張小鳳，曾穎欣，周麗萍，黃麗華，凌海燕

肇慶學(xué)院，廣東 肇慶 526061

現(xiàn)代藥理研究表明，艾葉中富含的黃酮類化合物具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等藥理活性[1]。本篇初步探究艾葉黃酮類化合物的提取方法及其相應(yīng)的抗氧化活性作用，以期為進(jìn)一步優(yōu)化提取艾葉中黃酮類化合物的工藝條件和抗菌活性作用的研究提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

艾新鮮葉片：采摘于肇慶學(xué)院生物園。純水、DPPH、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、磷酸緩沖液（0.2 mol/L）、無水乙醇、TCA、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH、K3[Fe（CN）6]、FeCl3、CH3OH、FeSO4、H2O2、C7H6O3等。

電熱鼓風(fēng)干燥箱、粉碎機(jī)、電子天平、超聲波清洗器、可見分光光度計、循環(huán)水真空泵等。

1.2 方法

1.2.1 工藝提取流程

將艾葉清洗、擦干，稱量其鮮重（FW）；烘干，稱量其干重（DW）；按以下公式計算艾葉含水量（WC）：

艾葉粉碎→稱取粉末→加入乙醇溶液→浸泡4 h→超聲波提取→減壓抽濾→艾葉總黃酮提取液→進(jìn)行含量測定和抗氧化活性測定及分析。

1.2.2 艾葉黃酮的提取

保持其他條件不變，測定艾葉黃酮的提取量受浸取液乙醇體積分?jǐn)?shù)（40%、50%、60%、70%、80%）、料液比（1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45 g/mL）、超聲提取時間（10、20、30、40、50 min）各因素的影響。

為減少繁多的實(shí)驗(yàn)次數(shù)，使用以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的正交法，選擇不同的正交試驗(yàn)因素與水平，詳見表1，以此優(yōu)化提取工藝條件并進(jìn)行相應(yīng)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

1.2.3 艾葉黃酮含量的測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為試樣，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 比色法并測定吸光度值，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取不同提取條件處理的0.5 mL 艾葉黃酮提取液，將其移到25 mL 容量瓶里并加入6 mL 純水，艾葉黃酮的測定同樣按照比色法測定其吸光度值，艾葉黃酮的含量可代入得到的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中算出。

1.2.4 艾葉黃酮的抗氧化活性

測定不同質(zhì)量濃度（0.125、0.25、0.50、1.00 mg/mL）的艾葉黃酮對DPPH·清除能力的吸光度值，并參考黃麗華等[2]文獻(xiàn)中DPPH·清除率公式計算。黃酮對·OH 清除能力的測定。測定不同質(zhì)量濃度（0.125、0.25、0.50、1.00 mg/mL）的黃酮提取液對·OH清除能力的吸光度，并參考黃麗華等[2]文獻(xiàn)中·OH清除率公式計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 艾葉含水量測定

植物的水分狀況對植物的生理活動有著極重要的影響，植物的含水量是衡量植物生長的重要指標(biāo)之一。測量艾葉的含水量，取平均值，得到艾葉含水量為85.8%。

2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

經(jīng)測定，變量為蘆丁質(zhì)量濃度c（mg/mL），隨機(jī)變量為吸光度A，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1，可得回歸方程：A=12.775c - 0.01，R2=0.999 4，表明在測定濃度區(qū)間內(nèi)趨于線性關(guān)系。上述結(jié)果可用作推導(dǎo)艾葉黃酮提取量。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對艾葉黃酮得率的影響

黃酮類化合物一般易溶于甲醇、乙酸乙酯等溶劑中，其中乙醇毒副作用小，被選為提取溶劑。由圖2 可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，艾葉黃酮得率呈上升趨勢，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時，黃酮得率為2.894%。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對艾葉總黃酮得率的影響

2.3.2 料液比對艾葉黃酮得率的影響

根據(jù)溶解平衡原理，未溶解的黃酮與已溶解的黃酮處于動態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)料液比增加的時候，黃酮溶出速度減慢；黃酮進(jìn)入溶劑的同時，一些其他成分化合物也會浸出，從而起到阻礙作用；隨著料液比增加，艾葉黃酮得率總體呈下降趨勢。由試驗(yàn)結(jié)果得出，艾葉黃酮提取最佳料液比為1∶25（g/mL），得率為2.442%。

2.3.3 超聲提取時間對艾葉黃酮得率的影響

艾葉黃酮濃度隨著超聲提取時間的增加而略微下降，隨后緩緩上升，但總體變化不明顯。根據(jù)結(jié)果，50 min 為適宜提取時間。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

本正交試驗(yàn)的試驗(yàn)指標(biāo)為提取率。艾葉黃酮的提取率受浸取液乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、超聲提取時間（C）因素的交叉影響[3]。

每個因素下對應(yīng)水平1 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的和為K1值，以此類推各個因素對應(yīng)其余水平的K 值；每個因素下K 值的最大值減最小值為R 值。進(jìn)行極差分析，范圍誤差最小的是超聲提取時間，范圍誤差最大的是浸取液乙醇體積分?jǐn)?shù)，說明艾葉黃酮提取率受超聲提取時間的影響不顯著，而乙醇體積分?jǐn)?shù)對其影響最大，對比以上3 個因素的影響程度主次排列為：提取時間＜料液比＜乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.5 最佳提取條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)結(jié)果可知，黃酮最高得率達(dá)到3.53%是在兩個變量為80%乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比1∶25 條件下實(shí)現(xiàn)的。因此，綜合結(jié)果來看，用80%乙醇溶液浸取1∶25（g/mL）超聲輔助提取50 min，提取率最高。

2.6 艾葉黃酮提取液的抗氧化活性分析

2.6.1 艾葉黃酮提取液的總還原能力

艾葉黃酮吸光度隨著提取液濃度升高而整體呈上升趨勢，表示艾葉黃酮的總還原能力增強(qiáng)，其抗氧化活性相應(yīng)加強(qiáng)。樣品濃度（x）與吸光度（Y）間的回歸方程為Y=3.625 1x+0.253 2，R2=0.990 6。

2.6.2 艾葉黃酮提取液對DPPH·的清除作用

黃酮質(zhì)量濃度為0.125～0.25 mg/mL 內(nèi)的區(qū)間，DPPH·的清除率隨著濃度增加發(fā)生急劇上升；而黃酮為0.25 mg/mL 后的濃度區(qū)間，清除率隨著濃度的增加而趨于平緩增長的趨勢，清除率總體呈“S”型增長曲線關(guān)系。實(shí)驗(yàn)檢測得出，最大清除率為96.35%。因此，艾葉黃酮對DPPH·有很好的清除作用。

2.6.3 艾葉黃酮提取液對·OH 的清除作用

如圖3 所示，對·OH 的清除率隨著提取液濃度上升而升高，整體呈增長趨勢。數(shù)據(jù)顯示，對·OH 的清除率在0.5～1 mg/mL 區(qū)間質(zhì)量濃度內(nèi)急劇上升，隨著黃酮提取液濃度增加，黃酮提取液對·OH 的清除率呈正比關(guān)系。消除偶然，增加一組質(zhì)量濃度0.75 mg/mL 的實(shí)驗(yàn)，黃酮提取液對·OH 的清除率為90.9%。當(dāng)黃酮質(zhì)量濃度為1 mg/mL，黃酮提取液對·OH 的清除率達(dá)到97.49%，證明其抗活性氧基團(tuán)的能力強(qiáng)，抗氧化活性表現(xiàn)明顯。

圖3 黃酮對·OH 的清除效果

3 結(jié)論

由上述試驗(yàn)可知，艾葉黃酮的提取受浸取液濃度、料液比、超聲提取時間等因素不同程度的影響。運(yùn)用正交試驗(yàn)法優(yōu)化，初步選取艾葉黃酮最佳提取的條件，得到的結(jié)果顯示，用80%乙醇溶液浸取1∶25（g/mL）料液比浸泡4 h，超聲輔助50 min 為最優(yōu)提取條件。根據(jù)抗氧化活性實(shí)驗(yàn)可知，艾葉黃酮具有較強(qiáng)的總還原能力和自由基清除活性，在抗氧化方面具有良好的效應(yīng)，可以作為一種很好的抗氧化劑。國內(nèi)各領(lǐng)域持續(xù)開發(fā)利用艾葉的有效成分，證明其有可利用的價值。對艾葉黃酮含量的提取及其抗氧化作用進(jìn)行的初步研究，能為進(jìn)一步深入研究提供新思路。