié)腸癌細(xì)胞中的功能,結(jié)果顯示,下調(diào)TSPEAR-AS2能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移,促進(jìn)其凋亡。此外,生物信息學(xué)結(jié)果顯示,TSPEAR-AS2可能與hsa-mir-4731-5p和hsa-mir-342-3p形成lncRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò),在結(jié)腸癌中發(fā)揮重要作用。雖然既往研究[21-24]顯示hsa-mir-4731-5p和hsa-mir-342-3p在多種腫瘤中起抑癌作用,但目前尚不明確TSPEAR-AS2是否可以影響結(jié)腸癌細(xì)胞中hsa-mir-4731-5p和hsa-mir-342-3p的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn),敲減TSPEAR-AS2可顯著上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞中hsa-mir-4731-5p和hsa-mir-342-3p的表達(dá)。

綜上所述,本研究成功篩選結(jié)腸癌相關(guān)lncRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò),并據(jù)此構(gòu)建的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型具有良好的預(yù)測(cè)效能。TSPEAR-AS2參與調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡以及下游miRNA表達(dá)。這些研究將為結(jié)腸癌的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供潛在的生物標(biāo)志物。