吳世芳

青島職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與化工學(xué)院，山東 青島 266555

微生物發(fā)酵作為重要的生物技術(shù)，在工業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)研究領(lǐng)域占據(jù)核心地位。從制藥到食品工業(yè)，微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝物質(zhì)對最終產(chǎn)品的質(zhì)量和特性具有決定性影響。了解和監(jiān)測這些關(guān)鍵代謝物的種類和濃度，是優(yōu)化發(fā)酵過程、提高產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量的基礎(chǔ)。在此背景下，高效液相色譜（HPLC）技術(shù)作為一種強(qiáng)大的分析工具，能夠提供一種精確、高效的方法來分析和量化這些代謝物。HPLC 技術(shù)因其高分辨率、高靈敏度和良好的定量性能，在生物樣品分析中得到了廣泛應(yīng)用。相關(guān)人員應(yīng)用HPLC 技術(shù)可以精準(zhǔn)識別和測定微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的各種代謝物，包括酸類、醇類、氨基酸和多肽等。這些代謝物不僅揭示了微生物的生長和代謝狀態(tài)，而且也是優(yōu)化發(fā)酵工藝和提升產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)[1]。本文基于高效液相色譜（HPLC）對微生物發(fā)酵過程中的關(guān)鍵代謝物展開分析，以期為工業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)研究提供有價(jià)值的參考。

1 高效液相色譜(HPLC)技術(shù)概述

1.1 HPLC 的基本原理

高效液相色譜（HPLC）是一種強(qiáng)大的分析技術(shù)，是基于分子在固定相（色譜柱內(nèi)部的固體材料）和流動(dòng)相（通過色譜柱流動(dòng)的液體）之間的分配或吸附差異來實(shí)現(xiàn)分離的[2]。在HPLC 中，樣品首先會溶解在流動(dòng)相中，然后被注入色譜系統(tǒng)，流動(dòng)相攜帶樣品通過色譜柱時(shí)，不同組分會根據(jù)其對固定相的親和力及其在固定相和流動(dòng)相之間相互作用的差異，在色譜柱中以不同的速率前進(jìn)，從而實(shí)現(xiàn)分離。

固定相是色譜柱的核心，通常由微小顆粒組成，如硅膠或其他聚合物材料等。這些顆粒的表面可以根據(jù)目標(biāo)分析物的特性加以改性，例如，對于疏水性分子的分離，常使用疏水性的固定相材料；反之，對于極性分子，則采用更具親水性的固定相。流動(dòng)相的選擇也是分析過程中的關(guān)鍵，其組成成分（包括溶劑類型和比例、pH 和離子強(qiáng)度）會直接影響樣品組分的溶解度和遷移速度。在樣品通過色譜柱后，不同組分會依次從色譜柱出口流出，并進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測。HPLC 中常用的檢測器有紫外—可見光譜檢測器、熒光檢測器和質(zhì)譜檢測器等。這些檢測器可以提供關(guān)于樣品組分的定量和定性信息，如濃度、化學(xué)結(jié)構(gòu)和相對分子質(zhì)量等。通過調(diào)整色譜條件（如流動(dòng)相的組成、色譜柱的類型和溫度、流速等），HPLC 能適應(yīng)不同樣品的需求，實(shí)現(xiàn)高效、精確的分析。

1.2 HPLC 在生物樣品分析中的優(yōu)勢與挑戰(zhàn)

在生物樣品分析領(lǐng)域，高效液相色譜（HPLC）展現(xiàn)了顯著優(yōu)勢。首先，HPLC 技術(shù)的高分辨率使其能有效地分離出生物樣品中的復(fù)雜混合物，如蛋白質(zhì)、核酸、小分子代謝物和生物堿等。這對于生物樣品中普遍存在的大量類似化合物的鑒定和定量至關(guān)重要。其次，HPLC 技術(shù)的多樣化檢測器選項(xiàng)（如紫外—可見光譜檢測器、熒光檢測器和質(zhì)譜檢測器等）提供了多種定量和定性分析的方法，增強(qiáng)了其應(yīng)用的廣泛性和靈活性[3]。上述這些優(yōu)勢使HPLC 成為了生物醫(yī)學(xué)研究、藥物開發(fā)、臨床診斷和食品安全檢測等多個(gè)領(lǐng)域的重要工具。然而，HPLC 在生物樣品分析中也面臨諸多挑戰(zhàn)。首先，生物樣品的復(fù)雜性往往要求更高級別的樣品準(zhǔn)備工作，如蛋白質(zhì)的去除、復(fù)雜樣品的前處理和富集等，增加了分析的時(shí)間和難度。其次，生物樣品中的目標(biāo)分析物常常穩(wěn)定性差且易受環(huán)境影響。這就要求在整個(gè)HPLC 分析過程中采取特殊的操作條件和注意事項(xiàng)，以確保樣品的完整性和分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 微生物發(fā)酵過程及關(guān)鍵代謝物

2.1 微生物發(fā)酵過程的概述

微生物發(fā)酵是一個(gè)涉及多種微生物，如細(xì)菌、酵母和霉菌等，通過代謝轉(zhuǎn)化有機(jī)物產(chǎn)生能量的生物化學(xué)過程。在發(fā)酵過程中，微生物在缺氧或厭氧條件下，通過代謝途徑分解有機(jī)底物，產(chǎn)生能量、代謝中間體和一系列次級代謝產(chǎn)物。該過程分為幾個(gè)關(guān)鍵階段，分別為底物的吸收和運(yùn)輸、代謝途徑的活化、能量的產(chǎn)生和代謝產(chǎn)物的積累。在吸收階段，微生物通過細(xì)胞膜將底物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)部。在代謝途徑中，如糖酵解途徑或三羧酸循環(huán)途徑等，底物被進(jìn)一步分解，產(chǎn)生能量、還原當(dāng)量和一系列代謝中間體。這些中間體不僅是細(xì)胞生長和維持正常生理功能的基礎(chǔ)，也是許多重要工業(yè)產(chǎn)品，如抗生素、酶和生物燃料的前體。

控制和優(yōu)化微生物發(fā)酵過程是工業(yè)生物技術(shù)中的核心。通過調(diào)節(jié)發(fā)酵條件，如溫度、pH、氧氣供應(yīng)和底物質(zhì)量濃度，可以影響微生物的生長速率和代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。此外，通過基因工程和代謝工程技術(shù)，可以改造微生物的代謝途徑，提高特定代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，生產(chǎn)新型生物化合物。

2.2 發(fā)酵過程中的關(guān)鍵代謝物種類

微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的關(guān)鍵代謝物種類多樣，它們不僅是微生物生長和維持生理功能的必需物質(zhì)，而且也是許多工業(yè)應(yīng)用的重要產(chǎn)物。一方面，包括乙醇、乳酸、丁酸和醋酸等最基本的代謝物通常為能量代謝的直接產(chǎn)物，在許多類型的發(fā)酵過程中都能找到。例如，乙醇是酵母在厭氧條件下發(fā)酵糖類時(shí)的主要產(chǎn)物，被廣泛應(yīng)用于釀酒和生物燃料生產(chǎn)[4]。乳酸是乳酸菌發(fā)酵過程的主要產(chǎn)物，主要應(yīng)用于食品工業(yè)和生物材料制造。另一方面，除了這些基本代謝產(chǎn)物，微生物發(fā)酵還能產(chǎn)生一系列次級代謝物，如抗生素、維生素、酶和色素等。這些次級代謝物通常在微生物生長后期產(chǎn)生，對微生物自身而言非必需產(chǎn)物，但在人類醫(yī)藥和工業(yè)領(lǐng)域具有極高的應(yīng)用價(jià)值。

2.3 代謝物在發(fā)酵過程中的作用

在微生物發(fā)酵過程中，代謝物不僅涉及能量產(chǎn)生和細(xì)胞生長，還會對環(huán)境適應(yīng)性和發(fā)酵效率產(chǎn)生直接影響。一方面，初級代謝物是能量轉(zhuǎn)換和細(xì)胞生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，它們支持細(xì)胞的生長、繁殖以及對環(huán)境變化的快速響應(yīng)。另一方面，次級代謝物雖然不直接參與基本的生命過程，但卻在微生物適應(yīng)環(huán)境和生物合成特定有機(jī)物方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。例如，產(chǎn)生的某些抗生素和生物活性分子可以幫助微生物在競爭激烈的環(huán)境中生存，同時(shí)也為醫(yī)藥和食品工業(yè)提供了重要的原料。因此，理解和調(diào)控發(fā)酵過程中的代謝物，對于優(yōu)化產(chǎn)物產(chǎn)量、提高工業(yè)生產(chǎn)效率以及開發(fā)新的生物工藝具有重要意義。

3 實(shí)驗(yàn)分析

3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

本實(shí)驗(yàn)旨在分析特定微生物發(fā)酵過程中的關(guān)鍵代謝物。實(shí)驗(yàn)選取了酵母菌株作為微生物模型。為了培養(yǎng)酵母菌，準(zhǔn)備含有葡萄糖的基礎(chǔ)營養(yǎng)培養(yǎng)基，確保足夠的碳源供發(fā)酵過程使用。培養(yǎng)過程在恒溫?fù)u床上進(jìn)行，溫度控制在30 ℃左右，pH 維持在5.0～5.5，以模擬最佳發(fā)酵條件。

實(shí)驗(yàn)分為幾個(gè)關(guān)鍵階段，分別為接種、培養(yǎng)、取樣和分析。首先，在無菌條件下將酵母菌接種到培養(yǎng)基中，然后在搖床上進(jìn)行培養(yǎng)。發(fā)酵過程中定期取樣，以監(jiān)控關(guān)鍵代謝物的濃度變化。取樣后，通過對樣品進(jìn)行離心處理，去除細(xì)胞和其他懸浮物。隨后，上清液用于HPLC 分析，以定量主要代謝物，如乙醇、甘油和有機(jī)酸等。HPLC 分析前的樣品準(zhǔn)備包括過濾和適當(dāng)稀釋，以適應(yīng)色譜柱和檢測器的要求。根據(jù)目標(biāo)代謝物的化學(xué)性質(zhì)，選擇合適的色譜柱和流動(dòng)相。通過這一系列嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)步驟和方法，本實(shí)驗(yàn)旨在全面評估特定酵母菌株發(fā)酵過程中代謝物的動(dòng)態(tài)變化，為理解微生物發(fā)酵機(jī)制和優(yōu)化發(fā)酵工藝提供科學(xué)依據(jù)。

3.2 發(fā)酵過程中代謝物的變化分析

為了詳細(xì)分析發(fā)酵過程中的代謝物變化，對酵母菌株在不同發(fā)酵階段（接種后12 h、24 h、48 h 和72 h）的代謝物進(jìn)行了測定。關(guān)鍵代謝物包括乙醇、甘油、乳酸和有機(jī)酸等，代謝物濃度的對比分析如表1 所示。

表1 代謝物濃度的對比分析 單位：mg/L

隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，乙質(zhì)量醇濃度顯著上升，反映了酵母菌對糖類的代謝活動(dòng)；甘油和乳酸的質(zhì)量濃度也隨時(shí)間流逝而輕微上升，表明了這些代謝物在發(fā)酵過程中的副產(chǎn)物角色；有機(jī)酸質(zhì)量濃度的增加則與酵母菌的次級代謝有關(guān)。這些數(shù)據(jù)的變化趨勢表明了酵母菌在發(fā)酵過程中的代謝狀態(tài)。乙醇質(zhì)量濃度顯著增加體現(xiàn)了糖類的有效轉(zhuǎn)化，而甘油和乳酸的產(chǎn)生則與厭氧條件下代謝途徑的調(diào)整有關(guān)，有機(jī)酸的產(chǎn)生則與細(xì)胞生理狀態(tài)的變化和環(huán)境應(yīng)激有關(guān)。

3.3 結(jié)果討論與意義

實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)，分析了微生物發(fā)酵過程中的關(guān)鍵代謝物，結(jié)果顯示出明顯的代謝物變化趨勢。特別是乙醇質(zhì)量濃度的顯著增加，不僅證明了酵母菌在糖類代謝過程中的效率，而且也凸顯了HPLC 在精確測量和監(jiān)控發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物方面的能力。此外，甘油和乳酸的逐漸積累為理解微生物在不同環(huán)境壓力下的生理響應(yīng)提供了有價(jià)值的信息。這些發(fā)現(xiàn)對于優(yōu)化工業(yè)發(fā)酵過程，具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

本文基于高效液相色譜（HPLC）技術(shù)，分析了微生物發(fā)酵過程中的關(guān)鍵代謝物，展現(xiàn)了該技術(shù)在微生物代謝分析領(lǐng)域的高效性和準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，乙醇、甘油、乳酸和有機(jī)酸等代謝物在發(fā)酵過程中發(fā)生了明顯的質(zhì)量濃度變化，為理解酵母菌在不同發(fā)酵階段的代謝狀態(tài)提供了參考。這些發(fā)現(xiàn)不僅揭示了微生物代謝過程的復(fù)雜性，也為優(yōu)化工業(yè)發(fā)酵過程提供了重要的科學(xué)依據(jù)。總之，HPLC 作為一種強(qiáng)大的分析工具，在未來的微生物發(fā)酵和生物工程研究中將繼續(xù)發(fā)揮關(guān)鍵作用。