范行程,葛俊杰,謝 越,2,任蘭天,紀文超,2,范行軍,2①,王 翔,2

(1.安徽科技學院資源與環(huán)境學院,安徽 鳳陽 233100;2.生物炭與農(nóng)田土壤污染防治安徽省重點實驗室,安徽 蚌埠 233400;3.安徽科技學院農(nóng)學院,安徽 鳳陽 233100)

污水農(nóng)灌和農(nóng)藥等不合理使用引發(fā)土壤重金屬污染不斷加重[1]。銅(Cu)作為我國土壤中最主要的環(huán)境污染元素,其點位超標率高達2.1%,因此對Cu污染土壤的修復迫在眉睫[2-3]。堆肥是實現(xiàn)農(nóng)牧業(yè)有機固體廢棄物無害化和資源化最主要的技術(shù)手段之一,而且堆肥作為有效的吸附材料還可用以修復和改良重金屬污染土壤[4]。

溶解性有機質(zhì)(DOM)是堆肥過程中最活躍的有機成分[5]。DOM中含有大量的活性基團,如酚羥基、羧基、氨基等,能與重金屬產(chǎn)生顯著的絡合作用[6],影響其在土壤中的遷移、轉(zhuǎn)化及毒性[7-9]。大量研究表明,DOM是一類具有復雜熒光特征的有機混合物。隨著三維熒光光譜平行因子解析(EEM-PARAFAC)的廣泛應用,研究人員發(fā)現(xiàn)堆肥DOM主要由類腐殖質(zhì)和類蛋白質(zhì)組成。楊超等[10]利用EEM-PARAFAC解析出雞糞好氧堆肥中DOM的熒光物質(zhì)組成,包括3類類腐殖質(zhì)組分和1類類蛋白質(zhì)組分。DOM在與重金屬發(fā)生絡合作用時,其熒光強度會發(fā)生一定的猝滅現(xiàn)象[11]。熒光猝滅技術(shù)已成為研究DOM與重金屬作用的重要方法。ZHU等[12]研究了Cu2+、Pb2+和Cd2+與畜禽糞便秸稈堆肥DOM的分子作用,結(jié)果顯示金屬離子均能引起DOM的熒光猝滅,證實DOM與金屬離子發(fā)生有機配合作用。二維相關(guān)光譜(2DCOS)可以識別金屬濃度變化等擾動因素引起的細微光譜變化,進而能從DOM中金屬絡合活性位點、絡合強度和反應順序等方面揭示DOM的絡合機制。目前,2DCOS結(jié)合熒光光譜技術(shù)已廣泛應用于堆肥DOM與重金屬絡合反應的研究中[13-14]。GUO等[15]發(fā)現(xiàn),城市固體廢物堆肥DOM中類蛋白質(zhì)組分優(yōu)先于類腐殖質(zhì)組分與Cu2+發(fā)生結(jié)合反應。不同類型堆肥中DOM往往具有不同的化學組成和分子結(jié)構(gòu),從而會直接影響其與重金屬的絡合特征(如位點、官能團、能力等)[12]。當前,關(guān)于堆肥DOM與重金屬的絡合機制研究主要集中在畜禽糞便和市政污泥等堆肥基質(zhì)上[12,15]。為拓展對堆肥-重金屬相互作用特征的認識,開展不同類型堆肥DOM與重金屬的絡合機制研究非常有必要。

我國作為食用菌生產(chǎn)以及農(nóng)業(yè)大國,菌渣和秸稈產(chǎn)生量巨大[16-18]。堆肥是實現(xiàn)菌渣和秸稈廢棄物資源化利用重要的途徑之一。研究以蘑菇渣堆肥(MRC)和水稻秸稈堆肥(RSC)為對象,基于Cu2+滴定實驗,采用同步熒光光譜(SFS)和三維熒光光譜(EEM)2類光譜技術(shù),結(jié)合平行因子分析(PARAFAC)和2DCOS等光譜解析方法[5,19],研究堆肥DOM與Cu2+的絡合反應機制。采用Stern-Volmer數(shù)據(jù)模型推算Cu2+的熒光復合體比例(f)和絡合條件穩(wěn)定性常數(shù)(lgK),以探究堆肥DOM中不同活性位點的絡合強度。研究結(jié)果可為菌渣和秸稈堆肥用于重金屬污染土壤改良和修復提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 堆肥樣品采集與DOM提取

試驗蘑菇渣(MR)采集自安徽某菌業(yè)科技有限公司,水稻秸稈(RS)采集自安徽科技學院農(nóng)場,牛糞采集自鳳陽某養(yǎng)牛場[20]。堆肥原始物料分別按照干基比MR和牛糞質(zhì)量比(1∶2)、RS和牛糞質(zhì)量比(1∶1)進行戶外好氧堆肥,原料的主要理化性質(zhì)見表1。

表1 堆肥原料的基本理化性質(zhì)

RS堆置之前需切成8～10 cm的碎料。每1 t堆肥物料添加2 kg的腐熟劑〔安徽萊姆佳生物科技股份有限公司,有效活菌數(shù)(cfu) ≥ 108g-1,纖維素酶活 ≥ 30 U·g-1,淀粉酶活 ≥ 10 U·g-1〕。在堆肥第35天,各堆體溫度穩(wěn)定在環(huán)境溫度,發(fā)芽指數(shù)均在80%以上,堆肥基本腐熟,并繼續(xù)翻堆進行2次發(fā)酵。在堆肥50 d后從堆體頂部、中間和底部收集3份樣品,充分混勻后得到2種堆肥樣品。

對堆肥樣品依次進行冷凍干燥、機器粉碎,過0.15 mm孔徑篩后,保存于干燥陰涼處備用。將凍干研磨后的蘑菇渣堆肥(MRC)和秸稈堆肥(RSC)樣品與超純水以固液比(m∶V=1∶10)混合。以200 r·min-1往復振蕩24 h,然后在5 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心20 min(半徑125 mm),上清液過聚四氟乙烯(PTFE)濾膜(Φ=0.45 μm)后得到DOM母液,于4 ℃條件下保存?zhèn)溆肹21-22]。采用島津TOC分析儀(TOC-VCPN,日本)測定水溶性有機碳(DOC)濃度。

1.2 Cu2+滴定實驗

為避免內(nèi)濾效應的影響,在Cu2+滴定實驗前需將DOM溶液稀釋至10 mg·L-1(以DOC計)。滴定前后利用0.1 mol·L-1的NaOH和HNO3溶液對滴定體系的pH值進行控制(pH=6.0)。為降低溶液濃度稀釋效應對實驗的影響,添加的酸堿試劑不得超過50 μL。準備多個濃度梯度的Cu2+水溶液(0～100 mmol·L-1),依次滴加至20 μL～20 mL的DOM溶液中,使對應體系中的Cu2+濃度為0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μmol· L-1。滴定實驗重復3次,滴定后的樣品避光振蕩24 h后分別進行紫外-可見光、同步熒光和三維熒光光譜分析。

1.3 光譜分析

采用熒光光譜分析儀(F-4600,Hitachi,日本)測定同步熒光(SFS)和三維熒光(EEM)光譜,其中SFS光譜的發(fā)射波長(Em)掃描范圍為250～500 nm,激發(fā)波長差(Δλ)為5 nm,掃描速度為1 200 nm·min-1。EEM的激發(fā)波長(Ex)和發(fā)射波長(Em)范圍分別設(shè)置為200～400和290～520 nm,Ex和Em的狹縫寬度均為5 nm,掃描速度為12 000 nm·min-1。熒光光譜均以Milli-Q超純水作為空白對照進行背景扣除。

1.4 數(shù)據(jù)解析

1.4.1EEM-PARAFAC

采用Matlab 2014a中的DOM Fluor工具包(www.models.life.ku.dk)對系列DOM-Cu2+滴定樣品(72個)的EEM進行平行因子(PARAFAC)分析,具體方法參照文獻[23]。經(jīng)過2～7個組分的模型擬合,通過分半法、殘差分析法和核心一致性比較,確定最優(yōu)組分為3個,并得到各組分的最大熒光強度(Fmax)用以半定量分析。

1.4.2Stern-Volmer絡合模型

絡合模型采用改進后的Stern-Volmer絡合模型[24-25],公式為

(1)

式(1)中,F0和F分別為未添加和添加Cu2+時的PARAFAC組分熒光強度;C為滴定后體系中的Cu2+濃度,μmol·L-1;K為有效猝滅常數(shù);f為能與Cu2+結(jié)合的熒光基團的百分數(shù)。研究采用lgK估算DOM中不同熒光組分與Cu2+的絡合能力,采用f評估熒光組分中與Cu2+絡合的熒光團比例。

1.4.32DCOS分析

采用Kwansei-Gakuin大學開發(fā)的2D-Shige軟件對DOM-Cu2+的系列SFS進行2DCOS分析,具體分析和解譜方法參照文獻[26-28]。研究以Cu2+濃度為擾動因子,探究堆肥DOM中分子組成與Cu2+的相互作用機制。

2 結(jié)果與討論

2.1 同步熒光光譜

Cu2+滴定過程中MR-DOM和RS-DOM同步熒光光譜變化如圖1所示。SFS主要由3類熒光區(qū)域構(gòu)成,包括類蛋白質(zhì)(250～300 nm)、類富里酸(300～380 nm)和類腐殖酸(380～500 nm)[27-28]?？梢钥闯?MRC-DOM和RSC-DOM均在275和345 nm處呈現(xiàn)明顯的特征峰,表明2種堆肥均以類蛋白和類富里酸組成為主。該結(jié)果與ISLAM等[29]研究得到的城市污水DOM的光譜演化特征一致。隨著Cu2+濃度增加,類蛋白和類富里酸熒光強度均明顯減弱。與未添加Cu2+體系相對照,在100 μmol·L-1的Cu2+體系中,MRC-DOM和RSC-DOM在275 nm處的熒光強度分別降低了69%和70%,而在345 nm處的熒光強度則分別降低了66%和62%。結(jié)果表明,2種堆肥DOM均可與Cu2+發(fā)生顯著的絡合作用,且DOM中類蛋白質(zhì)熒光組分與Cu2+作用更為強烈。該結(jié)果與GUO等[15]研究市政污泥堆肥DOM與Cu2+和Pb2+的作用結(jié)果一致。此外,MRC-DOM在345 nm處的猝滅強度(66%)要高于RSC-DOM(62%),表明前者類富里酸組分與Cu2+的絡合作用更強。

圖1 Cu2+滴定過程中MRC-DOM和RSC-DOM的同步熒光光譜變化

2.2 堆肥DOM中熒光物質(zhì)與Cu2+的絡合特征

為探討Cu2+滴定過程中堆肥DOM的結(jié)構(gòu)和組成變化特性,利用EEM-PARAFAC對DOM-Cu2+絡合體系的熒光成分進行解析。圖2顯示的是EEM-PARAFAC解析出的3類熒光成分的EEM譜。根據(jù)文獻[30-32],組分C1〔Ex/Em=265(365)/470 nm〕歸屬為類腐殖酸,組分C2〔Ex/Em=230(340)/410 nm〕歸屬為類富里酸,C3〔Ex/Em=225(275)/335 nm〕歸屬為類蛋白質(zhì),表明MRC-和RSC- DOM主要由類腐殖酸、類富里酸和類蛋白質(zhì)組成。該結(jié)果與前期報道的豬糞、雞糞、牛糞等堆肥DOM的熒光物質(zhì)組成類似[12,33-34]。

圖2 堆肥DOM的3個熒光組分

如圖3所示,MRC-DOM和RSC-DOM中最主要成分為類腐殖酸(C1),相對含量分別為43%和39%。ZHU等[12]研究同樣指出,牛糞和豬糞堆肥DOM也以類腐殖酸組成為主(33.7%～41.6%)。結(jié)果表明堆肥DOM腐殖化程度較高,含有豐富的高分子腐殖質(zhì)[12, 33-34]。類富里酸(C2)和類蛋白質(zhì)(C3)熒光成分在MRC-DOM和RSC-DOM中的占比存在明顯差異,其中C2的相對含量分別為32%和29%,C3的相對含量分別為25%和32%。盡管MRC-DOM和RSC-DOM具有不同的熒光組成,在Cu2+滴定過程中卻呈現(xiàn)類似的熒光猝滅特征。如圖3所示,相較于未添加Cu2+的處理,100 μmol·L-1的Cu2+滴定體系中,MRC-DOM中C1、C2和C3的最大熒光強度(Fmax)分別降低了75%、63%和74%,RSC-DOM中分別降低了73%、62%和69%。結(jié)果表明,2種堆肥DOM中類腐殖質(zhì)(C1和C2)和類蛋白(C3)熒光組分均與Cu2+發(fā)生顯著的絡合作用,但是C1、C3與Cu2+的結(jié)合能力均較C2結(jié)合能力強,這與前期報道的畜禽糞便、市政污泥等堆肥DOM中類腐殖酸或類蛋白質(zhì)能與Cu2+發(fā)生顯著絡合作用的結(jié)果一致[15,33]。另一方面,MRC-DOM和RSC-DOM與Cu2+發(fā)生作用后不同熒光組分的猝滅比例幾乎一致,表明2種堆肥DOM與Cu2+的絡合機制類似。

圖3 Cu2+滴定MRC-DOM和RSC-DOM的熒光猝滅曲線

根據(jù)修正的Stern-Volmer數(shù)學模型對DOM與Cu2+絡合作用進行擬合,擬合曲線如圖4所示,擬合得到的lgK和f如表2所示。MRC-DOM和RSC-DOM中不同熒光組分(C1～C3)與Cu2+的有效猝滅常數(shù)(lgK)在4.54～4.76之間,結(jié)合熒光團比例(f)分布在0.81～0.98之間。由此可知,2種堆肥DOM與Cu2+具有強烈的絡合作用,這與HUANG等[8]研究的秸稈雞糞混合堆肥DOM與Cu2+結(jié)合的猝滅常數(shù)相近。相對而言,不同熒光組分的lgK和f也存在差異。

圖4 修正的Stern-Volmer模型對MRC-DOM和RSC-DOM與Cu2+絡合擬合曲線

表2 堆肥DOM中熒光物質(zhì)與Cu2+絡合參數(shù)

由表2可知,MRC-DOM和RSC-DOM中類蛋白質(zhì)組分(C3)的lgK值均高于類腐殖質(zhì)組分(C1和C2),表明2種堆肥DOM中類蛋白質(zhì)組分與Cu2+結(jié)合親和力較強,這與ZHAO等[35]研究城市雨水徑流DOM中類蛋白質(zhì)組分表現(xiàn)出較強結(jié)合能力的結(jié)果一致。雖然堆肥DOM熒光組分與Cu2+產(chǎn)生的配合物具有相似的穩(wěn)定性,但是相應的配體比例是不同的。MRC-DOM和RSC-DOM熒光基團比例的差異性與不同原料配比的堆肥DOM中熒光組分所含的官能團種類和熒光強度有關(guān)[15,33]。對于2種堆肥DOM,C1和C3的f值均略高于C2,表明類腐殖酸和類蛋白質(zhì)較類富里酸具有更多的有機配體[32,35]。其次,RSC-DOM中C1和C2的f值均略高于MRC-DOM,說明RSC中類腐殖酸熒光組分含有較多的金屬結(jié)合基團;MRC-DOM中C3的f值明顯高于RSC-DOM,表明MRC中類蛋白組分含有較多的金屬結(jié)合基團。

2.3 堆肥DOM與Cu2+絡合的2DCOS分析

不同Cu2+濃度滴定下,MRC-DOM和RSC-DOM與Cu2+絡合的同步熒光光譜的二維相關(guān)同步和異步譜圖見圖5?？梢钥闯?MRC-DOM和RSC-DOM的二維同步譜圖中均顯示出2個明顯的自相關(guān)峰,分別位于275和350 nm左右處〔圖5(a)(b)〕,表明堆肥DOM中類蛋白和類富里酸熒光組分與Cu2+發(fā)生了明顯的絡合作用。相對而言,275 nm左右處自相關(guān)峰峰強顯著高于350 nm左右處的峰強,表明堆肥DOM中類蛋白組分對體系中Cu2+濃度的變化更為敏感。GUO等[15]通過2DCOS研究市政污泥堆肥DOM與Cu2+作用時同樣發(fā)現(xiàn),位于273 nm處的類蛋白熒光基團較342～370 nm處的類富里酸熒光基團敏感。此外,同步譜中交叉峰(275/350 nm處)顯示為正峰,表明類蛋白和類腐殖酸與Cu2+作用方向相同,且隨Cu2+濃度的增加而降低,表現(xiàn)為類似的熒光猝滅特征。

圖 5 MRC-和RSC-DOM與Cu2+絡合的二維相關(guān)同步和異步譜圖

二維異步譜可有效揭示堆肥DOM與Cu2+絡合過程中參與反應的主要位點及其反應順序。MRC-DOM和RSC-DOM呈現(xiàn)出相似的二維異步譜,具有相同的交叉峰(圖5),說明2種DOM與Cu2+的絡合機制相似。研究針對異步譜對角線右下方交叉峰展開說明。圖5(c)(d)對角線右下方主要顯示出3類交叉峰,分別為275/350、300/275和350/300 nm,符號分別為-、+和-,表明堆肥DOM中含有多種活性位點參與Cu2+的絡合反應。前期已有研究發(fā)現(xiàn),市政污泥堆肥[15]、雞糞厭氧發(fā)酵[36]DOM中也存在類似的重金屬(Cu2+、Pb2+、Zn2+)絡合活性位點。此外,根據(jù)NODA規(guī)則[8,15],MRC-DOM和RSC-DOM中不同熒光活性位點與Cu2+的結(jié)合順序為300 nm→350 nm→275 nm,表明Cu2+與DOM各組分結(jié)合的順序為短波類富里酸→長波類富里酸→類蛋白質(zhì)。由此可見,MRC-DOM和RSC-DOM中類富里酸優(yōu)先與Cu2+發(fā)生絡合作用,該結(jié)果與雞糞厭氧發(fā)酵DOM中類富里酸與Cu2+優(yōu)先反應結(jié)果一致,但是與市政污泥堆肥DOM中類蛋白組分與Cu2+優(yōu)先作用的結(jié)果相反[15]。這些結(jié)果間接表明不同類型堆肥DOM可能存在相同的重金屬結(jié)合位點,但是作用機制可能存在差異。

3 結(jié)論

(1)MRC-DOM和RSC-DOM主要由類腐殖酸(C1)、類富里酸(C2)和類蛋白質(zhì)(C3)3類熒光物質(zhì)組成,其中類腐殖酸是最重要成分(39%～43%),類富里酸(29%～32%)和類蛋白質(zhì)(25%～32%)含量相當。相對而言,MRC-DOM含有更多的類腐殖質(zhì),較少的類蛋白組分。

(2)隨著Cu2+濃度的增加,2種類型堆肥DOM的C1、C2、C3的熒光強度均呈現(xiàn)不斷猝滅的趨勢,表明DOM中的類腐殖質(zhì)(C1和C2)和類蛋白質(zhì)(C3)均能與Cu2+發(fā)生絡合作用。其中,類蛋白質(zhì)(C3)與Cu2+的絡合能力(lgK)均高于類腐殖質(zhì)(C1和C2)。

(3)MRC-DOM和RSC-DOM中均含有多個金屬絡合活性熒光基團,且不同活性位點與Cu2+的結(jié)合機制類似,均表現(xiàn)為類蛋白組分(275 nm左右處)對Cu2+結(jié)合能力強,但類富里酸組分(300和350 nm左右處)能夠優(yōu)先與Cu2+發(fā)生絡合作用。