白慶玲，王 斌

1 沂水縣動物疫病預防控制中心，山東臨沂 276400

2 沂水縣道托畜牧獸醫(yī)工作站，山東臨沂 276400

0 引言

隨著人民生活水平提高，乳制品需求的加大促進了我國現(xiàn)代畜牧業(yè)的快速發(fā)展，尤其是奶山羊養(yǎng)殖。奶山羊是一種廣泛分布于全球的家畜，因其適應性強以及抗逆能力強等特點，成為養(yǎng)殖戶選擇的重要品種之一，其乳制品以獨特口感和營養(yǎng)價值備受人們喜愛。我國奶山羊主要品種為關中奶山羊、嶗山奶山羊、薩能奶山羊和文登奶山羊。我國山羊存欄量約為14 000 萬頭，其中奶羊約為900 萬頭，山羊奶產(chǎn)量約為200 萬噸，占全國鮮奶總量的5%左右[1]。雖然我國是世界上山羊存欄量較多的國家之一，但奶山羊單產(chǎn)卻低于歐洲國家。影響山羊產(chǎn)奶量的因素有很多，其中奶山羊乳房炎在世界范圍內(nèi)發(fā)病率較高，對奶制品質(zhì)量和產(chǎn)量帶來極大影響。奶山羊乳房炎不僅導致奶質(zhì)量下降，還增加治療成本，給養(yǎng)殖業(yè)帶來重大經(jīng)濟損失。奶山羊乳房炎是由多種病原菌引起的乳腺感染，常見病原菌主要有金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌等，其產(chǎn)生的毒素會導致奶質(zhì)變壞、食用后中毒等問題。因此，及時發(fā)現(xiàn)并準確鑒定病原菌，采取合適的奶山羊乳房炎防治措施非常關鍵。合理預防和治療，可有效降低奶山羊乳房炎發(fā)生率和對養(yǎng)殖業(yè)的危害性。本試驗通過對山東臨沂地區(qū)某奶山羊養(yǎng)殖場乳房炎主要致病菌的分離鑒定及其藥敏性分析，探究其防治措施，為奶山羊乳房炎預防和治療提供理論基礎和技術支持。

1 試驗材料

1.1 試驗動物與地點

本試驗地點是山東臨沂地區(qū)某奶山羊養(yǎng)殖基地，奶山羊品種為優(yōu)質(zhì)薩能奶山羊。為確保試驗的準確性和可靠性，僅選擇處于泌乳早期且已排過初乳的成年薩能奶山羊，以避免可能由于新陳代謝影響而引起偏差。

1.2 主要試劑及儀器

胰蛋白胨、酵母提取物、犢牛血清、血瓊脂培養(yǎng)基、藥敏紙片，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；革蘭氏染色液試劑盒、核酸染料、血瓊脂培養(yǎng)基、MH固體培養(yǎng)基、高鹽甘露醇固體培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基，購自北京索萊寶科技有限公司；青霉素G、克林霉素、紅霉素、四環(huán)素、氯霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、頭孢唑林、頭孢呋辛、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、氯化鈉，購自上海麥克林生化科技股份有限公司；恒溫培養(yǎng)箱、恒溫搖床，購自上海南榮實驗室設備有限公司；JY02S型凝膠電泳紫外分析儀、JY300C電泳儀、PCR儀，購自美國捷邁邦美公司（Zimmer Biomet，USA）。

2 試驗方法

2.1 樣品采集

試驗采集患有臨床型乳房炎的奶山羊乳樣。通過對養(yǎng)殖場奶山羊乳房進行視診和觸診，篩選出乳房外觀腫脹、充血、發(fā)熱，或乳房呈堅硬或結節(jié)狀的奶山羊，對乳汁進行肉眼觀察，一般患乳房炎奶山羊分泌的乳汁外觀渾濁，且含有膿液或血液。

采樣前需將奶山羊乳房清潔干凈，使用碘伏和棉球擦拭乳頭及周圍皮膚，保持清潔干燥。用手輕輕按壓乳房，讓乳汁流出，棄前3 把奶后，將乳汁采集器貼緊乳頭部位，輕輕旋轉采集器，使其充分貼合乳頭周圍皮膚，收集5 mL乳汁于無菌離心管中，做好標記并使用冰袋運輸至實驗室進行細菌分離和鑒定，共收集46 份乳汁。

2.2 奶山羊乳房炎病原菌分離鑒定

將收集的乳汁反復搖勻后取100 μL涂布接種于血瓊脂培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱恒溫37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，取形態(tài)呈現(xiàn)不同特征的單個菌落，使用劃線平板法分別接種于MH固體培養(yǎng)基、高鹽甘露醇固體培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基，反復純化培養(yǎng)直至呈現(xiàn)單一菌落形態(tài)以達到完全分離效果。

使用水煮法提取各種分離出來的菌株DNA，將菌株使用細菌單克隆培養(yǎng)液離心沉降后，使用超純水洗滌1次，然后加入超純水煮沸15 s后立即將管子置入冰水降溫，使細胞壁破裂，將DNA釋放到溶液中。最后2 000 r/min離心5 min，收集上清液中DNA作為模板，放入-20 ℃冰箱儲存。相關病原菌的引物由金斯瑞生物科技股份有限公司合成，使用細菌16S rDNA引物進行 PCR反應，將配制好的DNA模板、引物、聚合酶和緩沖液混勻，離心后放入PCR儀中，將PCR反應體系加熱至95 ℃預變性5 min，使DNA雙鏈解旋成單鏈，隨后設置95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，以便引物與DNA單鏈結合，最后將PCR反應體系溫度升高至72 ℃進行延伸1 min。按上述步驟從95 ℃預變性5 min開始進行35 個循環(huán)后，于72 ℃條件下延伸5 min，即可得到PCR擴增產(chǎn)物，最后將擴增產(chǎn)物送至廣州銳博生物技術有限公司進行測序，并與GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄序列進行比對，確定細菌種屬。

2.3 主要病原菌藥敏性試驗

使用Kirby-Bauer 紙片擴散法進行病原菌藥敏性試驗，主要測試金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌。將分離純化好的單克隆菌落置于適量生理鹽水中，濃度設置為約1.5×108CFU/mL。用無菌一次性滴管把不同種類的抗生素液滴在藥敏試驗紙片上，讓其充分滲透并固定，在4 mm厚度瓊脂平板表面均勻涂上細菌懸液，然后用無菌鑷子夾取涂上抗生素的藥敏試驗紙片，將其貼在瓊脂平板表面，使紙片與細菌懸液充分接觸，將瓊脂平板倒置在恒溫培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，條件設置為37 ℃、24 h。最后測量出現(xiàn)的無菌區(qū)域，并與賽默飛世爾科技（中國）有限公司提供的抗生素敏感性標準比較，判斷該菌株對各種抗生素的敏感性，本試驗將中間范圍也歸為耐藥標準范疇，具體判定標準見表1。

表1 藥敏試驗判定標準

3 試驗結果

3.1 奶山羊乳房炎病原菌分離鑒定

從山東臨沂某奶山羊養(yǎng)殖場采集的46 份乳樣中，通過細菌培養(yǎng)法分離后得到109 株細菌，使用PCR技術擴增后將樣品送至廣州銳博生物技術有限公司進行測序?qū)Ρ却_定種屬，結果如表2所示。其中葡萄球菌51 株，占46.79%；埃希菌45株，占比41.28%；克雷伯氏菌8 株，占7.33%；腸球菌、芽孢桿菌、酪氨酸鏈球菌占4.59%。本試驗結果表明，該山羊養(yǎng)殖場主要致病菌為葡萄球菌中的金黃色葡萄球菌（28.44%）、大腸埃希菌（41.28%），從細菌種類上呈現(xiàn)致病菌多樣化，說明該山羊養(yǎng)殖場存在多種細菌混合感染的情況。

表2 奶山羊乳房炎病原菌分離、鑒定結果

3.2 主要病原菌藥敏性

通過Kirby-Bauer 紙片擴散法測定不同抗菌藥物對大腸桿菌的影響程度。將乳樣進行細菌培養(yǎng)并對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌分離，對得到的67 株金黃色葡萄球菌、84 株大腸埃希菌進行試驗，結果如表3所示。其中從乳汁中分離出的金黃色葡萄球菌對環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、頭孢噻肟鈉、頭孢呋辛、鏈霉素具有較高敏感性，對青霉素G、克林霉素、慶大霉素和卡那霉素具有較高耐藥性。而大腸埃希菌對青霉素G、克林霉素、紅霉素、鏈霉素具有較高耐藥性，對諾氟沙星、氧氟沙星、慶大霉素、卡那霉素具有較高敏感性。綜合分析發(fā)現(xiàn)，2 種致病菌對青霉素G和克林霉素均具有較高耐藥性，而2 種致病菌對沙星類藥物具有較高敏感性。

表3 2 種病原菌藥敏試驗

4 分析與討論

4.1 奶山羊乳房炎病原菌分離鑒定

細菌感染是奶山羊患乳房炎的最主要原因之一，近年來國內(nèi)許多研究多關注奶牛乳房炎，而奶山羊乳房炎研究較少。奶山羊乳房炎的致病菌種類相對于奶牛較少，其中葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌這3 種細菌占總致病菌的90%以上。

大腸埃希菌是一種常見致病菌，也是多種畜禽細菌性疾病的最主要致病菌。奶山羊感染大腸埃希菌后，開始會出現(xiàn)乳腺炎癥，后出現(xiàn)全身性疾病癥狀，導致脫水甚至死亡。有研究對玉林市奶山羊乳房炎病原菌種類進行探索，結果發(fā)現(xiàn)主要致病菌為葡萄球菌和腸球菌，占比分別為61.5%和23.1%[2]。鄭風英研究表明，濱州市奶山羊臨床型乳房炎結果發(fā)現(xiàn)主要致病菌為金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、無乳鏈球菌，占比分別為34%、29.8%、12.8%[3]。本試驗結果表明，分離鑒定得到109 株菌株中最主要致病菌是金黃色葡萄球菌（28.44%）、大腸埃希菌（41.28%）。造成不同結果的原因可能是地域、飼養(yǎng)管理等差異導致主要致病菌種類有較大差異。

4.2 奶山羊乳房炎的治療方法

雖然近年來關于奶山羊乳房炎治療方法的探索研究有很多，但現(xiàn)實應用中絕大多數(shù)養(yǎng)殖場還是選擇抗生素治療。20世紀40年代最開始臨床使用的抗生素主要是青霉素和土霉素，這些抗生素可通過注射或口服給藥，但由于奶山羊使用后的乳汁中存在藥物殘留，導致人們對這種方法產(chǎn)生擔憂。后續(xù)新藥研發(fā)和使用新的抗生素如慶大霉素、四環(huán)素、鏈霉素等開始應用于治療奶山羊乳房炎，這些抗生素在乳汁中的殘留時間較短，對奶制品安全更有保障。

隨著抗生素廣泛應用，乳房炎治愈率明顯提高，但抗生素濫用也導致細菌耐藥性問題，其中青霉素、克林霉素和廣譜抗菌類四環(huán)素中的土霉素臨床使用時間較長，幾乎大部分細菌都對土霉素具有不同程度的耐藥性。頭孢菌素類藥物是廣譜抗生素，其中第3、4代頭孢菌素如頭孢噻肟鈉、頭孢曲松鈉等廣泛應用于獸醫(yī)臨床治療，具有較好抗菌效果。氟喹諾酮類抗生素如環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星，尤其是恩諾沙星為廣譜抗菌，且與其他抗菌藥顯現(xiàn)出較小的交叉耐藥性，因此對耐藥性致病菌有特別的治療效果[5]。本試驗中藥敏試驗顯示，該奶山羊養(yǎng)殖場中引起乳房炎的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌對青霉素、克林霉素幾乎完全耐藥，而對氟喹諾酮類抗生素、頭孢菌素類抗生素均較敏感，因此在日常奶山羊乳房炎的治療中可選擇這兩種藥物，但須合理用藥，科學治療，避免細菌耐藥而出現(xiàn)超級細菌。另外，不同地區(qū)養(yǎng)殖場的細菌耐藥程度、種類不同，在治療奶山羊乳房炎之前應進行簡單藥敏試驗，確定其耐藥和敏感的藥物種類，對癥下藥。

4.3 奶山羊乳房炎的預防

奶山羊乳房炎的主要病因是細菌感染，因此最主要的預防措施首先是保證羊圈衛(wèi)生，避免飼養(yǎng)環(huán)境陰暗潮濕和污穢，進而抑制病原菌滋生和繁殖。其次，擠奶操作時，器械和容器都需消毒滅菌，操作要規(guī)范，擠奶操作不當將導致奶山羊乳房組織損傷。最后，要關注奶山羊日常飼養(yǎng)管理，做到科學飼養(yǎng)。飼料搭配均衡，適當添加營養(yǎng)元素，提高奶山羊自身免疫能力。

另外，奶山羊乳房炎存在多種致病菌混合感染，應針對主要致病菌的綜合性預防措施為主。國內(nèi)有不少針對金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌研發(fā)成功的疫苗[4]。針對金黃色葡萄球菌的疫苗可細分兩大類，一類是以全菌減毒滅活疫苗和菌體裂解液為代表的包含所有病原體的疫苗，另一類是以多糖分子為主的病原體亞單位疫苗。一般前者疫苗的免疫效果要優(yōu)于后者，但是后者可降低潛在副作用，因此需根據(jù)特定情況選擇合適疫苗。

5 結論

本試驗結果表明，該養(yǎng)殖場乳房炎細菌性病原主要是金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌，體外藥物敏感性測試結果顯示該養(yǎng)殖場的兩種主要致病菌對喹諾酮類和頭孢菌素類抗生素較敏感，推薦臨床使用治療。