張 婷 閆偉紅 李志勇 田青松 張冬梅 王永剛

（1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010；2 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所，哈爾濱 150086；3 內(nèi)蒙古太仆寺旗紅旗鎮(zhèn)綜合保障和技術(shù)推廣中心，錫林郭勒 026000）

沙蘆草（Agropyronmongolicum），又稱蒙古冰草，為禾本科（Poaceae）冰草屬（AgropyronGaertn）二倍體多年生草本植物，屬于小麥族的野生近緣種[1-2]，是生態(tài)建設(shè)和飼草生產(chǎn)中重要的鄉(xiāng)土牧草，有抗旱、耐風(fēng)沙、耐貧瘠、抗寒和耐鹽堿等優(yōu)良性狀[3-4]，在沙地植被中為優(yōu)勢(shì)種，因而近幾年常被用于圍欄荒漠草原治理[5-6]；沙蘆草廣泛分布于我國(guó)河北、山西、陜西、寧夏、甘肅、內(nèi)蒙古等地區(qū)，尤其在內(nèi)蒙古的分布十分廣泛[1-3]。目前，沙蘆草已被列為國(guó)家二級(jí)珍稀瀕危植物和亟需保護(hù)的農(nóng)作物野生近緣種[7]，但是對(duì)沙蘆草的系統(tǒng)化收集整理及精準(zhǔn)鑒定評(píng)價(jià)工作還比較滯后。

核心種質(zhì)的概念最早是由Frankel 等[8]提出的，是以最少數(shù)量的遺傳資源最大限度地保存整個(gè)資源群體的遺傳多樣性。目前已經(jīng)在許多植物上應(yīng)用，如玉米[9]、桑樹(shù)[10]、野生黃花苜蓿[11]、菠菜[12]等。于秀明等[11]利用70 份新疆野生黃花苜蓿種質(zhì)的19 個(gè)表型性狀構(gòu)建新疆野生黃花苜蓿核心種質(zhì)，鄭福順等[13]基于前期調(diào)查的480 份番茄種質(zhì)資源的20 個(gè)表型性狀數(shù)據(jù)，最終確定了“馬氏距離+抽樣比例為15%+偏離度取樣法+離差平方和法”為番茄核心種質(zhì)最優(yōu)構(gòu)建策略。

表型差異是種質(zhì)篩選的重要依據(jù)。沙蘆草具有極為豐富的遺傳多樣性，遺傳差異主要來(lái)自于居群內(nèi)個(gè)體之間[14-15]，其表型變異類型豐富[16]，同時(shí)沙蘆草種群間、種群內(nèi)表型性狀差異大[17-18]，且生境變化對(duì)表型影響顯著[19-20]。目前，對(duì)沙蘆草的表型多樣性研究有一定的進(jìn)展，而對(duì)沙蘆草基于表型性狀構(gòu)建核心種質(zhì)方面還未有相關(guān)報(bào)道。

綜上所述，為了調(diào)查、收集、保護(hù)沙蘆草核心種質(zhì)資源，本研究收集整理了國(guó)家北方飼草種質(zhì)資源中期庫(kù)庫(kù)存以及在內(nèi)蒙古野外采集的76 份材料，種植于多年生飼草種質(zhì)資源圃，鑒定評(píng)價(jià)表型性狀，篩選初級(jí)核心種質(zhì)，探討構(gòu)建策略，以期為沙蘆草的搜集、評(píng)價(jià)和利用提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材料76 份沙蘆草種質(zhì)資源見(jiàn)表1。供試沙蘆草種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所沙爾沁試驗(yàn)基地，位于40°35′N，111°47′E，海拔1060m，土壤pH 為8.2～9.0，有機(jī)質(zhì)含量0.6%，含碳量0.928%，含氮量0.035%，含磷量0.65%，含硫量0.004%，屬大陸性半干旱氣候，干旱、寒冷、多風(fēng)沙。年極端高溫37.3℃，年極端低溫-32.8℃。無(wú)霜期130d 左右，年平均降水量350mm，土壤類型為沙質(zhì)土。

表1 76 份沙蘆草收集整理名錄

1.2 表型指標(biāo)測(cè)定于沙蘆草抽穗期—完熟期，根據(jù)《沙蘆草種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)76 份沙蘆草的表型，包括小穗長(zhǎng)、小穗寬、小穗含小花數(shù)、穗軸第1 節(jié)間長(zhǎng)、葉鞘長(zhǎng)度、第一穎長(zhǎng)、第一穎寬、第一穎脈數(shù)、第二穎長(zhǎng)、第二穎寬、第二穎脈數(shù)、外稃長(zhǎng)、外稃寬、外稃芒長(zhǎng)、垂直株高、莖粗、倒二葉長(zhǎng)、倒二葉寬、旗葉長(zhǎng)、旗葉寬、旗葉至穗基部長(zhǎng)、穗下第1節(jié)間長(zhǎng)、穗長(zhǎng)、穗寬、小穗數(shù)、葉層高度等26 個(gè)性狀進(jìn)行觀察記錄和數(shù)據(jù)測(cè)定。

1.3 表型多樣性數(shù)量性狀依均值和標(biāo)準(zhǔn)差分級(jí)，進(jìn)行質(zhì)量化處理；各性狀的遺傳多樣性采用Shannon′s 信息指數(shù)（H′）進(jìn)行評(píng)價(jià)，計(jì)算公式為H′=-ΣPilnPi，Pi表示第i種變異出現(xiàn)的頻率，用所有相應(yīng)的各個(gè)性狀H′的平均值表示一組或所有種質(zhì)的遺傳多樣性程度[11]。

1.4 構(gòu)建初級(jí)核心種質(zhì)的策略

1.4.1 構(gòu)建方法篩選以25%取樣比例進(jìn)行構(gòu)建方法的篩選[21]，采用2 種遺傳距離（歐氏距離、馬氏距離）、3 種取樣方法（多次聚類隨機(jī)取樣法、多次聚類偏離度取樣法、多次聚類優(yōu)先取樣法）、8 種系統(tǒng)聚類方法（最短距離法、最長(zhǎng)距離法、中間距離法、重心法、類平均法、可變類平均法、可變法、離差平方和法）共構(gòu)建了48 組核心種質(zhì)候選群體。對(duì)不同的方法進(jìn)行對(duì)比，并根據(jù)均值差異百分率（MD）、方差差異百分率（VD）、極差符合率（CR）和變異系數(shù)變化率（VR）4 個(gè)參數(shù)檢驗(yàn)各取樣策略的優(yōu)劣[9-10]，選出最佳取樣和聚類方法。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為MD＜20%且CR＞80%時(shí)，初級(jí)核心種質(zhì)的代表性較好，MD 值越小且CR、VD 和VR 值越大，初級(jí)核心種質(zhì)的代表性越強(qiáng)[22]。

1.4.2 總體取樣比例的篩選基于最佳取樣和聚類方法，分別按照10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%共7 種取樣比例構(gòu)建出7 個(gè)核心種質(zhì)，通過(guò)比較各核心種質(zhì)與原種質(zhì)的評(píng)價(jià)參數(shù)來(lái)確定最佳的取樣比例[23]。

1.5 初級(jí)核心種質(zhì)評(píng)價(jià)及驗(yàn)證對(duì)已構(gòu)建完成的沙蘆草初級(jí)核心種質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)原群體和核心種質(zhì)表型性狀均值間是否有顯著性差異進(jìn)行檢驗(yàn)，利用方差F 檢驗(yàn)分析兩者表型性狀變異的同質(zhì)性，并基于主成分分析對(duì)最優(yōu)核心種質(zhì)的有效性進(jìn)行驗(yàn)證[24]。

1.6 數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010 軟件分析處理各個(gè)性狀的平均值、極值、變異系數(shù)及多樣性指數(shù)；用QGAstation 2.0 軟件進(jìn)行核心種質(zhì)相關(guān)數(shù)據(jù)的處理與分析；利用SPSS 26.0 進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型多樣性分析76 份沙蘆草種質(zhì)的表型性狀（表2）變異系數(shù)在10.30%～62.91%之間，其中第二穎長(zhǎng)的變異系數(shù)最小，為10.30%；外稃芒長(zhǎng)最大，為62.91%。遺傳多樣性指數(shù)（H′）在1.790～2.080之間，平均遺傳多樣性指數(shù)為1.997，其中穗軸第1節(jié)間長(zhǎng)的H′最小，為1.790；旗葉長(zhǎng)的H′最大，為2.080。分析結(jié)果顯示，76 份材料具有豐富的表型形態(tài)，有利于特異種質(zhì)的篩選和核心種質(zhì)的抽提。

表2 不同沙蘆草種質(zhì)材料表型性狀基本統(tǒng)計(jì)分析

2.2 核心種質(zhì)構(gòu)建方案篩選

2.2.1 取樣方法的篩選在25%的取樣比例中，多次聚類偏離度取樣法構(gòu)建的16 個(gè)核心種質(zhì)方差差異百分率（VD）均大于3.85%，極差符合率（CR）均大于88%，變異系數(shù)變化率（VR）均大于114%（表3）。多次聚類隨機(jī)取樣法構(gòu)建的16 個(gè)核心種質(zhì)方差差異百分率（VD）均小于7.69%，極差符合率（CR）均小于90.85%，變異系數(shù)變化率（VR）均小于116.37%。多次聚類優(yōu)先取樣法構(gòu)建的16 個(gè)核心種質(zhì)效果最差，其參數(shù)除極個(gè)別外都小于多次聚類偏離度取樣法。同時(shí)采用同一遺傳距離和聚類方法時(shí)，多次聚類偏離度取樣法構(gòu)建的核心種質(zhì)大多具有更高的方差差異百分率（VD）、變異系數(shù)變化率（VR）。因此，多次聚類偏離度取樣法更適合構(gòu)建沙蘆草核心種質(zhì)。這與番茄[13]、灰楸[25]、高粱[26]等核心種質(zhì)構(gòu)建效果最好的研究結(jié)果相吻合。

表3 不同構(gòu)建策略的比較

2.2.2 遺傳距離的篩選根據(jù)表3 結(jié)果，在多次聚類偏離度取樣法下，歐式距離和馬氏距離構(gòu)建的核心種質(zhì)均值差異百分率（MD）均小于20%，且在歐式距離下的核心種質(zhì)D-D1C4、D-D1C6、D-D1C7 和馬氏距離下的核心種質(zhì)D-D2C1、D-D2C8 都具有最大的方差差異百分率（VD）19.23%，但核心種質(zhì)D-D1C6 具有較大的變異系數(shù)變化率（VR）121.58%。此外，歐式距離構(gòu)建的3種核心種質(zhì)變異系數(shù)變化率（VR）在多次聚類隨機(jī)取樣法和多次聚類偏離度取樣法下大多數(shù)表現(xiàn)為歐式距離大于馬氏距離，即S-D1、D-D1 大于S-D2、D-D2。因此，歐式距離略優(yōu)于馬氏距離，更適合構(gòu)建沙蘆草核心種質(zhì)。這進(jìn)一步驗(yàn)證了標(biāo)準(zhǔn)化歐氏距離更適于處理含有較多不同類型性狀的種質(zhì)資源群體的觀點(diǎn)[12，25-26]。

2.2.3 聚類方法的篩選在歐式距離下，采用多次聚類偏離度取樣法時(shí)，可變類平均法（C6）和可變法（C7）構(gòu)建的核心種質(zhì)具有最大的方差差異百分率（19.23%），其中可變類平均法（C6）擁有較大的變異系數(shù)變化率（VR）121.58%，因此可變類平均法略優(yōu)（表3）。故在25%的取樣比例下，“多次聚類偏離度取樣法+歐式距離+可變類平均法”是構(gòu)建沙蘆草核心種質(zhì)的最佳組合。

2.2.4 總體取樣比例的確定采用篩選出的最佳核心種質(zhì)構(gòu)建策略，即以多次聚類偏離度取樣法、歐氏距離和可變類平均法，按照7 個(gè)不同的取樣比例，即10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%構(gòu)建7 個(gè)初級(jí)核心種質(zhì)子集（表4）。從表中可以看出，7 個(gè)核心子集中，核心種質(zhì)取樣比例在10%時(shí)，極差符合率（CR）小于80%，不符合Hu 等[21]核心種質(zhì)構(gòu)建要求，應(yīng)予以排除；其他6 個(gè)核心種質(zhì)極差符合率（CR）均大于80%，在取樣比例為25%和30%時(shí)，其方差差異百分率（VD）最大（19.23%），但取樣比例為25%時(shí)，其變異系數(shù)變化率（VR）更大（121.58%），核心種質(zhì)能在一定程度上去除原種質(zhì)的遺傳冗余，并且較好地保持原種質(zhì)的遺傳變異。

表4 7 種取樣比例構(gòu)建的核心種質(zhì)評(píng)價(jià)參數(shù)比較

因此，選擇“多次聚類偏離度取樣法+歐式距離+可變類平均法+25%的取樣比例”的策略構(gòu)建沙蘆草核心種質(zhì)。

2.3 核心種質(zhì)評(píng)價(jià)利用均值、表型方差、極差、變異系數(shù)等評(píng)價(jià)核心種質(zhì)是否具有代表性（表5）。根據(jù)表4 與表5 的結(jié)果，在D-D1C6-25%標(biāo)準(zhǔn)下構(gòu)建的核心種質(zhì)，其均值差異百分率（MD）為0 且各性狀均不存在顯著差異；各性狀的極差符合率（CR）為91.81%，表明核心種質(zhì)保留了原始群體中的特殊種質(zhì)；各性狀指標(biāo)的變異系數(shù)變化率（VR）為121.58%，變異系數(shù)整體上高于原始群體，表明核心種質(zhì)具有良好的異質(zhì)性；各項(xiàng)指標(biāo)方差差異百分率（VD）為19.23%，小穗寬、垂直株高、旗葉至穗基部長(zhǎng)、穗下第1 節(jié)間長(zhǎng)等4 個(gè)性狀的方差顯著高于原始群體，葉層高度和穗軸第1 節(jié)間長(zhǎng)的方差極顯著高于原始群體，表明核心種質(zhì)差異可以代表原始群體的變異。

表5 核心種質(zhì)與原始種質(zhì)各性狀評(píng)價(jià)參數(shù)和t 檢驗(yàn)、F 檢驗(yàn)

2.4 核心種質(zhì)驗(yàn)證如表6 所示，利用主成分分析對(duì)獲得的19 份沙蘆草核心種質(zhì)資源（表7）與原種質(zhì)資源進(jìn)行比較分析，二者均有7 個(gè)主成分特征值大于1，包含各性狀84%以上的遺傳多樣性信息，并且核心種質(zhì)累計(jì)貢獻(xiàn)率比原始種質(zhì)累計(jì)貢獻(xiàn)率高，也證明所構(gòu)建的核心種質(zhì)資源代表性和可靠性較高。

表6 原種質(zhì)資源與核心種質(zhì)資源表型性狀主成分比較

表7 19 份沙蘆草初級(jí)核心種質(zhì)

3 結(jié)論與討論

種質(zhì)資源是品種選育的物質(zhì)基礎(chǔ)，優(yōu)良核心種質(zhì)的獲得是品種培育的芯片。沙蘆草在生態(tài)防治上起著重要的作用，但是在核心種質(zhì)構(gòu)建方面的研究尚無(wú)。本研究基于26 個(gè)表型性狀進(jìn)行了構(gòu)建76 份沙蘆草初級(jí)核心種質(zhì)的探討，為今后沙蘆草收集和新種質(zhì)創(chuàng)新提供基礎(chǔ)材料和理論依據(jù)。

目前最為常用的遺傳距離為馬氏距離和歐式距離。已有研究表明馬氏距離并不適用于小規(guī)模核心種質(zhì)構(gòu)建[27]。本研究通過(guò)對(duì)比兩種遺傳距離，發(fā)現(xiàn)歐氏距離更適于構(gòu)建沙蘆草核心種質(zhì)。這與菠菜[12]、灰楸[25]、切花小菊[28]等植物的研究結(jié)果相似。取樣方法一直是核心種質(zhì)研究的重點(diǎn)。目前，基于表型構(gòu)建核心種質(zhì)常用的取樣方法有多次聚類隨機(jī)取樣法、多次聚類偏離度取樣法和多次聚類優(yōu)先取樣法3 種[29-31]。于秀明等[11]研究表明優(yōu)先取樣法是構(gòu)建野生黃花苜蓿核心種質(zhì)的最佳取樣方法；鄭福順等[13]研究結(jié)果表明偏離度取樣法是構(gòu)建番茄核心種質(zhì)效果最佳的取樣方法。本研究在對(duì)比3 種取樣方法后，最終確定多次聚類偏離度取樣法為沙蘆草最佳取樣方法。

不同的聚類方法將植物分為不同的組，進(jìn)而影響核心種質(zhì)的代表性。目前基于表型構(gòu)建核心種質(zhì)常用的聚類方法有8 種，分別為最短距離法、最長(zhǎng)距離法、中間距離法、重心法、類平均法、可變類平均法、可變法和離差平方和法。彭?xiàng)鞯萚12]的研究表明離差平方和法構(gòu)建效果優(yōu)于其他7 種；孫永強(qiáng)等[32]研究結(jié)果表明，最長(zhǎng)距離法對(duì)構(gòu)建西伯利亞杏核心種質(zhì)效果最佳。在本研究中，比較了8 種聚類方法的構(gòu)建效果，發(fā)現(xiàn)可變類平均法構(gòu)建沙蘆草核心種質(zhì)效果最好。

主成分分析可以近似地描述樣品在幾何空間的分布特征，更好反映其遺傳結(jié)構(gòu)，更形象地用來(lái)比較核心種質(zhì)和原種質(zhì)的分布特征[33]。本研究通過(guò)比較核心種質(zhì)和原始種質(zhì)的主成分結(jié)果，發(fā)現(xiàn)二者均有7 個(gè)主成分特征值大于1，且核心種質(zhì)累計(jì)貢獻(xiàn)率比原始種質(zhì)累計(jì)貢獻(xiàn)率高，表明核心種質(zhì)的建立在一定程度上去除了原始種質(zhì)中的遺傳冗余，進(jìn)一步確認(rèn)了在25%的取樣比例下，采用歐式距離和可變類平均法并結(jié)合多次聚類偏離度取樣法是沙蘆草核心種質(zhì)的最佳構(gòu)建策略。

本研究利用26 個(gè)表型性狀數(shù)據(jù)對(duì)76 份沙蘆草核心種質(zhì)進(jìn)行構(gòu)建時(shí)，明確了以歐氏距離、可變類平均法和25%的取樣規(guī)模結(jié)合多次聚類偏離度取樣是構(gòu)建沙蘆草核心種質(zhì)的最適方法，以其進(jìn)行篩選最終得到19 份核心種質(zhì)，這些核心種質(zhì)的各項(xiàng)評(píng)價(jià)參數(shù)優(yōu)良，能夠代表原始種質(zhì)的遺傳差異，并且很好地去除原種質(zhì)的遺傳冗余，可以作為后續(xù)沙蘆草種質(zhì)資源研究的材料。