曹 熙，王恩彪，任曉珍，趙 歡

沈陽科技學院，遼寧 沈陽 110167

植物根際促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）是指在植物根系土壤中生存的有益菌，不僅可以促進植物生長，還具有防病害和提高作物收成的作用。目前發(fā)現(xiàn)的具有防病促生潛能的多個種類和屬性的根系微生物包括芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、農(nóng)桿菌屬（A grobacterium）以及埃文氏菌屬（Eriwinia）等[1-2]。

在農(nóng)作物生產(chǎn)中應用微生物肥料可以明顯起到增加產(chǎn)量和提高品質(zhì)的效果。研究表明，施用微生物肥料可以明顯促進水稻、玉米等糧食作物植株的生長和產(chǎn)量的增加，同時減少化肥的使用[3]。植物根際促生細菌能夠通過多種途徑促進植物的生長。因此，對PGPR 植物的生長促進機理和促進微生物肥料產(chǎn)業(yè)化的詳細研究，已然成為當前對資源合理利用和環(huán)境保護具有重要意義的研究熱點。

通過前期對菌株進行分離純化、篩選及培養(yǎng)，得到了13 株具有高效解磷作用的菌株。本研究通過對試驗菌株與解淀粉芽孢桿菌拮抗作用及與玉米大斑病病原菌拮抗作用進行評價，篩選出制備微生物肥料的目標菌種。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

LB 培養(yǎng)基、無菌培養(yǎng)皿、無菌鑷子、無菌牛津杯、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫搖床、高壓蒸汽滅菌鍋、離心機、分光光度計。

1.1.1 試驗菌株與解淀粉芽孢桿菌拮抗作用評價方法[4]

無菌培養(yǎng)皿底部倒一層已滅菌的LB 固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基凝固后，在距平皿中心2.5 cm 處放置經(jīng)180 ℃干熱滅菌1 h 的牛津杯，每皿放3 個，呈等邊三角形。將滅好菌的LB 固體培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每皿約20 mL，紫外燈下開蓋冷卻后將牛津杯拔出，使固體平板上形成菌液池。

取100 μL 于30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h 的解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液，加入制作好的平皿中央，涂布均勻。每個菌液池內(nèi)加100 μL 于30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h 的試驗菌株發(fā)酵液，每皿的3 個菌液池互為對照，以接種等量無菌培養(yǎng)基為空白對照，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，待解淀粉芽孢桿菌長滿整個平皿后，觀察菌液池周圍是否產(chǎn)生抑菌圈，并測量抑菌圈直徑。

1.1.2 試驗菌株與玉米大斑病病原菌拮抗作用評價方法[5-6]

無菌培養(yǎng)皿底部倒一層已滅菌的LB 固體培養(yǎng)基，待LB 培養(yǎng)基凝固后，在距平皿中心2.5 cm 處放置經(jīng)180 ℃干熱滅菌1 h 的牛津杯，每皿放3 個，呈等邊三角形。將滅好菌的PDA 培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，每皿約20 mL，紫外燈下開蓋冷卻后將牛津杯拔出，使固體平板上形成菌液池。

平皿中心接種玉米大斑病病原菌菌餅，在菌液池內(nèi)加入100 μL 試驗菌株發(fā)酵液，每皿的3 個菌液池互為對照，以接種等量無菌培養(yǎng)基為空白對照，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至空白板上，菌絲生長至菌液池邊緣。測量抑菌帶寬度（細菌菌落邊緣至病原菌菌絲邊緣的距離）及玉米大斑病原菌菌落半徑（玉米大斑病菌餅邊緣至菌絲邊緣的距離），并計算抑菌率：（空白對照玉米大斑病病原菌菌落半徑-接種實驗菌的平皿上玉米大斑病原菌菌落半徑）×100%/空白對照玉米大斑病病原菌菌落半徑。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 試驗菌株與解淀粉芽孢桿菌拮抗作用評價結(jié)果

試驗菌株與解淀粉芽孢桿菌拮抗實驗結(jié)果統(tǒng)計見表1。

表1 實驗結(jié)果統(tǒng)計表

將解淀粉芽孢桿菌及試驗菌株培養(yǎng)24 h 后，觀察到其中8 個平皿上出現(xiàn)抑菌圈，說明13 株菌中有8 株菌與解淀粉芽孢桿菌存在不同程度的拮抗作用。其中，HF47.0 及HF48.1 兩株菌于解淀粉芽孢桿菌拮抗作用最強，HF40.0 次之。HF34.0、HF36.0、HF43.1、HF43.2、HF48.2 五株菌與解淀粉芽孢桿菌不存在拮抗作用，可作為備選菌株加入微生物肥料。

2.2 試驗菌株與玉米大斑病病原菌拮抗作用評價結(jié)果

試驗菌株與玉米大斑病病原菌拮抗作用評價實驗結(jié)果統(tǒng)計見表2。

表2 試驗菌株與玉米大斑病病原菌拮抗實驗結(jié)果統(tǒng)計表

除HF34.0 菌株外，13 株試驗菌中其余12 株菌對玉米大斑病病原菌均有拮抗作用。其中，HF29.0及HF36.0 兩株菌對玉米大斑病抑菌率達到70.0%，抑菌效果最好。其次，解淀粉芽孢桿菌及HF45.0、HF48.1、HF48.2、HF48.3、HFTY 等6 株菌的抑菌率達到60 %以上。

3 總結(jié)

在分離純化得到的13 株具有解磷作用的菌株中，5 株與解淀粉芽孢桿菌不存在拮抗作用，11 株對玉米大斑病病原菌的抑菌率達到50 %以上。其中，HF29.0 及HF36.0 兩株菌對玉米大斑病病原菌的抑制作用最強，抑菌率達到70 %。

通過前期評價，初步選定HF36.0、HF43.1、HF48.2 三株菌作為目標菌劑添加至微生物肥料中。