袁子群，毛志宇，高興華，胡國輝，巫金波，張萌穎?

①上海大學 理學院，上海 200444；②上海大學 材料基因組工程研究院，上海 200444；③上海大學 力學與工程科學學院，上海 200444

21世紀以來，外源性物質(zhì)的細胞內(nèi)遞送已經(jīng)成為進行基因治療、基因重編輯、再生醫(yī)學以及生物分析等現(xiàn)代生物科學研究的必要條件。然而，細胞膜作為天然的生物屏障，嚴格阻止生物大分子進入細胞，導致向細胞內(nèi)遞送藥物或分子的效率較低。為了克服這一難題，近年來出現(xiàn)了多種細胞內(nèi)藥物或分子遞送的方法，包括基于載體的生物方法和基于膜破壞的物理方法。前者由病毒[1-2]或化學藥物[3-4]介導，然后通過細胞內(nèi)吞或融合作用內(nèi)化遞送物質(zhì)。雖然這類方法已被證明對基因轉(zhuǎn)移和治療有效，但往往是針對特定細胞類型的，并且常常受到細胞毒性和不必要的免疫、炎癥反應的影響，導致細胞存活率降低[5-7]。而基于膜破壞的物理方法可以繞過內(nèi)吞作用，通過外力使細胞膜產(chǎn)生短暫的孔隙，在細胞膜重新封閉之前，外源分子經(jīng)瞬態(tài)孔隙迅速擴散進入細胞內(nèi)部，完成大分子物質(zhì)的遞送。實驗證明，通過這類技術(shù)轉(zhuǎn)染的細胞產(chǎn)生不良反應和不必要的免疫原性反應的概率非常小，并且可以在高通量下表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)染效率。近年來，隨著微納米技術(shù)的發(fā)展，通過物理方法實現(xiàn)胞內(nèi)遞送的研究也得到進一步的突破。本文將概述傳統(tǒng)的物理方法(包括電穿孔、聲穿孔和微注射等)實現(xiàn)胞內(nèi)遞送的原理與進展，并重點介紹近年來出現(xiàn)的基于細胞擠壓實現(xiàn)物質(zhì)遞送的一系列微流控平臺的結(jié)構(gòu)與機理。

1 電穿孔

電穿孔技術(shù)是利用短高壓電脈沖可逆地破壞細胞膜，從而完成大分子物質(zhì)遞送的物理方法，是過去幾十年來最常用的基因遞送方法之一。這項技術(shù)最初是為轉(zhuǎn)基因開發(fā)的，后來逐漸應用于向不同類型的細胞遞送各種大分子物質(zhì)。在短時間的高壓電脈沖作用下，細胞膜會產(chǎn)生允許分子通過的小孔，當跨膜電位超過一定閾值時，可以實現(xiàn)細胞的物質(zhì)傳遞。其跨膜電位描述方程為

式中Vm為跨膜電位，f為細胞外場的形狀因子，Eext為外加電場強度，r為細胞半徑，?為r與Eext的極角[8]。

1982年Neumann等人首次使用電穿孔技術(shù)，成功地將DNA遞送至小鼠淋巴細胞內(nèi)[9]，開創(chuàng)了通過施加高強度電場提高細胞內(nèi)DNA遞送效率的簡易物理方式。20世紀80年代，體外電穿孔技術(shù)廣泛應用于物質(zhì)遞送，如將人體κ免疫球蛋白基因遞送至小鼠前B淋巴細胞[10]，將質(zhì)粒DNA、反義RNA遞送至植物細胞[11-12]以及將DNA遞送至細菌細胞[13-14]等。20世紀90年代開始，體內(nèi)電穿孔有了廣泛應用[15]，在肌肉[16]、皮膚[17]、肝臟[18]以及腫瘤[19-20]組織成功完成細胞內(nèi)的物質(zhì)遞送。目前，電穿孔技術(shù)仍被頻繁使用。與20年前的平臺相比，現(xiàn)代電穿孔技術(shù)提高了遞送效率，縮短了操作時間，提高了細胞的存活率和操作精度。2006年Saito通過電穿孔成功完成神經(jīng)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染[21]，在30 min內(nèi)完成對10個胚胎的轉(zhuǎn)染且存活率和轉(zhuǎn)染效率均在80%以上。2010年Geng等人開發(fā)了一種用于基因傳遞的流式電穿孔方法[22]，不同于傳統(tǒng)電穿孔裝置每次只能對體積約1 mL的少量樣品進行操作，該方法能以20 mL/min的高通量連續(xù)轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢(CHO-K1)細胞，轉(zhuǎn)染效率高達75%。2011年Boukany等人將電穿孔與納米技術(shù)結(jié)合起來，引入了一種納米通道電穿孔技術(shù)，可以將精確數(shù)量的生物分子遞送到活細胞中[23]。該裝置包括兩個由納米通道相連的微通道，一邊是細胞，另一邊是試劑。當在兩個微通道之間施加高壓脈沖時，細胞膜的有限區(qū)域會受到強電場的影響，從而允許精確數(shù)量的生物分子進入細胞質(zhì)?？偟膩碚f，電穿孔技術(shù)的優(yōu)勢在于可以高效完成基因或其他生物分子的胞內(nèi)遞送，但需要非常復雜的脈沖發(fā)生器來產(chǎn)生短高壓電脈沖，并且存在對細胞造成永久性損傷的可能性，難以保證穩(wěn)定的高存活率。

2 聲穿孔

聲穿孔技術(shù)是一種利用超聲波促進細胞內(nèi)給藥的方法。高振幅聲波誘導的空化被認為是利用聲波實現(xiàn)細胞內(nèi)傳遞的主要機制，穩(wěn)定空化和瞬態(tài)空化是兩種典型的空化形成模式[24]。穩(wěn)定空化是指被壓縮氣泡的穩(wěn)定振蕩產(chǎn)生的剪切力破壞細胞膜形成了瞬時孔隙，被遞送的基因或藥物得以成功進入細胞內(nèi)部。瞬態(tài)空化是指氣泡破裂產(chǎn)生的沖擊波作用于細胞膜，從而完成基因或藥物的遞送[25]。聲穿孔是可逆的非破壞性過程，細胞膜在超聲作用后的幾秒鐘內(nèi)就能自我修復。20世紀90年代，聲穿孔技術(shù)開始應用于細胞的基因遞送。Bao等人[26]和Kim等人[27]先后利用聲穿孔成功實現(xiàn)了質(zhì)粒DNA的體外遞送。之后，更多研究致力于利用聲穿孔進行DNA的體內(nèi)遞送，比如骨骼肌[28]、頸動脈[29]、腎[30-31]和心臟[32]等組織均檢驗到利用聲穿孔成功完成了DNA的轉(zhuǎn)染[33]。此外，超聲技術(shù)有希望進行癌癥或腫瘤的治療，藥物或基因載體可以注射到小鼠體內(nèi)，脈沖聚焦超聲隨后應用于腫瘤組織，通過破壞微泡和納米泡來觸發(fā)藥物釋放或改善藥物傳遞[34]。2011年，Yang等人通過聲穿孔將載有Fe3O4納米粒子的微泡釋放到腫瘤細胞[35]。使用這種方法，納米顆?？梢杂行覠o創(chuàng)地進入腫瘤細胞，并且可以通過調(diào)節(jié)聲波強度來控制遞送速率。總之，聲穿孔技術(shù)可以非破壞性且精準地完成局部給藥或基因遞送，其劣勢在于聲波的生成機制較為復雜，影響超聲結(jié)果的實驗參數(shù)太多，并且在聲穿孔過程中可能會產(chǎn)生復雜的生物效應。

3 微注射

單細胞微注射技術(shù)是使用納米針或納米線穿透細胞膜，直接將蛋白質(zhì)等非滲透大分子送入細胞內(nèi)精確位置的物質(zhì)遞送方式。2007年Chen等人發(fā)現(xiàn)通過單根多壁碳納米管，可以將蛋白質(zhì)包裹的量子點以納米級分辨率送入活的人體細胞。這種納米管不會造成明顯的細胞損傷，并且不需要載體溶劑便可將離散的分子遞送到細胞內(nèi)部[36]。2009年Yum等人使用氮化硼納米管將熒光量子點送入活細胞[37]，研究證明了單分散量子點會有選擇性地進入活細胞的細胞質(zhì)或細胞核。此后，Singhal等人報道了碳納米管內(nèi)窺鏡用于微創(chuàng)細胞內(nèi)探測、藥物遞送等一系列單細胞操作。這種內(nèi)窺鏡可以以大約100 nm的分辨率在不破壞細胞活性的情況下非常精確地進入細胞的特定區(qū)域[38]，還能夠以微創(chuàng)的方式將納米粒子和阿升(1 aL=10-18L)液體運輸?shù)骄_的位置。納米針注射具有給藥劑量控制精確、轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點，已廣泛應用于基礎(chǔ)研究和臨床實踐，但是其注射及后續(xù)分析僅限于單細胞水平，無法實現(xiàn)自動化高通量的物質(zhì)遞送，這一缺陷嚴重限制了該技術(shù)未來的臨床應用。

為了實現(xiàn)高通量細胞內(nèi)遞送，Kim等人首先演示了應用硅納米線(SiNWs)陣列的直接轉(zhuǎn)染方法[39]。該研究將人類胚胎腎(HEK 293T)細胞在預先涂有DNA的SiNWs上培養(yǎng)(圖1(a～b))，實驗中觀察到細胞可以被SiNWs穿透并實現(xiàn)HEK 293T細胞系的基因轉(zhuǎn)染，但是轉(zhuǎn)染效率低至不足10%。隨后Shalek等人證明了SiNWs如何穿透細胞膜，利用細胞可以健康生長在垂直SiNWs上將表面結(jié)合的外源性分子直接釋放到細胞質(zhì)中[40]。因為SiNWs上可以同時培養(yǎng)大量的細胞，所以該平臺可以在不需要化學修飾或病毒包裝的情況下，以高通量的方式將各種生物分子引入活細胞。2012年Melosh等人開發(fā)了空心氧化鋁納米管陣列[41]。納米管可以在細胞培養(yǎng)過程中穿透細胞膜，將蛋白質(zhì)或遺傳分子注入細胞(圖1(c～e))。隨后，該課題組在電穿孔平臺上裝備了納米管陣列。在電穿孔的輔助下，實現(xiàn)了高效的分子遞送，轉(zhuǎn)染效率可達80%，并保持90%以上的細胞存活率[42]。2022年Zhang等人對電穿孔納米管的生物安全性進行研究，綜合分析了經(jīng)歷數(shù)次納米管電穿孔后的細胞在增殖基因功能的變化(圖1(f～g))。結(jié)果表明，反復多次的納米管電穿孔對細胞沒有明顯的負面影響，這項工作證明了在細胞上重復進行納米管電穿孔的可行性[43]。綜上可見，納米管電穿孔是一種很有前途的藥物或分子遞送方式，但其制備工藝通常需要復雜的納米制造儀器及較高的操作要求，難以應用于大規(guī)模自動化的細胞內(nèi)藥物或分子遞送。

圖1 微納米線/管陣列裝置：(a～b)小鼠胚胎干細胞(mES)被硅納米線穿透的SEM圖像與共聚焦顯微鏡圖像；(c～e)通過納米管陣列實現(xiàn)生物分子胞內(nèi)遞送的典型設備的截面圖與此平臺對CPD細胞轉(zhuǎn)染時的SEM圖像(綠色)[41]；(f～g)納米管電穿孔器件與生物分子遞送機理示意圖[43]

4 細胞擠壓

細胞擠壓技術(shù)指的是細胞受到外力擠壓發(fā)生變形時，細胞膜上開啟力敏通道，基因或大分子等非滲透性轉(zhuǎn)染的物質(zhì)通過通道進入細胞內(nèi)部完成轉(zhuǎn)染的遞送方法。該技術(shù)控制物質(zhì)遞送的主要參數(shù)包括生物分子混合物流動時的壓力、流速，無量綱參數(shù)(如雷諾數(shù)、韋伯數(shù)等)以及作用時間等[44-45]。2008年Hallow等人將DU145前列腺癌細胞暴露在流體剪切力下，首次利用細胞擠壓的方法成功向細胞內(nèi)遞送了鈣黃綠素(0.62 kDa)、牛血清白蛋白(66 kDa)以及大分子量的葡聚糖(150～2 000 kDa)[46]。然而，該研究裝置將細胞在較短時間內(nèi)(如小于1 ms)暴露于一個較大剪切力(如大于2 000 dyne/cm2, 1 dyne=10-5N)下，轉(zhuǎn)染效率不足40%并且僅能維持約80%的存活率，這樣的結(jié)果證明該方法仍需改進。

2013年Sharei等人對細胞進行物理收縮來打開細胞膜進行物質(zhì)遞送。細胞被驅(qū)使注入僅有數(shù)微米收縮尺寸的微通道，由于微通道尺寸小于細胞直徑，細胞遭受擠壓打開細胞膜，從而使外源性物質(zhì)被動擴散到細胞質(zhì)中[47]。通道是利用光刻工藝在硅片上制造的，并使用耐熱玻璃層進行密封(圖2(a))。該裝置由45個寬度為48 μm，長度為10～40 μm的平行微通道組成，這有助于研究改變收縮幾何形狀對傳遞效率和細胞活力的影響，并行通道也防止了任何一個通道堵塞導致的設備故障。該研究假設當細胞通過一個最小尺寸小于細胞直徑的狹窄處時，細胞的快速機械變形會導致短暫的膜破裂并出現(xiàn)孔道，這些孔的大小和頻率將是細胞在收縮過程中所經(jīng)歷的剪切力和壓縮力的函數(shù)，在孔愈合前周圍培養(yǎng)基的物質(zhì)可以直接擴散到細胞質(zhì)中。實驗完成了熒光標記的3 kDa和70 kDa葡聚糖對人包皮成纖維細胞(NuFFs)、小鼠樹突狀細胞以及胚胎干細胞的轉(zhuǎn)染，流式細胞術(shù)顯示轉(zhuǎn)染效率達70%，增加收縮通道長度和減小收縮通道寬度都顯著提高同一流速時的遞送效率。隨后該研究測試了通過該平臺將不同類型的材料輸送到不同類型的細胞中，如將多糖、核酸、碳納米管等大分子遞送至小鼠的免疫細胞(如T細胞、B細胞、巨噬細胞等)[47]。之后，該課題組分析了通過收縮微通道細胞的質(zhì)膜恢復動力學數(shù)據(jù)[48]，指出在該收縮通道不犧牲細胞活力的情況下，該技術(shù)產(chǎn)生的細胞膜上通道直徑可能超過200 nm，且鈣離子對細胞膜愈合有著顯著影響，無鈣環(huán)境下膜愈合時間由30 s延長至5 min，提高約5倍的遞送效率。2018年Liu等人對細胞擠壓過程中細胞內(nèi)外的體積交換進行分析，對轉(zhuǎn)染前和壓縮期間的細胞模型進行模擬與實驗發(fā)現(xiàn)，當細胞受到壓縮力變形時，會導致部分細胞質(zhì)排出，去除外力后，細胞會吸收周圍介質(zhì)中的細胞外液來恢復自身的大小和形狀[49]。實驗表明，當細胞受到多次擠壓時，增加連續(xù)兩次擠壓之間的緩沖時間可以增強外液吸收和物質(zhì)遞送效果。

圖2 微通道實現(xiàn)細胞擠壓的裝置：(a)通過收縮微通道暫時打開細胞膜的裝置與機理示意圖；(b)實現(xiàn)細胞擠壓的微流控平臺、細胞壓力模擬與瞬時孔隙生成示意圖[47]；(c～d)單變形與雙重變形的細胞擠壓裝置，兩種變形通道SEM圖、細胞變形示意圖，以及該裝置對hASCs進行不同分子量FITC-dextran的轉(zhuǎn)染效率受微縮間距的影響[50]

2019年Modaresi等人設計了一種驅(qū)使細胞進行雙重變形的微流控平臺(圖2(c～d))，該研究開發(fā)的兩種微流控裝置，一個只允許單一變形，另一個允許雙重變形[50]。芯片的主體是基于SU-8軟光刻技術(shù)的PDMS(聚二甲基硅氧烷)材料，其中每個芯片上有7個分散區(qū)和12個擠壓區(qū)。兩種設計的分散區(qū)均含有直徑20 μm、高15 μm的PDMS柱、彼此之間相隔30 μm的PDMS柱陣列。對于擠壓區(qū)域，一種是使細胞定向通過20 μm收縮形成的微通道，造成單一變形；另一種通道兩側(cè)錯落收縮，微縮之間最短間隙為8 μm，造成細胞的雙重變形。該研究完成了Dex-FITC對人脂肪來源干細胞(hASCs)的轉(zhuǎn)染實驗，結(jié)果表明雙重變形設計比單一變形顯示出更高的遞送效率。該平臺適用于生物小分子的胞內(nèi)遞送，雙重變形的設計在保證較高的細胞活力(>80%)下具有高達85%的遞送效率。2021年Han等人優(yōu)化了微流控平臺上微通道設計(圖2(b))，在硅片上使用PDMS制作的器件包含14個相同的散射區(qū)和變形區(qū)，每個變形區(qū)內(nèi)有10行收縮微通道，每個微縮結(jié)構(gòu)在尺寸和形狀上都有所不同[51-52]。該研究在實驗上成功將單鏈向?qū)NA(sgRNAs)和Cas9轉(zhuǎn)染到各種類型的細胞中，未來或成為將CRISPR-Cas9高通量導入細胞的有效工具。

此外，許多研究通過調(diào)節(jié)細胞與流體在微流體裝置內(nèi)的流動，使單個細胞被拉伸或擠壓，流體擴散和對流的結(jié)合導致瞬態(tài)空隙的產(chǎn)生從而完成物質(zhì)遞送，這種利用流體動力實現(xiàn)細胞擠壓的方法也被稱為水穿孔。相較于收縮微通道，水穿孔的同一種平臺可以適用于不同尺寸形狀的細胞，并且已被證明能夠以高通量將不同的生物分子遞送至各種細胞中。2013年Adamo等人通過發(fā)射液體射流將生物分子輸送到懸浮細胞中[53]，該裝置使用光刻和深反應離子刻蝕(DRIE)制備，包括細胞流經(jīng)的通道、位于該通道頂部的噴嘴和包含轉(zhuǎn)染生物分子的流體室(圖3(a))。當細胞流經(jīng)微米尺寸的噴嘴下方時，壓力脈沖通過壓縮壓電膜施加到腔室上，將噴射出的少量轉(zhuǎn)染生物分子穿透并遞送至細胞中。2018年Deng等人報道了利用通道中流體的慣性流動，使細胞在T形結(jié)通道壁碰撞尖銳尖端形成短暫的膜孔，通過被動擴散實現(xiàn)生物分子的遞送[54]。芯片采用軟光刻技術(shù)制造，實驗包括三個步驟(圖3(b))：①使用注射泵將細胞和轉(zhuǎn)染材料注入通道；②流體的慣性將隨機對齊的細胞定位在通道的中線；③流動的細胞在包含尖銳尖端的T形結(jié)的通道壁上碰撞。這種細胞壁碰撞加上流體剪切能夠引起足夠的膜破壞，通過瞬態(tài)空隙將轉(zhuǎn)染材料被動擴散至細胞內(nèi)。通道壁上的尖端的存在確保了高效遞送所需的有效應力。該研究使用該裝置成功對MDA-MB-231細胞系轉(zhuǎn)染FITC-dextran(葡聚糖)(圖3(c～d))，在雷諾數(shù)(Re)為325時轉(zhuǎn)染效率達80%，并保持80%以上的細胞活力。隨著Re的增加，遞送效率提高，細胞活力降低。此外，該裝置還可有效遞送質(zhì)粒DNA、CRISPR-Cas9和DNA納米結(jié)構(gòu)等不同生物分子，并且單通道可達到每分鐘106個細胞的吞吐量。2020年Hur等人將該平臺進一步優(yōu)化，通道壁上的尖銳尖端被一個空腔取代，使細胞與液壁而不是PDMS尖端碰撞[55]，這種改進可以有效提高細胞的存活率并減輕了通道堵塞的問題。實驗成功向K562細胞內(nèi)遞送3～5 kDa FITC-dextran，在保證細胞存活率在90%以上時，得到高達90%的轉(zhuǎn)染效率。

圖3 微流控水穿孔的裝置[53]：(a)微流體噴射機理示意圖；(b)慣性微流體細胞水孔器(iMCH)進行胞內(nèi)遞送示意圖與高速顯微鏡下的細胞壁碰撞圖像；(c)iMCH在不同雷諾數(shù)下向MDA-MB-231遞送3 kDa FITC-dextran 18 h后的熒光和明場圖像；(d)iMCH對MDA-MB-231進行不同分子量FITC-dextran的轉(zhuǎn)染效率與存活率受雷諾數(shù)的影響

近年Kizer等人改良了碰撞壁型水孔微流控平臺[54]，并開發(fā)了一種非碰撞的微流控平臺進行水穿孔[56]。該平臺將含有細胞與遞送物質(zhì)的混合液從兩側(cè)同時注入，在微通道交叉口高速對流，通過對細胞的快速水動力剪切使細胞拉伸從而打開細胞膜上的瞬態(tài)孔隙(圖4(a～c))。該平臺完成外源物質(zhì)向細胞內(nèi)遞送的方式除了被動擴散，還存在擠壓過程中跨細胞膜的快速溶液交換，這種對流的介質(zhì)傳遞可以提高轉(zhuǎn)染效率。該研究實驗結(jié)果表明流速和Re都會影響該水孔平臺的轉(zhuǎn)染效率，隨著Re的增加，轉(zhuǎn)染效率有所提高，但存活率會降低。該研究將DNA折紙納米結(jié)構(gòu)成功遞送至K562、MDA-MB-231等多種細胞中，在每分鐘大于1.6×106個細胞的高通量下，對3～5 kDa的葡聚糖遞送時，存活率近80%，轉(zhuǎn)染效率可達90%。

圖4 兩種微流控水穿孔的裝置：(a～c)水穿孔誘導細胞實現(xiàn)基因或分子遞送的微流控水孔器(Hydroporator)設計與機理圖；(d)每7 μs下高速顯微鏡記錄的Hydroporator對細胞的擠壓過程照片[54]；(e)液滴擠壓平臺的微流控裝置與機理示意圖以及對K562細胞轉(zhuǎn)染3～5 kDa FITC-dextran的實驗圖片[57]

2021年Joo等人設計了一種液滴機械運作裝置，由包裹著細胞和生物分子的液滴通過整體收縮來實現(xiàn)分子遞送。這是一項具有創(chuàng)新性的研究(圖4(e))，載有細胞和生物分子的液體通過流動聚焦結(jié)構(gòu)生成細胞-生物分子液滴，當通過軟光刻制備的PDMS收縮微通道時液滴被擠壓，生物分子會通過對流和擴散介導的方式完成胞內(nèi)遞送[57]。因為遞送的目標分子被裝載在每個液滴中，微通道主要被運載油占據(jù)，所以需要的分子數(shù)量低，通道堵塞可以忽略不計。該研究以每分鐘106個細胞的高通量，成功對K562、KG-1等多種細胞完成了大分子量葡聚糖、996 nt mRNA以及7.9 kbp質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率高達95%。綜上所述，基于細胞擠壓的水穿孔技術(shù)具有高通量、高轉(zhuǎn)染效率以及高細胞活性等優(yōu)點，是一個具有巨大潛力的相對較新的研究領(lǐng)域。然而水穿孔技術(shù)目前僅局限于懸浮細胞類型，遞送過程不均勻并且大多數(shù)微通道存在細胞堵塞，這些問題可能會限制其可用性[58]。

5 其他物理刺激輔助

細胞內(nèi)物質(zhì)遞送的方法除了電穿孔、聲穿孔、微注射和細胞擠壓外，還有其他引發(fā)細胞外部刺激的物理方法用來完成物質(zhì)遞送，可大致分為內(nèi)部刺激與外部刺激[59]。對于內(nèi)部刺激，局部pH值、溫度等微環(huán)境的差異是主要的刺激因素[60]。如固體腫瘤的pH值(pH≈6.5)低于血液或正常組織(pH=7.4)，因此低pH插入肽(pHLIP)等pH敏感分子可用于靶向酸性腫瘤組織[61]，這種pH差異還可以用于設計pH敏感囊泡，以增加腫瘤區(qū)域內(nèi)的細胞內(nèi)遞送的效率。對于外部刺激，磁、光和熱都可以作為刺激因素[62]，一定程度上影響細胞的物質(zhì)遞送。如Zhong等人利用激光在介質(zhì)中的局部加熱效應，形成兩個串聯(lián)的氣泡，二者相互作用獲得的二次Bjerknes力可產(chǎn)生速度達50 m/s的射流，其作用于細胞膜從而完成物質(zhì)遞送[63]。該方法的射流速度和流體剪切力可以精確控制，在細胞膜上形成的孔洞直徑較大(幾百納米乃至微米量級)，但由于裝置比較復雜，目前還只適用于單細胞操作。

6 總結(jié)與展望

微納米技術(shù)的發(fā)展為外源性物質(zhì)的胞內(nèi)遞送打開了新的視野，相較于傳統(tǒng)生物方法，這些操作平臺的成本低、生物相容性好，能夠?qū)Ω鞣N細胞類型進行高效的高通量遞送。本文總結(jié)了各種基于膜破壞的方式來進行物質(zhì)遞送的物理方法。這些技術(shù)有的可用于低至100 nm的高精度單細胞藥物或分子遞送，也有的用于在每分鐘數(shù)百萬個細胞的高通量下進行藥物或分子遞送，很多技術(shù)目前已經(jīng)取得了實質(zhì)性的進展。例如，可以進行單細胞操作并有較高轉(zhuǎn)染效率的微注射和微針陣列的技術(shù)，轉(zhuǎn)染效率高、成本低的細胞擠壓和水穿孔技術(shù)，可以實現(xiàn)高通量下較高大分子轉(zhuǎn)染效率的機械操作與電穿孔相結(jié)合的技術(shù)等。然而，目前的研究仍難以將超大生物分子、病原體等轉(zhuǎn)染到各種類型的細胞中，并且現(xiàn)有的實驗主要用于體外研究，直接完成體內(nèi)遞送的研究較少且有嚴格的局限性。所以能夠?qū)崿F(xiàn)高通量、低成本、較好的轉(zhuǎn)染效率和細胞活性以及可直接應用于體內(nèi)的遞送技術(shù)或成為未來研究發(fā)展的方向。相信基于微納米技術(shù)的體內(nèi)外藥物或分子遞送以及進一步的實際臨床應用將會迎來一個光明的未來。