王玉榮,席啦,易宗偉,付彩霞,葛東穎,郭壯*

1(湖北文理學(xué)院,湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心,湖北 襄陽,441053) 2(湖北土老憨生態(tài)農(nóng)業(yè)科技股份有限公司,湖北 宜都,443000) 3(湖北省發(fā)酵調(diào)味品工程技術(shù)研究中心,湖北 宜都,443000)

作為中國傳統(tǒng)的發(fā)酵調(diào)味品,醬油以大豆、小麥和食鹽為主要原料,經(jīng)人工添加含有米曲霉等微生物的曲種發(fā)酵而成[1]。雖然醬油中含有大量的食鹽,但由于制作的開放性,產(chǎn)品中亦可能存在部分微生物,貨架期內(nèi)若貯藏溫度過高,則產(chǎn)品可能會出現(xiàn)脹氣和變酸等質(zhì)量問題[2]。以貨架期內(nèi)出現(xiàn)脹壺現(xiàn)象的醬油為研究對象,上官宗渺[3]發(fā)現(xiàn)其微生物類群主要由破布子乳桿菌(Lactobacilluspobuzihii)、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、埃切畢赤酵母(Pichiaetchellsii)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)構(gòu)成。楊卓等[4]通過基因測序和產(chǎn)氣實驗證明了工廠中脹罐醬油的厭氧產(chǎn)氣菌為L.pobuzihii。蔣雪薇等[5]在成品變質(zhì)醬油中解析出地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)、嗜鹽芽胞桿菌(Bacillushalodurans)和B.megaterium等3株耐鹽性較好的產(chǎn)氣菌。張佳惠等[6]研究亦表明變質(zhì)醬油中可能存在金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等食源性致病菌,并且隨著貯藏時間的延長,醬油中菌落總數(shù)會逐漸增加,食用后對身體健康存在極大的危害。由此可見,系統(tǒng)解析脹氣醬油中微生物的類群,對提升貨架期內(nèi)醬油的穩(wěn)定性和食用安全性均具有積極的意義。

目前大量研究人員對微生物的產(chǎn)氣途徑進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)通過異型乳酸發(fā)酵部分微生物經(jīng)戊糖磷酸途徑可產(chǎn)生乳酸、乙酸和二氧化碳[7],另外微生物的乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣也是一個重要途徑[8]。具體來講,部分酵母菌等真菌通過呼吸作用可產(chǎn)生二氧化碳[9],梭菌等嗜溫及嗜熱細(xì)菌可利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)氫氣[10];產(chǎn)甲烷菌在厭氧環(huán)境中可利用揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)生甲烷[11]。由此可見,通過發(fā)酵產(chǎn)氣的微生物是多樣的,但可引起生抽醬油脹氣的具體微生物類群還有待進(jìn)一步研究。利用宏基因組技術(shù),SULAIMAN等[12]對醬油發(fā)酵過程中微生物類群和功能的變化進(jìn)行了解析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前期魏斯氏菌(Weissella)為優(yōu)勢菌群而發(fā)酵后期則轉(zhuǎn)變?yōu)槟钪榫?Candida),該研究亦同時揭示了不同發(fā)酵時期蛋白質(zhì)和碳水化合物異養(yǎng)發(fā)酵的特征,這也直接證實了宏基因組技術(shù)在醬油微生物類群和功能解析中可行性。

湖北省某調(diào)味品公司生產(chǎn)的生抽醬油在留樣貯藏期間出現(xiàn)了脹氣現(xiàn)象,本研究采集了2個批次的脹袋生抽醬油樣品,首先采用宏基因組測序技術(shù)對其微生物類群進(jìn)行了解析,繼而采用純培養(yǎng)技術(shù)對其微生物菌株進(jìn)行了分離鑒定,最后對分離出的微生物菌株進(jìn)行了產(chǎn)氣驗證實驗。通過本研究的開展以期為生抽醬油脹氣問題的解決提供數(shù)據(jù)支持和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

于2022年7月中旬和8月初,從湖北某醬油生產(chǎn)廠家采集在貯藏期間中出現(xiàn)漲袋現(xiàn)象的生抽醬油樣品2份,分別編號為Q1和Q2,同時采集正常醬油樣品2份,所有樣品的生產(chǎn)時間均為2022年5月。

QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒,德國QIAGEN公司;Illumina Novaseq 6000高通量測序平臺配套試劑,美國Illumina公司;PDA、LB和MRS培養(yǎng)基,青島海博生物技術(shù)有限公司;十六烷基三甲基溴化銨、酚、氯仿、異戊醇、氯化鈉、乙酸鈉、乙醇,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;PCR buffer、dNTP mix、rTaq酶、Solution I、pMD18-T載體和Loading buffer,寶生物工程(大連)有限公司;PCR產(chǎn)物清潔試劑盒,艾思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)公司;引物27F/1495R、NS1/NL4和M13F(-47)/M13R(-48),武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Veriti FAST梯度PCR儀,美國ABI公司;164-5050基礎(chǔ)電泳儀,美國Bio-Rad公司;UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng),美國Protein Simple公司;Illumina novaseq 6000高通量測序平臺,美國Illumina公司;R920型機(jī)架式服務(wù)器,美國DELL公司;DG250型厭氧工作站,英國Don Whitley公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 宏基因組測序及生物信息學(xué)分析

使用QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒提取生抽醬油樣品的宏基因組DNA,并將通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗合格的DNA寄往北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行雙端各150 bp的宏基因組測序,測序平臺為Illumina HiSeq XTen。首先使用fastp v0.23.2軟件(https：//github.com/OpenGene/fastp)對下機(jī)序列進(jìn)行質(zhì)控,剔除長度<50 bp、平均質(zhì)量值<20 bp和含有N堿基的序列[13];繼而通過與人類基因組比對,去除實驗中引入的人類基因組序列后得到可用于后續(xù)分析的有效序列;最后將有效序列與kraken2(v2.1.1)[14]和Bracken(v2.5)數(shù)據(jù)庫[15]比對以解析出脹氣生抽樣品中菌群群落的結(jié)構(gòu)信息。

1.3.2 基于純培養(yǎng)技術(shù)脹袋生抽醬油中微生物的分離

使用倍比稀釋法將醬油樣品稀釋至10-1梯度,各取1 mL原液和1 mL稀釋液分別涂布于PDA、LB和MRS平板中,PDA平板在25 ℃有氧條件下正置培養(yǎng)5 d,LB平板在30 ℃有氧條件下倒置培養(yǎng)2 d,MRS平板在37 ℃無氧條件(85% N2,10% H2和5% CO2)下倒置培養(yǎng)2 d。挑取形態(tài)、大小和顏色各不相同的菌株,依照三區(qū)劃線法連續(xù)劃線3次后分別轉(zhuǎn)接于PDA、LB和MRS的液體試管中,培養(yǎng)1 d后收集菌體進(jìn)行過氧化氫酶實驗和革蘭氏染色,最后通過觀察鏡檢結(jié)果初步判斷分離株的種類[16]。

1.3.3 脹袋生抽醬油中可培養(yǎng)微生物的鑒定及登錄號的申請

參照GUO等[17]的方法提取疑似細(xì)菌的DNA,并進(jìn)行PCR擴(kuò)增、連接、轉(zhuǎn)化和鑒定,參照OOI等[18]的方法對疑似酵母菌的菌株進(jìn)行鑒定,將鑒定的陽性克隆子寄往上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測序,拼接返回序列后于美國國家生物技術(shù)信息中心NCBI比對,最后將所有分離株序列上傳至GeneBank數(shù)據(jù)庫,獲得細(xì)菌登錄號分別為OP002178-OP002238,酵母菌登錄號分別為OP018542-OP018543。

1.3.4 產(chǎn)氣驗證實驗

a)將分離出的微生物從凍存管中各取200 μL逐一活化在裝有5 mL液體培養(yǎng)基(PDA/LB/MRS)試管(10 mm×150 mm)中,分別于25、30、37 ℃下連續(xù)傳3代后離心,去掉上層清液并在菌泥中添加1 mL濃度為0.85%的生理鹽水后重懸待用。

b)取30 mL正常生抽醬油裝入一次性透明自立吸嘴包裝袋(30 mL),密封后于100 ℃沸水中保持15 min,隨后在無菌條件下排盡空氣待用。

c)在15 mm×150 mm的試管中裝入10 mL液體培養(yǎng)基(PDA/LB/MRS)和排盡氣泡的杜氏小管,于121 ℃滅菌15 min,放涼后待用。

驗證實驗一：參照張小麗等[19]的方法,并稍作修改,取200 μL A中重懸后的菌液在無菌條件下逐一接種于B方式處理后的醬油袋,同時制作不接菌的空白對照,分別在25、30、37 ℃條件下培養(yǎng)10 d,觀察是否出現(xiàn)脹袋現(xiàn)象。

驗證實驗二：參照張小麗等[19]的方法,并稍作修改,取200 μL A中重懸后的菌液在無菌條件下逐一接種于C方式處理后的PDA、LB和MRS液體試管,同時制作不接菌的空白對照,分別于25、30、37 ℃培養(yǎng)10 d并觀察結(jié)果。

1.3.5 微生物群落結(jié)構(gòu)解析

使用MEGA5.0與R軟件的“tidyverse”、“treeio”和“ggtree”包構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹;使用Origin 2018軟件繪制相對含量的柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于宏基因組測序技術(shù)解析脹袋生抽醬油的微生物類群

本研究首先對2個脹氣和2個正常生抽醬油樣品微生物基因組進(jìn)行了提取,但2個正常樣品因提取的基因組質(zhì)量較差無法進(jìn)行上機(jī)建庫,究其原因可能與其微生物含量較少有關(guān),因而本研究僅對2個脹袋生抽醬油樣品的微生物類群進(jìn)行了解析。在過濾掉人類基因組和低質(zhì)量序列后,Q1和Q2樣品共產(chǎn)出44 503 218條和47 657 592條序列,測序數(shù)據(jù)量分別為6.68 G和7.15 G,經(jīng)比對共鑒定出526個屬和1 199個種。平均相對含量>1.0%屬和種的柱狀圖,如圖1所示。

A-屬;B-種圖1 基于宏基因組學(xué)技術(shù)脹袋生抽醬油中微生物群落在屬和種水平上的構(gòu)成分析

由圖1-A可知,脹袋生抽醬油樣品中平均相對含量>1.0%的屬主要由四鏈球菌屬(Tetragenococcus)、聯(lián)合乳桿菌屬(Ligilactobacillus)、植物乳桿菌屬(Lactiplantibacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、伴生乳桿菌屬(Companilactobacillus)、腐敗乳桿菌屬(Loigolactobacillus)、促生乳桿菌屬(Levilactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、魏斯氏菌屬(Weissella)和黏液乳桿菌屬(Limosilactobacillus)組成,平均相對含量分別為28.29%、27.40%、9.93%、4.81%、4.06%、2.95%、2.73%、1.76%、1.46%、1.41%和1.31%。由圖1-B可知,平均相對含量>1.0%的種主要由嗜鹽四聯(lián)球菌(Tetragenococcushalophilus)、酸魚聯(lián)合乳桿菌(Ligilactobacillusacidipiscis)、植物乳植物桿菌(Lactiplantibacillusplantarum)、耐酸乳桿菌(Lactobacillusacetotolerans)、棒狀腐敗乳桿菌(Loigolactobacilluscoryniformis)、短促生乳桿菌(Levilactobacillusbrevis)和屎腸球菌(Enterococcusfaecium)組成,平均相對含量分別為28.01%、25.50%、9.45%、2.49%、1.83%、1.53%和1.33%。值得一提的是,Q1和Q2樣品微生物組成和含量存在較大差異,其中T.halophilus在Q1樣品中最豐富,占比高達(dá)53.37%,而L.acidipiscis在Q2樣品中最豐富,占比高達(dá)41.99%。ZHANG等[20]的研究表明,T.halophilus與醬油中天冬氨酸和谷氨酸等鮮味化合物的產(chǎn)生呈顯著正相關(guān),麻穎垚等[21]通過變性梯度凝膠電泳技術(shù)對脹袋醬油中的污染細(xì)菌進(jìn)行了鑒定,亦發(fā)現(xiàn)其中存在L.acidipiscis。綜上所述,納入本研究的脹袋生抽醬油樣品中可能主要以乳酸菌為主,但具體是由于哪類微生物產(chǎn)氣從而引起了漲袋現(xiàn)象尚需進(jìn)一步研究。并且,宏基因組測序技術(shù)是對樣本中存在的所有DNA進(jìn)行測序,其包含了活細(xì)胞和死細(xì)胞,這對于解析生抽醬油中產(chǎn)氣微生物類群具有一定的干擾性,因此本研究進(jìn)一步采用純培養(yǎng)技術(shù)對樣品中微生物菌株進(jìn)行了分離鑒定。

2.2 基于純培養(yǎng)技術(shù)解析脹袋生抽醬油的微生物類群

因只有2個脹袋生抽醬油樣品成功完成了上機(jī)測序,本研究進(jìn)一步使用純培養(yǎng)技術(shù)對其微生物菌株進(jìn)行了分離鑒定,從2個脹袋生抽醬油樣品中共分離鑒定出49株細(xì)菌與2株酵母菌,其中細(xì)菌分離株的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。

圖2 基于16 S rRNA基因序列構(gòu)建的脹袋生抽醬油中細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

由圖2可知,49株細(xì)菌隸屬于6個屬下的11個種,分別為Ligilactobacillus下的破布子聯(lián)合乳桿菌(L.pobuzihii)和L.acidipiscis,Loigolactobacillus下的蛋白原酶腐敗乳桿菌(L.rennini),Bacillus下的枯草芽孢桿菌(Bsubtilis)、暹羅芽孢桿菌(B.siamensis)、白色芽孢桿菌(B.albus)和擬蕈狀芽孢桿菌(B.paramycoides),Tetragenococcus下的T.halophilus,Rosenbergiella下的羅森伯氏菌(R.epipactidis),Enterococcus下的E.faecium,以及葡萄球菌(Staphylococcus)下的表皮葡萄球菌(S.epidermidis)。由圖3亦可知,分別有23個和21個分離株隸屬于芽孢桿菌和乳酸桿菌,分別占總分離株的45.10%和42.86%,因而基于純培養(yǎng)技術(shù),本研究發(fā)現(xiàn)脹氣生抽中的細(xì)菌多由芽孢桿菌和乳酸桿菌組成。李娜[22]運用傳統(tǒng)的純培養(yǎng)技術(shù)發(fā)現(xiàn),脹罐醬油中主要的污染菌為B.subtilis、油酸芽孢桿菌(B.oleronius)、彎曲芽孢桿菌(B.flexus)、L.pobuzihii、L.acidipiscis和豌豆乳桿菌(L.piscium),與本研究相比其未分離出隸屬于Tetragenococcus、Rosenbergiella、Enterococcus和Staphylococcus的菌株,這可能是與樣品采集地和分離方式等存在差異有關(guān)。值得一提的是,E.faecium具有較強(qiáng)的環(huán)境耐受性,是人類和動物的腸道共生菌[23],S.epidermidis主要存在于皮膚的微環(huán)境及粘膜中,屬于條件致病菌的一種[24],它們在脹袋生抽醬油中被分離鑒定出,可能是源于釀造車間工人的不規(guī)范操作或樣品滅菌不徹底。

圖3 基于28 S rRNA基因序列構(gòu)建的脹袋生抽醬油中酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

從脹袋生抽醬油中分離的2株酵母菌系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖3所示。

由圖3可知,本研究僅從Q2樣品中分離出2株酵母菌,經(jīng)鑒定均為扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera),隸屬于該種的微生物菌株能夠從可溶性淀粉中積累海藻糖,并產(chǎn)生淀粉酶、酸性蛋白酶和β-葡萄糖苷酶,在各種發(fā)酵食品中,被廣泛用作微生物發(fā)酵劑[25]。YAN等[26]的研究表明,S.fibuligera在醬油種曲發(fā)酵的初始階段生長,其產(chǎn)生的各種酶有助于葡萄糖的積累,與醬油風(fēng)味的形成密切相關(guān)。

本研究進(jìn)一步對2份樣品中可培養(yǎng)微生物構(gòu)成情況進(jìn)行了分析,結(jié)果如圖4所示。

圖4 基于純培養(yǎng)技術(shù)脹袋生抽醬油中微生物群落構(gòu)成分析

由圖4可知,2份樣品中分離最多的菌株為B.subtilis,占分離株總數(shù)的39.22%,其次是L.pobuzihii、L.rennini和L.acidipiscis,分別占分離株總數(shù)的19.61%、11.76%和9.80%。秦南南等[27]從新疆某品牌的脹袋醬油中分離了2株產(chǎn)氣菌,經(jīng)鑒定分別為B.subtilis和巨大芽孢桿菌(B.megaterium),與本研究結(jié)論存在一定的相似性。值得一提的是,采用宏基因組和純培養(yǎng)技術(shù)對脹氣醬油微生物類群進(jìn)行解析時,2種技術(shù)獲得的結(jié)果存在一定的差異性。究其原因可能在于,醬油中部分微生物菌株處于休眠狀態(tài),受培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件等因素的影響,在實驗室條件下無法實現(xiàn)其純培養(yǎng)。此外,宏基因組技術(shù)是基于微生物的全基因組DNA進(jìn)行測序,其無法區(qū)分微生物菌株存活狀態(tài),因而可能將部分已經(jīng)死亡的微生物菌株也進(jìn)行了測序,導(dǎo)致了結(jié)果的不準(zhǔn)確。

2.3 產(chǎn)氣驗證

為明確引起生抽醬油脹袋的微生物類群,本研究進(jìn)一步對51株分離株進(jìn)行了產(chǎn)氣驗證實驗。通過觀察第一個驗證試驗發(fā)現(xiàn),51個分離株在醬油袋中均有少量淡黃色沉淀產(chǎn)生,但均未出現(xiàn)脹袋現(xiàn)象;通過觀察第二個驗證實驗發(fā)現(xiàn),在所有接菌培養(yǎng)的試管底部均有菌體沉淀產(chǎn)生但杜氏小管內(nèi)無氣泡。由此可見,本研究分離出的微生物菌株均不能引起醬油的脹袋。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[28]發(fā)現(xiàn)B.subtilis在含有葡萄糖的復(fù)雜培養(yǎng)基中生長較為緩慢,但在有氧條件下生長旺盛且能產(chǎn)生二氧化碳,手冊中亦表明Staphylococcusepidermidis能分解精氨酸產(chǎn)氨、分解半胱氨酸可能產(chǎn)生少量硫化氫。由此可見,本研究的產(chǎn)氣實驗中隸屬于B.subtilis和Staphylococcusepidermidis的分離株均未出現(xiàn)產(chǎn)氣現(xiàn)象可能與其培養(yǎng)環(huán)境較為不適宜有關(guān),但具體的原因還有待進(jìn)一步的研究。吳浪濤研究表明,B.subtilis及其亞種(B.subtilissubspnatto)和L.pobuzihii含量較多時對醬油的脹氣現(xiàn)象有很大影響[29]。然而,本研究分別接種B.subtilis和Ligilactobacilluspobuzihii后并未出現(xiàn)醬油脹袋。究其原因可能在于：a)本研究并未分離出造成醬油脹袋的微生物菌株,在后續(xù)研究中可采用培養(yǎng)組學(xué)策略,通過更換培養(yǎng)基、改變培養(yǎng)溫度或轉(zhuǎn)換培養(yǎng)條件等方法盡可能多的分離出微生物菌株,對醬油漲袋這一產(chǎn)業(yè)問題的解決可能具有積極意義;b)醬油脹袋可能是多菌株協(xié)同作用的結(jié)果,而本研究接種的菌株均為單一菌株,因而在后續(xù)研究中還需進(jìn)一步考慮多菌株的協(xié)同作用;c)除了微生物產(chǎn)氣的生物原因外,后續(xù)研究中亦需進(jìn)一步考慮熱脹冷縮的物理原因或酸堿反應(yīng)的化學(xué)原因[30]。

3 結(jié)論

本研究采用宏基因組測序和純培養(yǎng)技術(shù)對脹袋生抽醬油微生物類群進(jìn)行了解析,宏基因組測序結(jié)果表明脹氣醬油中主要微生物為T.halophilus和Ligilactobacillusacidipiscis,兩者累計平均相對含量超過了50%。純培養(yǎng)結(jié)果表明,脹氣醬油中細(xì)菌被鑒定為6個屬下的11個種,具有較高的多樣性,且以B.subtilis、L.pobuzihii、L.rennini和L.acidipiscis為主,隸屬于4個種的分離株占總分離株的80%以上,而酵母菌多樣性較低僅以S.fibuligera為主。經(jīng)驗證實驗發(fā)現(xiàn),本研究分離的菌株均無法導(dǎo)致生抽醬油漲袋。由此可見,脹袋生抽醬油具有較高的微生物多樣性,在后續(xù)研究中引入培養(yǎng)組學(xué)策略以獲得更多的分離株,亦或考慮多菌株的協(xié)同作用,對醬油漲袋這一產(chǎn)業(yè)問題的解決可能具有積極的意義。