黃娜,張明,李子健,饒家權,鄒永芳,黃丹,羅惠波*

1(四川輕化工大學 生物工程學院,四川 宜賓,644000)2(舍得酒業(yè)股份有限公司,四川 射洪,629000)

醬香大曲是以小麥為原料,粉碎后加水和曲母踩成曲坯,經(jīng)發(fā)酵貯存制成,在醬香型白酒生產(chǎn)過程中起到微生物制劑、復合酶制劑和風味物質(zhì)載體等作用[1]。受到曲房內(nèi)位置、溫度和水分等差異的影響,形成了3種顏色的高溫大曲：黑曲、褐曲和黃曲,這3種大曲不僅僅是顏色不同,更重要的是微生物組成、功能特性也有差異。生產(chǎn)用曲是由這3種大曲按照一定的比例混合使用。

大曲微生物種群結構及功能對白酒品質(zhì)有重要影響,因此受到廣泛的關注。柳習月等[2]利用多組學解析醬香型大曲風味物質(zhì)的形成,發(fā)現(xiàn)不同曲種間菌群結構及代謝物差異顯著,微生物、酶和代謝產(chǎn)物之間存在相關性,其中糖化酶和蛋白酶為芽孢桿菌合成四甲基吡嗪的重要驅(qū)動因素。SHI等[3]通過比較不同類型大曲的酶活性、揮發(fā)性代謝物和菌群特征,結果發(fā)現(xiàn)不同類型大曲在菌系、酶系和物系上存在顯著差異,醬香型大曲的4個細菌屬(Kroppenstedtia、Virgibacillus、Scopulibacillus和Staphylococcus)和2個真菌屬(Thermoascus和Aspergillus)與幾乎所有揮發(fā)性風味物質(zhì)呈正相關。不同顏色大曲質(zhì)量存在差異,唐佳代等[4]對3種不同顏色醬香型大曲的微生物群落與理化指標進行比較,發(fā)現(xiàn)造成其真菌群落結構差異的主要是Saccharomyces、Thermoascus、Byssochlamys和若干豐度較低的菌屬;DENG等[5]通過比較4種顏色的大曲理化性質(zhì)及微生物組成,發(fā)現(xiàn)4種不同顏色的大曲樣品在微生物組成、理化性質(zhì)、酶學性質(zhì)以及潛在功能方面存在差異,黑曲和紅曲的群落結構較為相似。大量研究表明不同顏色的醬香型大曲在微生物區(qū)系、理化性質(zhì)、酶學特征及代謝上都表現(xiàn)出不同的差異。因此,用不同的顏色來闡明醬香型大曲的潛在功能,將有利于醬香型大曲生產(chǎn)標準化。本研究通過比較不同顏色醬香型大曲微生物群落結構與功能、揮發(fā)性風味物質(zhì)組成及主要酶活力的差異,多維度地評估不同顏色大曲質(zhì)量與特點,為建立更加科學的醬香型大曲質(zhì)量評價標準提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

3種顏色的高溫大曲樣品取自四川遂寧某酒廠拆倉曲。取曲房底層表面黑色大曲、中層表面褐色大曲和上層表面黃色大曲各3塊,總計9個樣品,分別單獨粉碎制樣。根據(jù)大曲外觀顏色的不同,分別標記為黃曲(Y)、褐曲(BR)和黑曲(BL)。取樣后,將大曲樣品分為2份,一份立即進行酶活力和理化指標的測定,一份用液氮處理后于-80 ℃保藏用于微生物組成檢驗。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、葡萄糖(均為分析純),成都市科龍化工試劑廠;乙二胺四乙酸二鈉、蝸牛酶、溶菌酶、十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基硫酸鈉,生工生物工程(上海)股份有限公司;Tris-平衡酚(pH>7.8),上海博威生物醫(yī)藥有限公司;三氯甲烷、硫酸、鹽酸、冰醋酸(均為分析純),成都市科隆化學品有限公司;乙酸正戊酯,Adamas試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

ST2100 pH計,奧豪斯儀器有限公司;LYNX6000高速冷凍離心機,美國Thermo公司;7890A/5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 大曲質(zhì)量指標的檢測

大曲理化指標及主要酶活力的檢測參考QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》。

1.3.2 大曲總DNA的提取和測序

DNA的提取采用改良的CTAB法[6],使用引物338F/806R(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′/5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對細菌16S rRNA基因的V3-V4高變區(qū)進行擴增,ITS5F/ITS1R(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′/5′-GCTGCGTTC-TTCATCGATGC-3′)對真菌的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS1)進行擴增。由上海派森諾生物科技有限公司在Illumina MiSeq 2500平臺上進行雙端測序。

1.3.3 大曲揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定

揮發(fā)性化合物的測定使用了改良的MA等[7]的方法。具體操作如下：采用頂空固相微萃取法(headspace solid-phase microextraction method,HS-SPME)進行香氣成分的富集。稱取3 g大曲樣品于15 mL頂空瓶中,加入3 mL生理鹽水和20 μL的乙酸正戊酯(內(nèi)標),70 ℃條件下平衡15 min,50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維萃取頭頂空吸附50 min,進樣,250 ℃下解析3.5 min;DB-WAX 毛細管色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)。升溫程序為：起始溫度為40 ℃,保持1 min后以5 ℃/min的速度升溫升至180 ℃保持5 min,再以8 ℃/min的速度升溫至230 ℃,保持10 min,載氣為He,流速為1 mL/min,分流方式為不分流;離子化方式為電子電離源,質(zhì)譜電子能量為70 eV,離子源溫度為200 ℃,燈絲流量為0.25 mA,檢測器電壓為350 V,掃描范圍為33～450 AMU。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用IBM SPSS Statistics 26.0進行單因素方差分析(analysis of variance,ANOVA)和Duncan檢驗計算樣品間的顯著性(P<0.05);采用派森諾云平臺(https：//www.genescloud.cn/)對原始序列進行處理[8]及其在線工具進行物種組成分析、線性判別分析(linear discriminant analysis,LEfSe)、相關性分析、微生物功能預測;使用SIMCA-P 14軟件建立偏最小二乘-判別分析(partial least squares-discriiminate analysis,PLS-DA)模型篩選差異揮發(fā)性風味化合物;Origin 2022b用于風味物質(zhì)主成分分析分析。

2 結果與分析

2.1 不同顏色大曲微生物多樣性和群落組成

為評價不同顏色大曲樣品微生物群的差異,采用高通量測序技術對不同顏色大曲中的微生物進行分析,在3種醬香型大曲樣品中,共發(fā)現(xiàn)細菌有效序列986 218個(平均每個樣品有109 580個細菌序列),真菌有效序列930 818個(平均每個樣品有103 424個真菌序列)。微生物的α-多樣分析結果見圖1-a,圖1-d,以Chao 1指數(shù)表征豐富度,以Shannon指數(shù)表征多樣性。結果表明,樣品中細菌的物種豐富度和多樣性均高于真菌,因此真菌對高溫比細菌更敏感[9];細菌群落豐富度和多樣性的大小順序一致,為：黃曲>褐曲>黑曲;真菌群落與細菌群落豐富度和多樣性的大小順序相反,為：黑曲>褐曲>黃曲;且不同顏色大曲樣品間細菌和真菌多樣性差異均不顯著(P>0.05)。

所有大曲樣品中共檢測到396個細菌屬和61個真菌屬,真菌物種種類少于細菌。根據(jù)平均相對豐度,將樣品中豐度<1%的物種歸為一類(others)。由圖1-b可知,不同顏色大曲的細菌群落主要由克羅彭斯特菌屬(Kroppenstedtia)、高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)、糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)和芽孢桿菌屬(Bacillus)組成。黑曲的細菌群落以克羅彭斯特菌屬占絕對優(yōu)勢,占比為61.28%,遠高于其他2種顏色大曲。高溫放線菌屬和糖多孢菌屬在褐曲和黃曲中的相對豐度遠高于黑曲,且高溫放線菌屬是褐曲和黃曲中的第一優(yōu)勢菌屬。芽孢桿菌屬在黃曲中的占比最高為14.24%,而在褐曲中的占比最低為4.57%;芽孢桿菌屬被證實是醬香型白酒生產(chǎn)中主要的功能性細菌,可產(chǎn)生多種風味化合物[10-11]。枝芽孢桿菌屬(Virgibacillus)在黑曲和褐曲中的占比分別為6.94%和16.84%,而在黃曲中的占比不到1%,范培文等[12]發(fā)現(xiàn)其與正丙醇的產(chǎn)量呈正相關。由圖1-e可知,不同大曲真菌群落主要由嗜熱真菌屬(Thermomyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)和曲霉屬(Aspergillus)組成。嗜熱子囊菌屬和嗜熱真菌屬在不同顏色大曲中的相對豐度較高,分別為黑曲的第一優(yōu)勢真菌屬和第二優(yōu)勢真菌屬,而在褐曲和黃曲中恰與黑曲相反,分別為黃曲和褐曲的第二優(yōu)勢真菌屬和第一優(yōu)勢真菌屬;曲霉屬在黑曲中的相對豐度為6.40%,而在褐曲和黃曲中的相對豐度不到1%,曲霉屬在醬香型白酒發(fā)酵過程有利于提高酒曲的液化力、發(fā)酵力和酯化力[4]。

為進一步分析不同顏色大曲微生物的差異,采用LEfSe分析方法以鑒定3種顏色大曲的潛在生物標志物,如圖1-c、圖1-f所示。從不同顏色大曲中共檢出3個細菌屬和5個真菌屬,黃曲的生物標志物為嗜糖假單胞菌屬、副球菌屬和螯臺球菌屬、unclassified_Nectriaceae和嗜熱真菌屬,且副球菌屬僅存在于黃曲中,ZHANG等[13]研究證明副球菌屬是醬香型大曲成熟6個月的生物標志物;褐曲的生物標志物為被孢霉屬;黑曲的生物標志物為嗜熱子囊菌屬和鐮刀菌屬,且嗜熱子囊菌屬為黑曲的第一優(yōu)勢微生物。造成不同顏色大曲的微生物群落結構差異的主要是高豐度的嗜熱真菌屬和嗜熱子囊菌屬與豐度較低的螯臺球菌屬、unclassified_Nectriaceae、被孢霉屬和鐮刀菌屬。

2.2 不同顏色大曲微生物功能預測

為了對比不同顏色大曲微生物的功能,利用PICRUSt2對不同顏色微生物群落的基因及其豐度進行預測,并且基于負二項分布模型進行檢驗,如圖2所示。以|lg 2FC|>1且P<0.05為篩選標準,褐曲與黑曲對比,有950個基因豐度顯著增加,195個基因豐度顯著降低;黃曲與黑曲對比,有1 057個基因豐度顯著增加,318個基因豐度顯著降低;黃曲與褐曲對比,有57個基因豐度顯著增加,247個基因豐度顯著降低。

a-火山圖;b-柱狀圖圖2 不同顏色大曲差異基因

基于京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)對差異基因進行功能富集,如圖3所示。褐曲和黑曲對比,顯著增加的基因的富集通路共有21種,主要為果糖和甘露糖代謝、代謝途徑、不同環(huán)境中的微生物代謝、精氨酸生物合成、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝、脂肪酸降解、芳香族化合物的降解和苯丙氨酸代謝等新陳代謝途徑;顯著下降的基因主要富集在碳水化合物代謝(氨基糖和核苷酸糖代謝、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化和淀粉和蔗糖代謝)、氨基酸代謝(膦酸鹽和亞膦酸鹽代謝和賴氨酸降解)及核苷酸代謝(嘌呤代謝)。氨基酸代謝和碳水化合物代謝在白酒釀造體系中極為重要,氨基酸不僅本身就是醬香型白酒中風味物質(zhì)的直接來源且也是醬香型白酒中風味前體物的重要來源[14-15];大曲中含有豐富的淀粉、蔗糖等物質(zhì),微生物通過碳水化合物代謝為自身生長提供能量和營養(yǎng)物質(zhì),同時為大曲釀造提供重要的風味物質(zhì)。黃曲與黑曲對比,顯著增加的基因的富集的通路共有21種,主要為芳香族化合物的降解、代謝途徑、不同環(huán)境中的微生物代謝等新陳代謝途徑及群體感應,ABISADO等[16]研究稱群體感應是導致傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵具有不同穩(wěn)態(tài)形成的內(nèi)在因素;顯著下降的基因富集通路共有10種,主要為環(huán)境信息處理(ABC轉(zhuǎn)運蛋白和雙組分系統(tǒng))。黃曲與褐曲對比,顯著增加的基因富集通路共有5種,為肽聚糖生物合成、雙組分系統(tǒng)、二甲苯降解、類胡蘿卜素生物合成和非核糖體肽結構;顯著下降的基因的富集通路共有7種,主要為雙組分系統(tǒng),其基因數(shù)為30條。3種顏色的大曲微生物的功能差異主要體現(xiàn)在新陳代謝、細胞過程與環(huán)境信息處理,這些大曲微生物群落功能的差異最終影響到大曲微生群落的代謝物的產(chǎn)生。

圖3 不同顏色大曲顯著差異基因KEGG功能富集圖

2.3 不同顏色大曲理化指標及主要酶活力的差異分析

大曲的水分、酸度、還原糖和淀粉等指標在一定程度上能夠反映大曲的品質(zhì),也是目前大曲質(zhì)量評價的重要指標[17],而糖化力、液化力和酯化力則反映大曲中的酶系功能[18]。通過單因素方差分析,比較不同顏色大曲的理化指標差異,分析結果如表1所示。

表1 不同顏色大曲質(zhì)量指標Table 1 Quality index table of Daqu with different colors

如表1可知,大曲的水分、糖化力和液化力的含量值在3種顏色大曲之間沒有顯著性差異,差異主要體現(xiàn)在酸度、還原糖、淀粉和酯化力。黑曲的淀粉含量顯著低于其他組,總酸含量卻顯著高于其他組,可見黑曲樣品中的微生物可能將更多的多糖類物質(zhì)通過糖酵解等途徑進一步轉(zhuǎn)化成了酸類物質(zhì),從而表現(xiàn)為酸的累積[19]。大曲的重要功能之一是在釀造過程中提供酶。褐曲的糖化酶和液化酶最高,分別是黃曲/黑曲的1.18/1.75和1.36/1.52;有研究表明優(yōu)質(zhì)曲的糖化力和液化力突出[20]。黑曲的酯化酶活性顯著高于褐曲和黃曲,分別是褐曲/黃曲的3.06/3.09倍。

2.4 不同顏色大曲揮發(fā)性風味物質(zhì)組成及差異分析

為評估不同顏色大曲揮發(fā)性風味物質(zhì)差異,進行了主成分分析研究(圖4-a)。發(fā)現(xiàn)不同顏色大曲揮發(fā)性風味物質(zhì)共有37種,其中醇類、酯類和吡嗪類物質(zhì)種類較多,分別為8、5、6種。為進一步探究不同顏色大曲揮發(fā)性風味物質(zhì)的差異,基于3組大曲揮發(fā)性風味物質(zhì)的定量結果建立了PLS-DA 分類模型進行可視化分析,如圖4-b所示。以VIP值大于1為標準,確定了3組大曲間有顯著差異的揮發(fā)性風味物質(zhì)14種,十六酸乙酯和三甲胺與褐曲落點距離相對較近,在褐曲中相對含量較高,可視為褐曲區(qū)別于其他兩種顏色大曲代謝組成的特征風味物質(zhì);苯酚、鄰苯二甲醚、苯乙醇和苯甲醇與黃曲分布在PC1的負軸和PC2的正軸,這些風味物質(zhì)在黃曲中含量相對較高;可視為黃曲的特征風味物質(zhì);苯乙醇和苯甲醇在黃曲中的含量高于褐曲和黑曲,這與王穎等[21]的研究結果一致;乙酸乙酯、2-甲基吡嗪、糠醛、異戊醇、3-辛醇、2,3,5-三甲基吡嗪和乙醇與黑曲分布在PC1的負軸和PC2的負軸,這些風味物質(zhì)在黑曲中相對含量較高,可視為黑曲的特征風味物質(zhì)。

1-乙醇;2-十六酸乙酯;3-肉豆蔻酸乙酯;4-乙酸;5-乙酸乙酯;6-苯乙醇;7-苯甲醛;8-2,3-丁二醇;9-正戊醇;10-正己酸乙酯;11-異戊醛;12-苯甲醇;13-異戊醇;14-2,3,5-三甲基吡嗪;15-2,5-二甲基吡嗪;16-苯乙酸乙酯;17-2,3,5,6-四甲基吡嗪;18-三甲胺;19-糠醇;20-糠醛;21-2,6-二甲基吡嗪;22-苯乙醛;23-2-吡咯甲醛;24-2-乙?；量?25-2-甲基吡嗪;26-苯酚;27-正十四烷;28-環(huán)氧乙烷;29-正十六烷;30-鄰苯二甲醚;31-3-辛醇;32-1,3-二叔丁基苯;33-十二烷;34-N,N-二甲基乙酰胺;35-3-甲基十一烷;36-2-甲基-6-乙烯基吡嗪;37-2,5-二甲基-3-亞甲基-1,5-庚二烯a-主成分分析;b-PLS-DA VIP值圖4 不同顏色大曲揮發(fā)性風味物質(zhì)組成和差異分析

2.5 不同顏色大曲微生物群落與理化性質(zhì)、主要酶活力及風味物質(zhì)的關聯(lián)分析

為了解不同顏色大曲之間的差異,利用冗余分析(redundancy analysis,RDA)解析差異微生物與大曲理化指標之間的相關性,結果如圖5-a所示。由圖5-a可知,被孢霉屬與酯化力呈正相關;嗜熱真菌屬與淀粉含量、糖化力和液化力成正相關;鐮刀菌屬、嗜熱子囊菌屬與水分、總酸、還原糖和酯化力呈正相關,且鐮刀菌屬和嗜熱子囊菌屬為黑曲的生物標志物,可知鐮刀菌屬和嗜熱子囊菌屬是引起黑曲高酯化力的關鍵菌群。

a-RDA圖;b-共現(xiàn)網(wǎng)絡圖圖5 差異微生物與理化指標、主要酶活力及差異揮發(fā)性風味物質(zhì)之間相關性分析

利用Cytoscape軟件基于Spearman等級相關性(|ρ|>0.5和P<0.05)繪制相關性網(wǎng)絡圖以評估差異微生物與差異揮發(fā)性風味物質(zhì)的關系。如圖5-b所示,嗜糖假單胞菌屬與鄰苯二甲醚和苯甲醇呈正相關;副球菌屬與苯甲醇、苯酚和鄰苯二甲醚呈正相關;螯臺球菌屬與苯甲醇和苯酚呈正相關;可見嗜糖假單胞菌屬、副球菌屬和螯臺球菌屬主要影響苯甲醇、苯乙醇、苯酚、鄰苯二甲醚的合成。被孢霉屬與十六酸乙酯呈正相關,與苯甲醇呈負相關。嗜熱子囊菌屬與3-辛醇呈正相關,這與柳習月等[2]的研究結果一致;此外,鐮刀菌屬與3-辛醇、2-甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪呈正相關,而與苯甲醇和鄰苯二甲醚呈負相關。

將大曲樣品中鑒定出的差異揮發(fā)性風味物質(zhì)進行KEGG富集分析,如圖6所示。發(fā)現(xiàn)富集途徑與功能預測相同的途徑有淀粉和蔗糖代謝、苯丙氨酸代謝、果糖和甘露糖代謝、丙酮酸代謝和氨基糖和核苷酸糖代謝。此外,不同顏色大曲代謝產(chǎn)物也存在一定差異,說明代謝途徑也存在一定差異。這些基于功能預測和差異風味物質(zhì)通路富集分析進一步闡明了3種顏色大曲在微生物功能方面的差異,尤其是在碳水化合物代謝和氨基酸代謝。

圖6 不同顏色大曲微生物通路熱圖

3 結論

通過比較不同顏色的大曲微生物菌群結構與功能、理化指標以及揮發(fā)性風味物質(zhì),3種不同顏色大曲共有優(yōu)勢細菌屬為克羅彭斯特菌屬、高溫放線菌屬、糖多孢菌屬、芽孢桿菌屬、Pseudonocardiaceae、枝芽孢桿菌屬和沙雷菌屬,共有優(yōu)勢真菌屬為嗜熱真菌屬和嗜熱子囊菌屬;黃曲的生物標志物為嗜糖假單胞菌屬、副球菌屬、螯臺球菌屬、嗜熱真菌屬和unclassified_Nectriaceae,褐曲的生物標志物為被孢霉屬,黑曲的生物標志物為嗜熱子囊菌屬和鐮刀菌屬;發(fā)現(xiàn)3種不同顏色醬香型大曲微生物群落功能出現(xiàn)顯著差異,褐曲與黑曲對比,共有1 145個差異基因;黃曲與黑曲對比,共有1 372個差異基因;黃曲與褐曲對比,共有304個差異基因?；诠δ芨患?發(fā)現(xiàn)3種顏色的大曲微生物的功能差異主要體現(xiàn)在新陳代謝、細胞過程與環(huán)境信息處理,尤其體現(xiàn)在新陳代謝中的碳水化合物代謝和氨基酸代謝。嗜熱真菌屬與淀粉含量、液化力和酯化力呈正相關,被孢霉屬與十六酸乙酯和酯化力呈正相關,嗜熱子囊菌屬和鐮刀菌屬與水分、總酸、還原糖、酯化力和3-辛醇呈正相關,且嗜熱子囊菌屬和鐮刀菌屬為黑曲的潛在生物標志物,可知鐮刀菌屬、嗜熱子囊菌屬是引起黑曲高酯化力的關鍵菌群;研究結果表明了不同顏色醬香型大曲微生物群落結構與功能、揮發(fā)性風味物質(zhì)組成及主要酶活力的差異,闡明了3種大曲微生物菌群與理化、風味物質(zhì)的關系,為進一步完善大曲評價指標,建立醬香型大曲質(zhì)量評價標準提供了理論參考。