田 雨，周鵬飛，吳海平

中輕檢驗認(rèn)證有限公司，北京 100016

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）又稱綠膿桿菌，為革蘭氏陰性桿菌，屬于專性需氧非發(fā)酵菌類假單胞菌屬，廣泛分布于自然界的水、土壤、空氣中，存在于人和動物的皮膚、肌體、呼吸道和消化道中。當(dāng)該菌在特定條件下的數(shù)量超過人體正常的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)范圍時，會引起急性腸道炎、腦膜炎、敗血癥和皮膚炎癥等疾病，是一種常見的條件致病菌。鑒于銅綠假單胞菌的致病性，我國飲用水標(biāo)準(zhǔn)GB 19298-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)包裝飲用水》和飲用礦泉水標(biāo)準(zhǔn)GB 8537-2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)飲用天然礦泉水》對銅綠假單胞菌的限量為每250 mL 水樣中銅綠假單胞菌不得檢出。

目前對飲用水中銅綠假單胞菌的檢測，主要使用GB 8538-2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)飲用天然礦泉水檢驗方法》[1]中的濾膜法（以下簡稱GB 8538-2022 法），即觀察CN 瓊脂平板上生長的可疑菌落的形態(tài)并對其進(jìn)行生化反應(yīng)確證，確認(rèn)該平板上是否存在銅綠假單胞菌陽性菌株。除此之外，一些行業(yè)檢測標(biāo)準(zhǔn)及研究中還兼用其他檢驗方法[2-4]來確認(rèn)菌株是否為銅綠假單胞菌。其中，細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)是常見的菌株鑒定手段，其中常用的鑒定系統(tǒng)包括HK-MID 細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)和VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)[5]。與按細(xì)菌生化反應(yīng)來鑒定其種屬的檢驗方法相比，基因測序更為準(zhǔn)確[6]。而在以基因測序的方法鑒定銅綠假單胞菌的研究中，除了選擇某段特定基因序列設(shè)計的引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增后再測序外[7]，16S rRNA 基因測序也被廣泛運用[8-9]。在以往應(yīng)用細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)和基因測序等眾多手段檢測銅綠假單胞菌的研究中，大多數(shù)研究的重點在于檢驗方法的準(zhǔn)確性與時效性，便于選擇更準(zhǔn)確、高效的方法來鑒別目標(biāo)菌株，但對GB 8538-2022 方法在CN 瓊脂平板上分離出的非銅綠假單胞菌的細(xì)菌沒有過多深入研究。本研究對采用GB 8538-2022 法在CN 瓊脂平板上生長的10株可疑菌落的菌株進(jìn)行了檢測，同時采用HK-MID細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)、VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)和16S rRNA 基因測序進(jìn)行了進(jìn)一步的鑒定研究，最終以16S rRNA 基因測序的結(jié)果作為判定依據(jù)，來確認(rèn)菌株的種屬。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用菌株

標(biāo)準(zhǔn)菌株：銅綠假單胞菌ATCC 27853、銅綠假單胞菌CICC 21630，均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；樣品菌株1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 均來自飲用水樣品，用GB 8538-2022 法將其從CN 瓊脂平板上分離，目前保藏于國家食品監(jiān)督檢驗中心微生物實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

CN 瓊脂假單胞菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基、綠膿菌素測定用培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、乙酰胺肉湯、鈉氏試劑、氧化酶試劑，均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；十六烷三甲基溴化銨瓊脂、乙酰胺瓊脂、SCDLP 液體培養(yǎng)基，均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；16S rRNA 基因通用引物27F （5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’） 和1492R （5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’）：由華大基因合成；PCR 擴(kuò)增及凝膠電泳所用試劑，均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器及耗材

WFH-203B 三用紫外分析儀產(chǎn)自上海馳唐電子有限公司；HK-MID 細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)：配GN A+B 革蘭氏陰性桿菌鑒定條產(chǎn)自廣東環(huán)凱生物科技有限公司；VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)：配套革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡（VITEK 2 GN卡）以及生理鹽水和一次性透明塑料試管均產(chǎn)自法國梅里埃公司；DensiCHEK plus 比濁儀產(chǎn)自法國梅里埃公司；BioDrop uLite 超微量核酸蛋白測定儀產(chǎn)自英國柏點公司；TProfessional Trio PCR 儀產(chǎn)自德國耶拿分析儀器股份公司；JY300C 電泳儀及電泳槽產(chǎn)自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；QUANTUMST5 全自動凝膠成像系統(tǒng)產(chǎn)自北京五洲東方科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化

將實驗室保藏的標(biāo)準(zhǔn)菌株及樣品菌株，分別劃線接種于假單胞菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基/CN 瓊脂、十六烷三甲基溴化銨瓊脂和乙酰胺瓊脂三種不同的培養(yǎng)基平板上，36 ℃培養(yǎng)48 h。

1.2.2 菌落形態(tài)觀察

觀察三種培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，必要時將其置于紫外線下觀察，判斷菌落是否存在熒光。對于三種培養(yǎng)基上生長的疑似菌落，按照GB 8538-2022 法進(jìn)行生化反應(yīng)確證試驗。

1.2.3 生化反應(yīng)確證試驗

產(chǎn)氨試驗：將CN 瓊脂上發(fā)熒光、非藍(lán)色且非綠色的菌落，或不發(fā)熒光、紅褐色菌落純培養(yǎng)物接種到乙酰胺液體培養(yǎng)基中，接種乙酰胺肉湯，36 ℃培養(yǎng)24 h 后滴加1～2 滴鈉氏試劑，10 s 內(nèi)檢查試管的顏色變化，若表現(xiàn)出從黃色到磚紅色的顏色變化，則結(jié)果為陽性，否則為陰性。

42 ℃生長試驗：將CN 瓊脂上發(fā)熒光、非藍(lán)色且非綠色菌落的純培養(yǎng)物接種到營養(yǎng)瓊脂平板上，42℃培養(yǎng)48 h，能生長的為陽性結(jié)果，否則為陰性。

1.2.4 HK-MID 細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)

氧化酶試驗：取2～3 滴氧化酶試劑于無菌平皿內(nèi)的潔凈濾紙上，用一次性塑料接菌環(huán)挑取培養(yǎng)物涂抹在濾紙上，10 s 內(nèi)顯示為深藍(lán)紫色的為陽性反應(yīng)。

GN A+B 革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑條進(jìn)行鑒定：挑取單菌落至營養(yǎng)瓊脂平板上，劃線分離，36 ℃培養(yǎng)24 h 后，自營養(yǎng)瓊脂平板上挑取1 個新鮮菌落至5 mL 無菌0.85%的氯化鈉溶液中，混合均勻。將制得的菌懸液滴加至GN A+B 的鑒定試劑條上，36℃培養(yǎng)48 h 后觀察并記錄相關(guān)反應(yīng)，在Microgen ID軟件上讀取鑒定結(jié)果。

1.2.5 VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)

將菌液滴加至HK-MID 細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)的同時，再從36 ℃培養(yǎng)24 h 的營養(yǎng)瓊脂平板上挑取單菌落，放入含有3 mL0.9%氯化鈉溶液的一次性透明塑料試管中，制成濁度為0.48～0.61 的均勻菌懸液。將試管放置在VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)的載卡架上，將VITEK 2 GN 卡導(dǎo)管插入菌懸液中。按VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)的操作說明書，對測菌懸液進(jìn)行充填、裝載，并在VITEK 2 Systems 軟件中進(jìn)行設(shè)定，次日觀察鑒定結(jié)果。

1.2.6 16S rRNA 基因測序

自營養(yǎng)瓊脂平板上挑取1 個新鮮菌落至SCDLP 液體培養(yǎng)基中，36 ℃培養(yǎng)至培養(yǎng)基渾濁。按照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說明書上的操作步驟，提取標(biāo)準(zhǔn)菌株和樣品菌株的DNA。在確認(rèn)DNA純度和濃度均符合PCR 擴(kuò)增要求后，使用16S rRNA 基因通用引物27F 和1492R 對菌株的DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為：引物27F 和1492R 各1 μL，10×Easy Taq Buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，High Pure dNTP （2.5mM）2 μL，Bovine Serum Albumin 0.3 μL，Easy Taq DNA Polymerase 0.2 μL，DNA 模板2 μL，DNase/RNase-free Deionized water 16 μL，合計總體積25 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，該流程共循環(huán)30 次；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增完成后，用凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，并將具有16S rRNA 基因片段的目的條帶送至華大基因進(jìn)行基因測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株及樣品菌株的菌落形態(tài)及初步生化反應(yīng)確證試驗結(jié)果

目前標(biāo)準(zhǔn)方法中銅綠假單胞菌的選擇性培養(yǎng)基主要為CN 瓊脂[1,10]、十六烷三甲基溴化銨瓊脂[11-12]和乙酰胺瓊脂[11]，如果樣品菌株僅能在CN 瓊脂上生長，而不能在十六烷三甲基溴化銨瓊脂、乙酰胺瓊脂培養(yǎng)基上生長，則表明CN 瓊脂的選擇性較差。對10 個樣品菌株及作為陽性對照的2 個銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌落形態(tài)進(jìn)行觀察及初步生化確證試驗的結(jié)果見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)菌株和樣品菌株的菌落形態(tài)及初步生化試驗結(jié)果

由表1 可知，2 個標(biāo)準(zhǔn)菌株和10 個樣品菌株均能在三種培養(yǎng)基上生長，說明本試驗中CN 瓊脂培養(yǎng)基的選擇性較好。其中只有2 個標(biāo)準(zhǔn)菌株和樣品菌株9、10 的菌落形態(tài)符合GB 8538-2022 法中銅綠假單胞菌的特征形態(tài)，結(jié)合產(chǎn)氨試驗和42 ℃生長試驗結(jié)果，可判定樣品菌株9、10 為銅綠假單胞菌，樣品菌株1～8 中的疑似菌落為非銅綠假單胞菌。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株及樣品菌株氧化酶試驗結(jié)果

按HK-MID 細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)說明書的要求，首先對待測菌株進(jìn)行氧化酶試驗以確定使用鑒定試劑條的種類。10 個樣品菌株及2 個標(biāo)準(zhǔn)菌株的氧化酶試驗結(jié)果見表1。由表1 可知，10 個樣品菌株及2個標(biāo)準(zhǔn)菌株的氧化酶試驗結(jié)果均為陽性，因此選擇GN A+B 革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑條進(jìn)行后續(xù)鑒定。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株及樣品菌株的PCR 產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

為了知曉PCR 產(chǎn)物是否含有目的基因片段，需要先對其進(jìn)行凝膠電泳測定，10 個樣品菌株及2 個標(biāo)準(zhǔn)菌株的PCR 產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)菌株和樣品菌株P(guān)CR 產(chǎn)物的凝膠電泳圖

由圖1 可知，樣品菌株1～10 及2 個標(biāo)準(zhǔn)菌株的PCR 產(chǎn)物在1 500 bp 處均有清晰明亮的條帶，證明已成功擴(kuò)增出了可用于測序的16S rRNA 基因片段，可進(jìn)行下一步的基因測序。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)菌株及樣品菌株的HK-MID 細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)、VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)及16S rRNA 基因測序的鑒定結(jié)果對比

為了確認(rèn)10 個樣品菌株的種屬，運用HK-MID細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)、VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)及16S rRNA 基因測序三種不同的微生物鑒定方法，對樣品菌株進(jìn)行檢測，并以標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 27853 和CICC 21630 為陽性對照。結(jié)果見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)菌株及樣品菌株的三種鑒定方法鑒定結(jié)果對比

由表2 可知，經(jīng)過上述三種鑒定方法的檢測，標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 27853、CICC 21630 和樣品菌株9、10均被判定為銅綠假單胞菌，且可能性都在90%以上，結(jié)果與GB 8538-2022 法的判定結(jié)果一致。說明三種鑒定方法均可用于鑒定飲用水中的銅綠假單胞菌。

然而以16S rRNA 基因測序結(jié)果作為最終判定依據(jù)進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，HK-MID 細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)將樣品菌株1、4～8 共六株菌均被誤判為莫拉氏菌屬（Moraxella.spp）。同時，將屬于惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）的樣品菌株2、3 誤判為銅綠假單胞菌。造成該現(xiàn)象的原因推測為：廣東環(huán)凱生物科技有限公司提供的《HK-MID 革蘭氏陰性桿菌生化鑒定系統(tǒng)使用說明書》的數(shù)據(jù)表中，沒有代爾夫特菌屬（Delftia） 和嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）的相關(guān)數(shù)據(jù)，導(dǎo)致樣品菌株1、4～8 被誤判為莫拉氏菌屬。

與HK-MID 細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)相比，梅里埃公司的VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)不僅可明確將食酸代爾夫特菌（Delftia acidovorans）、嗜麥芽窄食單胞菌與莫拉氏菌屬區(qū)分開，還正確鑒定出了樣品菌株2、3 為惡臭假單胞菌。對于樣品菌株1，VITEK 2 Compact 的鑒定結(jié)果為食酸代爾夫特菌（Delftia acidovorans），而16S rRNA 基因測序的結(jié)果顯示該菌種為Delftia sp. WY8、Delftia lacustris 和Delftia tsuruhatensis，雖然菌種不同，但均為代爾夫特菌屬細(xì)菌?？梢?，VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)的檢測范圍更加廣泛，鑒定結(jié)果也更精準(zhǔn)。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)菌株及樣品菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

為了更直觀地表達(dá)上述細(xì)菌之間的親緣關(guān)系，首先將2 個標(biāo)準(zhǔn)菌株和10 個樣品菌株用16S rDNA的測序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 比對，得出了具體的所屬菌種。并采用MEGA 軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹呈現(xiàn)其結(jié)果，見圖2。

圖2 樣品菌株（sample）和標(biāo)準(zhǔn)菌株（Pseudomonas putida）的系統(tǒng)發(fā)育樹

從圖2 可以看出，同屬銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 27853、CICC 21630 和樣品菌株9、10，與同屬惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）的樣品菌株2、3 的親緣關(guān)系最近，與同屬嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）的樣品菌株4～8 的親緣關(guān)系次之，而與代爾夫特菌屬（Delftia）樣品菌株1 的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

3 結(jié)論與討論

從研究結(jié)果可知，由于HK-MID 細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)中的GN A+B 革蘭氏陰性桿菌鑒定條的生化反應(yīng)孔數(shù)量較少、判定信息不足、數(shù)據(jù)庫細(xì)菌種類不夠全面等，導(dǎo)致該系統(tǒng)的誤判幾率很大，而VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)包含更多詳細(xì)的生化反應(yīng)信息和精密儀器，其鑒定結(jié)果更加精確，可用來進(jìn)行最終的菌株判定。同時，VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)及16S rRNA 基因測序均可以對疑似菌株進(jìn)行精確鑒定。

值得注意的是，這些疑似銅綠假單胞菌的菌株中包含食酸代爾夫特菌、惡臭假單胞菌和嗜麥芽窄食單胞菌等細(xì)菌。其中，食酸代爾夫特菌可能會使免疫力低下的病患產(chǎn)生傷口感染及多種炎癥[13]；惡臭假單胞菌也是條件致病菌[7]，且發(fā)生過醫(yī)院感染的情況[14]；嗜麥芽窄食單胞菌也會引起多種炎癥與感染[15-19]，其中最常見的是血液和呼吸道感染[20-23]，這兩種感染的發(fā)病率和死亡率較高[24-25]。因此，出于對消費者健康和公共衛(wèi)生安全的考慮，在包裝飲用水、礦泉水乃至水源水中，除了銅綠假單胞菌之外，其他條件致病菌（如代爾夫特菌屬、惡臭假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌等）也應(yīng)當(dāng)受到重視，相關(guān)部門適當(dāng)監(jiān)督并控制這些細(xì)菌的造成污染非常有必要。