宋培勇，張 容，漆楊菊，胡 蓉，王雙雙，曾 鋼

（1.遵義師范學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，貴州 遵義 563006；2.遵義市第八中學(xué)，貴州 遵義 563099）

酵母菌是單細(xì)胞真核微生物，能發(fā)酵糖類產(chǎn)能，故有“糖菌”之稱，以出芽生殖為主，細(xì)胞壁含葡聚糖和甘露聚糖，常常分布在含糖量較高的酸性環(huán)境中。人類與酵母菌關(guān)系久遠(yuǎn)而密切，如白酒的釀造、面包的制作、B 族維生素和單細(xì)胞蛋白（SCP）的生產(chǎn)、石油脫蠟、美容抗衰、疫苗生產(chǎn)等。酵母菌除了上述諸多用途外，在生物保鮮方面，酵母作為主要的生物拮抗菌，因不產(chǎn)生毒素、遺傳穩(wěn)定、生長繁殖能力強(qiáng)、可與化學(xué)拮抗劑配合使用等特點(diǎn)而成為研究熱點(diǎn)[1,2]。目前，運(yùn)用到果蔬采后病害防治中的拮抗酵母菌約有20 多種，如季也蒙畢赤酵母、羅倫隱球酵母、假絲酵母、隱球酵母、紅酵母、季氏假絲酵母、畢赤酵母、檸檬形克勒克酵母等[3]。應(yīng)用生物拮抗菌對果蔬采后病害進(jìn)行生物防治是目前最有希望替代化學(xué)殺菌劑的一種新型保鮮技術(shù)[4]。在人類基因組計劃的推動下，1996 年釀酒酵母全基因組測序完成[5]；2018 年中、美科學(xué)家更是利用基因編輯技術(shù)各自人工合成了僅有1 條和2 條染色體的釀酒酵母[6,7]。這些研究極大地推動了酵母菌基因組學(xué)和后基因組學(xué)的發(fā)展，也為未來通過基因工程改造現(xiàn)有拮抗酵母菌，并最終獲得高效廣譜拮抗酵母菌株提供了可能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料：酵母菌XRL-1、XRL-2 和XRL-3，為本實(shí)驗(yàn)室從貴州省鳳岡縣仙人嶺采集的水果梨、李和葡萄中分離、純化并保存。用于測試生物保鮮效果的水果棗和提子從當(dāng)?shù)厥袌鲑徺I，山桃從遵義師范學(xué)院校園中采集。

1.1.2 主要儀器：E200F 型生物數(shù)碼顯微鏡（尼康）、Mastercycler nexus gradient 梯度PCR 儀（Eppendorf）、超低溫冰箱（BioRad）、PHS-25 型數(shù)顯PH 計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）、DYY-6C電泳儀（北京六一）。

1.1.3 主要藥品及試劑：PCR引物NL1：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′和NL4：5′-GGTC CGTGTTTCAAGACGG-3′（上海生工），100 bp DNA Ladde（r北京天根），Taq PCR Mix(2×（)上海生工）。

1.1.4 主要培養(yǎng)基：YEPD 培養(yǎng)基、麥?zhǔn)希∕eClary）培養(yǎng)基、碳源同化基礎(chǔ)培養(yǎng)基和氮源同化基礎(chǔ)培養(yǎng)基，參考相關(guān)文獻(xiàn)[8～10]進(jìn)行配制。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌形態(tài)特征的觀察

（1）菌落形態(tài)：將斜面保存的XRL-1、XRL-2 和XRL-3，無菌操作轉(zhuǎn)接到Y(jié)EPD 平板上，28 ℃培養(yǎng)3 d-5 d，觀察菌落大小、顏色等形態(tài)特征。

（2）細(xì)胞形態(tài)：用接種環(huán)挑取少許酵母菌于滴有無菌水的載玻片上，涂勻，加蓋玻片，在微分干涉顯微鏡下觀察，并拍照記錄。

（3）子囊孢子：無菌操作將酵母菌轉(zhuǎn)接到麥?zhǔn)檄傊囵B(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h 后，挑取少許酵母菌于滴有生理鹽水的載玻片上，混勻，火焰上方固定，自然風(fēng)干，以孔雀綠-番紅染色法染色后，在普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡或微分干涉顯微鏡下觀察，拍照并記錄結(jié)果。

1.2.3 生理生化特性

（1）碳源同化/糖發(fā)酵試驗(yàn)。液體培養(yǎng)基的配制：蛋白胨1 g、氯化鈉0.5 g、糖（淀粉/乳糖/葡萄糖/蔗糖）1 g、蒸餾水100 mL，pH7.6，113 ℃滅菌30 min。在超凈工作臺中制作酵母菌懸液，以移液槍接種1 mL 酵母菌懸液于含不同碳源的蛋白胨培養(yǎng)液試管中（內(nèi)有倒置德漢氏小管），每種碳源各設(shè)3 管，另加有各種碳源的培養(yǎng)液各設(shè)一不接菌種的試管作為對照組，每一試管中滴入2～3 滴1.6%溴甲酚紫乙醇溶液指示劑，用PHS-25 型數(shù)顯pH 酸堿計測量后，以1% NaOH 調(diào)pH 至7.6，并做好標(biāo)記，28 ℃培養(yǎng)2～3天。試管中顏色為紫色不產(chǎn)酸，黃色則產(chǎn)酸；德漢氏小管中有氣泡則證明能產(chǎn)氣，反之則不能。

（2）氮源同化試驗(yàn)。配制氮源同化培養(yǎng)基：硫酸銨0.198 g/尿素0.090 g/蛋白胨3 g/硝酸鈉0.127 g，葡萄糖10 g，磷酸二氫鉀0.2 g，七水合硫酸鎂0.2 g，蒸餾水1000 mL，氯化鈉0.2 g，碳酸鈣5 g，瓊脂15～20 g，調(diào)節(jié)至pH7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min，將菌株接種于平板上，每種菌接3 個平板，28℃培養(yǎng)3～7天。觀察菌株生長情況。

1.2.4 模板制備和PCR 擴(kuò)增

（1）酵母菌基因組DNA 模板制備[11]挑取酵母菌接種于YEPD平板上，28℃培養(yǎng)2 天，經(jīng)4℃過夜后，按文獻(xiàn)報道的方法制備DNA 模板，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）26S rDNA D1/D2 區(qū)PCR 擴(kuò)增

PCR 擴(kuò)增引物為通用引物[12]：NL-1 和NL-4。

PCR 擴(kuò)增程序[13]：94 ℃3 min；94 ℃40 s，48 ℃45 s，72 ℃45 s，5 個循環(huán)；94 ℃40 s，53 ℃45 s，72℃45 s，25 個循環(huán)；72 ℃8 min。

1.2.5 PCR 產(chǎn)物測序及系統(tǒng)發(fā)育分析

將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序（由上海生工完成），將測序結(jié)果在NCBI 中進(jìn)行Blast 比對分析，獲得最相近菌株的26S rDNA D1/D2 序列，在MEGA4.1 中以鄰接法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

根據(jù)26S rDNA D1/D2 序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析，并結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征[9,14]，對實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行分類鑒定。

1.2.6 水果生物保鮮試驗(yàn)

選取3 種水果棗子、提子和山桃，每種水果，設(shè)3 個試驗(yàn)組（即XRL-1、XRL-2 和XRL-3 處理組）和1 個對照組（即無菌水處理組），每個組設(shè)3 個重復(fù)，每個重復(fù)5 個水果。將XRL-1、XRL-2 和XRL-3 酵母菌YEPD 液體培養(yǎng)物先測其OD600值，用無菌水稀釋使各OD600值一致，用無菌燒杯分裝，將水果放于盛有酵母菌液的燒杯中浸1 min，整齊擺放在臺面上指定位置，然后連續(xù)觀察記錄2 周，以比較酵母菌對水果的保鮮效果，并利用SPSS 統(tǒng)計軟件（IBM SPSS Statistics 19）對試驗(yàn)結(jié)果做單因素方差分析[15]。

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母菌的形態(tài)特征

XRL-1 菌落表面濕潤光滑，乳白色，大而厚，圓形，邊緣整齊1.3mm；呈單個細(xì)胞，圓形或橢圓形，長4.3m、寬3.7m；在YEPD培養(yǎng)基上可見芽殖；在麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基上未見子囊孢子，見圖1。

圖1 XRL-1 菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)（10×100）

XRL -2 菌落表面濕潤粘稠，乳白色，圓形或橢圓形，少數(shù)形狀不規(guī)則，從培養(yǎng)基表面微微凸起，邊緣整齊或不整齊2.6mm；呈單個細(xì)胞，圓形或橢圓形，少數(shù)呈扇形，長平均5.4m，寬平均4.2m；在YEPD 培養(yǎng)基上可見芽殖；在麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基上見子囊孢子，見圖2。

圖2 XRL-2 子囊孢子（10×100）

XRL-3 菌落表面濕潤光滑有光澤，乳白色，圓形或橢圓形，明顯突起，邊緣不整齊2.4mm；細(xì)胞呈檸檬形或卵圓形；在YEPD培養(yǎng)基上可見兩極芽殖，在麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基上未見子囊孢子。

2.2 生理生化特性

碳源同化/糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果表明：4 種供試碳源葡萄糖、乳糖、蔗糖和淀粉，XRL-1 均能利用；XRL-2只能利用葡萄糖和蔗糖；XRL-3 只能利用葡萄糖、乳糖和蔗糖，但對蔗糖利用作用不如葡萄糖和乳糖；葡萄糖是3 株酵母菌均能利用的通用碳源，見表1。

表1 碳源同化/糖發(fā)酵及氮源同化結(jié)果

氮源同化試驗(yàn)結(jié)果表明：4 種供試氮源蛋白胨、尿素、硝酸鈉和硫酸銨，XRL-1 和XRL-2 菌株均能利用，但XRL-3 僅能利用蛋白胨，蛋白胨是3 株酵母菌的通用氮源，見表1。

2.3 26S rDNA D1/D2 區(qū)PCR 擴(kuò)增、測序、比對及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用26S rDNA D1/D2 區(qū)PCR 擴(kuò)增通用引物NL1 和NL4 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3 所示：XRL-1、XRL-2和XRL-3 均擴(kuò)增到約600 bp 大小的片段，條帶清晰、整齊、明亮，與有關(guān)文獻(xiàn)[16,17]報道的一致，說明已成功擴(kuò)增到了目的片段。

圖3 酵母菌26S rDNA D1/D2 區(qū)PCR 擴(kuò)增

將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物測序，進(jìn)入NCBI 官網(wǎng)進(jìn)行Blast 比對，結(jié)果如表2 所示：XRL-1 與Wickerhamomyces anomalus strain FBKL2.8007 相似性為100.00%，XRL-2 與Saccharomyces cerevisiae isolate LMQA SNR 106 的相似性為99.83%，XRL-3 與Hanseniaspora uvarum strain SC-12 的相似性為99.66%。

表2 26S rDNA D1/D2 區(qū)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物BLAST 比對結(jié)果

利用XRL-1、XRL-2 和XRL-3 的26S rDNA D1/D2 區(qū)序列和 Wickerhamomyces anomalus strain FBKL2.8007、Saccharomyces cerevisiae isolate LMQA SNR 106 和 Hanseniaspora uvarum strain SC-12 的相應(yīng)序列，利用Mega4.1 構(gòu)樹軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖4 所示，XRL-1、XRL-2和XRL-3與相應(yīng)的同源菌株聚為一支，同時也可以看出，在3株酵母菌中，XRL-2 和XRL-3 親緣關(guān)系更近。

圖4 根據(jù)酵母菌26S rDNA D1/D2 區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

根據(jù)26S rDNA D1/D2 區(qū)序列Blast 比對和系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征，將試驗(yàn)菌株XRL-1、XRL-2 和XRL-3 分別鑒定為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus ）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。

2.4 水果生物保鮮

水果保鮮結(jié)果如表3 所示，單因素方差分析表明：酵母菌XRL-1、XRL-2 和XRL-3 對棗子、提子和山桃的保鮮效果在第一周均無顯著性差異（p>0.05）；在第二周對山桃亦無顯著差異（p>0.05），但對棗子和提子差異顯著（p<0.05），就棗子保鮮效果而言，多重比較表明XRL-1、XRL-2 和XRL-3 與對照組之間以及XRL-1 與XRL-2 和XRL-3 之間差異顯著（p<0.05），XRL-2 與 XRL-3 之間差異不顯著（p>0.05）；就提子的保鮮效果而言，多重比較表明XRL-1 與XRL-3 和對照組之間差異顯著（p<0.05），但XRL-1 與XRL-2 以及XRL-2 與對照組和XRL-3之間差異不顯著。提示不同的酵母菌拮抗活性存在明顯差異，3 種酵母菌中以異常威克漢姆酵母對棗子和提子的保鮮效果在第二周最佳，這與王遠(yuǎn)見（2022）[18]和藍(lán)黃博恩（2023）[19]報道的比較一致；第一周無顯著性差異可能和酵母菌的接種方法及其水果的定植有關(guān)。而山桃無論在第一周還是第二周，3 種酵母菌的保鮮效果并無顯著差異，推斷可能因?yàn)樯教沂且吧?，加之不同的水果可能存在不同的微生物區(qū)系，引起水果褐變或霉變的致病菌不同，水果中各種抗性酶的活性亦有高低，致使酵母菌對不同水果的保鮮效果各異。

表3 3 株酵母菌對3 種水果的生物保鮮效果（表中數(shù)據(jù)為褐變或霉變率/%）

3 結(jié)論

對從貴州省鳳岡縣仙人嶺李、梨和葡萄3 種水果中分離的3 株酵母菌XRL-1、XRL-2 和XRL-3 開展了形態(tài)學(xué)、生理生化以及分子生物學(xué)鑒定，將XRL-1、XRL-2 和XRL-3 分別鑒定為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。3 株酵母菌對水果棗子、提子和山桃采后保鮮的效果并不一致：在棗子采后保鮮上，XRL-1 與XRL-2、XRL-3 與對照組相比，在第一周無顯著性差異，但在第二周差異顯著（p<0.05）；在提子采后保鮮上，XRL-1、XRL-2 和XRL-3 與對照組相比，在第一周無顯著性差異，但在第二周XRL-1 與XRL-3 和對照組之間差異顯著（p<0.05）；在山桃采后保鮮上，XRL-1、XRL-2 和XRL-3 與對照組相比，在第一周和第二周均無顯著性差異（p>0.05）。用酵母菌作為拮抗菌劑用于果蔬生物保鮮，尚需要進(jìn)一步深入開展以下研究：拮抗酵母篩選與基因工程改良，拮抗酵母復(fù)合菌劑研究，果蔬采后微生物區(qū)系變化研究等。