吳婭芳，胡展馳，王 毅，權(quán)春善

大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116600

1963 年，研究人員通過(guò)電子顯微鏡首次在細(xì)菌的細(xì)胞壁處發(fā)現(xiàn)了外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMVs）[1-2]，因?qū)ζ浣M成、結(jié)構(gòu)和功能均不清楚，固認(rèn)為其是細(xì)胞凋亡所產(chǎn)生的細(xì)胞碎片[3]。1987年，Johnstone 等[4]發(fā)現(xiàn)羊網(wǎng)狀細(xì)胞能夠分泌納米級(jí)囊泡，并將其命名為外泌體（exosome）。此后，越來(lái)越多文獻(xiàn)開(kāi)始報(bào)道革蘭氏陰性菌可分泌類似外泌體的囊泡[5]，功能與細(xì)胞外泌體相似，被稱為細(xì)菌外膜囊泡。1999 年，Beveridge 等[6]對(duì)銅綠假單胞菌OMVs 的系列研究最早揭示了OMVs 的天然殺菌活性及其成為抗菌藥物載體的潛力。至此，對(duì)OMVs 的研究開(kāi)始引起了人們的廣泛重視。起初人們對(duì)OMVs 的研究主要集中于對(duì)其功能的探索，但隨著對(duì)OMVs 生物合成、組成分析的深入研究，OMVs 的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)作用和免疫作用逐漸清晰了起來(lái)。隨著研究的不斷深入，OMVs 已被認(rèn)為是疫苗研發(fā)過(guò)程中潛在的疫苗抗原候選物之一。本文對(duì)OMVs 的結(jié)構(gòu)研究及其在疫苗相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為OMVs 在疫苗開(kāi)發(fā)領(lǐng)域、藥物遞送系統(tǒng)，乃至抗菌劑、靶向治療腫瘤等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究提供參考和理論支撐。

1 細(xì)菌外膜囊泡

1.1 合成機(jī)制

OMVs 起初被認(rèn)為是細(xì)菌裂解的副產(chǎn)物，但隨后OMVs 被證實(shí)是由原核微生物分泌產(chǎn)生的，有關(guān)其產(chǎn)生的具體機(jī)制開(kāi)始變得說(shuō)法不一[7]。目前被大部分學(xué)者普遍接受的觀點(diǎn)是，OMVs 的形成及其攜帶的物質(zhì)并不是隨細(xì)菌死亡而隨機(jī)產(chǎn)生的，而是存在一種精細(xì)有序的調(diào)控過(guò)程[8]。當(dāng)前研究認(rèn)為OMVs的生物合成調(diào)控機(jī)制主要包括三種，即壓力聚集、膜交聯(lián)調(diào)節(jié)、脂類富集，如圖1 所示。

圖1 細(xì)菌外膜囊泡的合成機(jī)制示意圖

細(xì)胞周質(zhì)中存在大量肽聚糖片段和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)以及一些促進(jìn)膜囊泡等物質(zhì)生成的異常組分，這些異常組分的局部堆積和富集會(huì)給細(xì)胞膜造成壓力，降低包膜的完整性，使肽聚糖層由外膜層分離，向外突出形成OMVs[9-10]。如幽門螺桿菌[11]和波伊德志賀菌[12]就是通過(guò)這種調(diào)節(jié)機(jī)制產(chǎn)生OMVs 的。

革蘭陰性菌的膜結(jié)構(gòu)分為內(nèi)膜層、肽聚糖層（PG）和外膜層3 層[13]。周質(zhì)腔中的脂蛋白（lipoprotein，LPP）可以通過(guò)Lpp-PG 的方式連接細(xì)菌的外膜層和肽聚糖層，使其被分解或破壞，導(dǎo)致外膜層和肽聚糖層兩層之間的連接變得不穩(wěn)定，最終導(dǎo)致外膜凸起形成球狀囊泡，引發(fā)OMVs 的產(chǎn)生和釋放[1]。與之相反，如果缺少mDAP-mDAP 肽連接，就會(huì)引起Lpp-PG 連接的上升，導(dǎo)致OMVs 的產(chǎn)量下降[9]。如大腸桿菌和沙門氏菌在缺少ompA 的情況下，OMVs 的產(chǎn)量會(huì)顯著上升[14-16]。

外膜中富集有大量脂質(zhì)，這些脂質(zhì)會(huì)影響膜的曲率與流動(dòng)性，因此脂質(zhì)可能會(huì)在OMVs 的分泌形成過(guò)程發(fā)揮關(guān)鍵作用。有研究指出，當(dāng)在外膜中加入修飾過(guò)的脂多糖（lipopolysac-charide，LPS）或磷脂等成分后，外膜的曲率會(huì)發(fā)生變化，從而誘導(dǎo)更多OMVs 的形成與釋放[1，17]。此外，溫度變化也會(huì)影響OMVs 的產(chǎn)量。溫度的調(diào)節(jié)會(huì)影響膜上脂質(zhì)的流動(dòng)性，但溫度對(duì)不同種屬菌類的影響也不同。在大腸桿菌中，隨著溫度升高，膜上脂類的流動(dòng)性會(huì)不斷增強(qiáng)，OMVs 的產(chǎn)量會(huì)增加；而在銅綠假單胞桿菌中，溫度升高12 ℃或14 ℃都不會(huì)改變OMVs 的產(chǎn)量[18]。

1.2 結(jié)構(gòu)和組成

OMVs 是一種由雙層膜包裹的球狀納米顆粒，直徑范圍為20～250 nm。但這種結(jié)構(gòu)并不是絕對(duì)的。有研究發(fā)現(xiàn)，除了OMVs 雙層膜球形結(jié)構(gòu)，研究人員在某些古細(xì)菌（Archaebacteria）上還發(fā)現(xiàn)了管型、細(xì)長(zhǎng)型等其他結(jié)構(gòu)類型[19]。OMVs 主要由細(xì)胞外膜的成分組成，包括豐富的外膜蛋白、脂多糖、肽聚糖以及一系列與宿主組織黏附和侵襲有關(guān)的毒力因子，同時(shí)也包含一些細(xì)胞內(nèi)成分，例如DNA，RNA 和酶等，這些組成成分同樣決定了其對(duì)細(xì)菌多種生物過(guò)程的影響能力，包括生物膜的形成、DNA 轉(zhuǎn)移、細(xì)胞代謝物和毒力因子的運(yùn)輸?shù)?。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，在OMVs 中已經(jīng)鑒定出了很多不同功能類別的蛋白質(zhì)[20]。如參與細(xì)菌對(duì)宿主黏附和侵染的OM蛋白（OmpA、OmpC 和OmpF）和周質(zhì)蛋白（AcrA、堿性磷酸酶）。

脂質(zhì)是OMVs 的重要結(jié)構(gòu)成分。Horstman 等[21]報(bào)道大腸埃希桿菌OMVs 以甘油磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和心磷脂為主要脂質(zhì)，這些脂質(zhì)與OMVs 的曲度有關(guān)。有研究報(bào)道OMVs 中亦存在一些不屬于細(xì)菌外膜成分的脂質(zhì)[22]，還有些學(xué)者猜測(cè)OMVs 所包含的核酸是細(xì)菌裂解殘留物偶然滲入的，也有學(xué)者認(rèn)為其生物發(fā)生過(guò)程并非偶然現(xiàn)象[23]。

1.3 生物學(xué)作用

幾乎所有的革蘭氏陰性菌都會(huì)產(chǎn)生OMVs，可見(jiàn)OMVs 的存在對(duì)細(xì)菌的意義之大。目前普遍認(rèn)為OMVs 對(duì)革蘭氏陰性菌的生物學(xué)作用主要包括信息交流、營(yíng)養(yǎng)攝取、防御作用和環(huán)境壓力耐受這四個(gè)方面。OMVs 裝載了多種來(lái)自親本細(xì)菌的生物分子和外源性生物分子，這些生物分子會(huì)隨OMVs 的傳遞進(jìn)行細(xì)胞間的信息交流。如銅綠假單胞菌外膜囊泡包裹喹諾酮信號(hào)（PQS）分子，喹諾酮信號(hào)分子以O(shè)MVs 為載體，在細(xì)菌群體內(nèi)進(jìn)行信息傳遞。

OMVs 所含的組分十分復(fù)雜，包含許多可以降解生物大分子的酶類物質(zhì)。因此，當(dāng)細(xì)菌所生活的環(huán)境中存在某些大分子類物質(zhì)時(shí)，OMVs 便可以將其降解并使其被細(xì)菌吸收利用。此外，OMVs 還可以與細(xì)菌細(xì)胞膜融合，有助于細(xì)菌獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。如百日咳桿菌外膜囊泡可充當(dāng)鐵輸送系統(tǒng)，在鐵限制的條件下可以補(bǔ)充百日咳桿菌的生長(zhǎng)缺陷[24]。

病原體定植于宿主組織的惡劣環(huán)境中時(shí)可能會(huì)遇到多種壓力源，病原體為了對(duì)抗壓力和生存，就會(huì)建立多種防御機(jī)制，其中之一就是釋放OMVs。OMVs 在此過(guò)程中會(huì)充當(dāng)誘餌，保護(hù)細(xì)菌細(xì)胞免受抗生素、抗菌肽和噬菌體等的傷害。如在對(duì)鮑氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）的研究中發(fā)現(xiàn)，β-內(nèi)酰胺酶基因blaOXA-24 為陽(yáng)性的OMVs 可以將其傳遞給陰性菌株使其獲得耐藥基因[2，25]。

OMVs 的形成理論中有這樣一種觀點(diǎn)，即釋放出來(lái)的OMVs 可以攜帶菌體本身合成的一些錯(cuò)誤折疊的蛋白或過(guò)量的肽聚糖片段，是細(xì)菌處理“垃圾”的一種方式。細(xì)菌也可以通過(guò)釋放OMVs 將這些垃圾釋放出去，從而減輕其環(huán)境壓力。如用環(huán)氧沙星處理銅綠假單胞菌，該細(xì)菌便會(huì)通過(guò)釋放OMVs 來(lái)抵抗不良生存環(huán)境[1]。

2 細(xì)菌外膜囊泡在疫苗研發(fā)中的應(yīng)用

2.1 作為候選疫苗

OMVs 疫苗可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高抗體，使其具有更高的有效性。研究表明，OMVs 中含有眾多抗原蛋白且不具有復(fù)制能力，接種OMVs 疫苗可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種具有殺菌活性的抗體，且其在動(dòng)物模型中具有免疫保護(hù)功能[26]。這一特質(zhì)使OMVs 成為了疫苗研發(fā)環(huán)節(jié)的優(yōu)質(zhì)候選抗原。

OMVs 疫苗作為一種極具潛力的疫苗種類，具有成本低、可以誘導(dǎo)有效的保護(hù)性免疫應(yīng)答等優(yōu)點(diǎn)。2013 年，商品名為Bexsero 的針對(duì)引發(fā)流行性腦脊髓膜炎而研發(fā)生產(chǎn)的B 型腦膜炎耐瑟菌OMVs 疫苗在歐洲成功獲批上市，并在古巴、智利、挪威和新西蘭等地投入使用[27]。除了針對(duì)腦膜炎球菌的OMVs疫苗，結(jié)核分枝桿菌[28]、金黃色葡萄球菌[29]等其他細(xì)菌的OMVs 疫苗也正處于研發(fā)階段。此外，用于治療萊姆病的腦膜炎奈瑟菌OMVs 疫苗[30]，治療產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的霍亂弧菌OMVs 疫苗[31]，治療肺炎的鼠傷寒沙門菌OMVs 疫苗[32]以及治療肺結(jié)核的異源OMVs 疫苗[33]等也正處于研究過(guò)程中。這些疫苗的研發(fā)不僅說(shuō)明OMVs 在B 群腦膜炎球菌疫苗領(lǐng)域的研究已經(jīng)得到了廣泛認(rèn)可，更證明了OMVs 作為候選抗原的優(yōu)勢(shì)和發(fā)展前景[34]。

除此之外，有些菌的OMVs 疫苗還可以用來(lái)緩解患者的炎癥。如百日咳菌的OMVs 疫苗在降低患者炎性反應(yīng)的同時(shí)，也具有與其他疫苗相同的保護(hù)作用[2]。

2.2 作為佐劑

疫苗佐劑（adjuvant）能夠非特異性地改變或增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的特異性免疫應(yīng)答，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生長(zhǎng)期、高效的特異性免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體的保護(hù)能力，與此同時(shí)還可減少免疫物質(zhì)的用量，降低疫苗的生產(chǎn)成本。目前關(guān)于佐劑的研究主要集中于兩方面，一是受體激活劑，二是疫苗的遞送系統(tǒng)[35-36]。OMVs 表面的脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是Toll 樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）的典型激活劑。激活這些信號(hào)通路不僅可以誘導(dǎo)細(xì)胞釋放大量可以介導(dǎo)多項(xiàng)免疫反應(yīng)的促炎性細(xì)胞因子，還可以促進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞成熟并用于激活適應(yīng)性免疫[1]。由此可見(jiàn)，OMVs 表面的LPS 可以作為很好的免疫激活劑，且具有很大的研究?jī)r(jià)值。

將OMVs 用作佐劑的研究可以追溯到二十世紀(jì)末[37]。在HIV 疫苗的研究過(guò)程中，OMVs 佐劑被證明可以誘導(dǎo)T 細(xì)胞反應(yīng)[38]。Nagaputra 等[39]研究表明，脂多糖（LPS）修飾糖型（LgtB-LpxL1）與非修飾糖型Lpxl1 血清組腦膜炎球菌H44/76 天然外膜囊泡（nOMVs）對(duì)重組腦膜炎球菌蛋白、破傷風(fēng)類毒素或腦膜炎球菌C 血清群莢膜多糖等具有佐劑作用，能夠取得與傳統(tǒng)佐劑相同甚至優(yōu)于傳統(tǒng)佐劑的效果。

2.3 作為藥物遞送系統(tǒng)

OMVs 相對(duì)穩(wěn)定，可以保護(hù)內(nèi)部物質(zhì)免受細(xì)胞內(nèi)核酸酶與蛋白質(zhì)水解酶降解[21，40-41]。有研究表明，OMVs 可在4 ℃下長(zhǎng)期儲(chǔ)存，甚至在短暫的高溫作用下仍能保持酶活性和抗原性[42]。而且，其不會(huì)因長(zhǎng)距離運(yùn)輸而降解，由此可解決疫苗長(zhǎng)距離運(yùn)輸抗原活性低的問(wèn)題。有研究表明，利用基因工程技術(shù)可使OMVs 負(fù)載的抗原不僅可以暴露于OMVs 表面，也可以負(fù)載于OMVs 的腔體中[43-44]。上述技術(shù)優(yōu)勢(shì)一方面可以保護(hù)OMVs 內(nèi)的抗原，另一方面還可以于OMVs 表面在其他外源抗原的幫助下將內(nèi)部抗原靶向遞呈于抗原遞呈細(xì)胞中。

目前OMVs 領(lǐng)域一個(gè)新的研究方向是將異源抗原表達(dá)于OMVs 表面從而構(gòu)建新疫苗。目前，已有學(xué)者通過(guò)基因工程改造技術(shù)將甲型流感病毒的基質(zhì)蛋白M2 異源表達(dá)于大腸桿菌的外顯子中，并成功表達(dá)出了包含此蛋白的OMVs，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行臨床檢驗(yàn)，證明此種方式制得的疫苗可以抵抗同型流感病毒的攻擊[45]。OMVs 疫苗相較其他疫苗具有更高的可修飾性，可通過(guò)基因工程等手段加強(qiáng)疫苗的靶向性，由此可見(jiàn)，OMVs 疫苗擁有更廣泛的研究方向。

3 細(xì)菌外膜囊泡的其他領(lǐng)域的應(yīng)用

3.1 作抗菌劑的研究

細(xì)菌需要附著于宿主細(xì)胞并定植在相關(guān)組織中，然后再擴(kuò)散到其他組織，才能感染機(jī)體[46]。目前，已經(jīng)出現(xiàn)了一種通過(guò)使用抗菌黏附劑來(lái)抑制細(xì)菌的黏附作用從而治療感染的新型抗菌治療方法，其被稱為抗菌黏附療法[47]?？咕じ絼┲饕ㄟ^(guò)破壞細(xì)菌上的黏附素或競(jìng)爭(zhēng)性，與宿主細(xì)胞結(jié)合來(lái)抑制細(xì)菌與宿主細(xì)胞結(jié)合[48]。

OMVs 中含有較多細(xì)菌黏附素，這種性質(zhì)決定了OMVs 可以競(jìng)爭(zhēng)性地與宿主細(xì)胞結(jié)合，起到抗菌黏附劑的作用。Zhang 等[49]通過(guò)帶有黏附素的幽門桿菌OMVs 包裹納米顆粒，構(gòu)建了一種抗菌黏附劑納米平臺(tái)。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該OMVs 納米平臺(tái)能夠降低幽門桿菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附性，同時(shí)，通過(guò)對(duì)小鼠胃組織幽門桿菌的研究也證實(shí)了該OMVs 可以削弱細(xì)菌的黏附作用。

3.2 在醫(yī)療用藥方面的應(yīng)用

OMVs 對(duì)細(xì)菌的一個(gè)重要作用就在于可以為其提供適宜的生存環(huán)境。細(xì)菌在產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)對(duì)會(huì)產(chǎn)生更多OMVs，而抗生素就是刺激細(xì)菌產(chǎn)生OMVs的因素之一。腸出血性大腸埃希菌分泌的志賀毒素2a 會(huì)引起溶血性尿毒綜合征。研究發(fā)現(xiàn)[50]，磷霉素、環(huán)丙沙星等抗生素會(huì)刺激出血性大腸埃希菌O104:H4 和O157∶H7 產(chǎn)生OMVs，其中，環(huán)丙沙星還會(huì)使OMVs 中的志賀毒素含量增加。因此，治療此類患者時(shí)不應(yīng)使用上述抗生素。同時(shí)，細(xì)菌遇到抗生素發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生OMVs 的性質(zhì)也可以應(yīng)用于OMVs 的制備過(guò)程中。

3.3 抗腫瘤應(yīng)用研究

OMVs 作為一種不具有分裂能力、穩(wěn)定度較高的納米粒子，包含母體細(xì)菌的主要免疫原性蛋白質(zhì)，可以有效激活免疫系統(tǒng)，特異性殺傷異常的腫瘤細(xì)胞，同時(shí)還可以高效轉(zhuǎn)運(yùn)藥物。以上性質(zhì)使OMVs 成為了一種治療腫瘤的新型手段[26]。

正常情況下，人體的免疫系統(tǒng)可以識(shí)別并清除腫瘤細(xì)胞，但腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)破壞抗腫瘤-免疫循環(huán)，實(shí)現(xiàn)“免疫逃逸”，得以不受控制地生長(zhǎng)。腫瘤免疫治療主要通過(guò)重新激活機(jī)體的抗腫瘤-免疫循環(huán)來(lái)殺死腫瘤細(xì)胞[51-52]。Li 等[53]通過(guò)融合大腸桿菌OMVs 和黑色素瘤細(xì)胞膜（TCMs）即BTs，整合PLGA 到BTs 中作為核心形成BTs@PLGA，開(kāi)發(fā)有效的囊泡疫苗。BTs@PLGA 的治療顯著增強(qiáng)了DC靶向、DC 成熟、腫瘤抗原呈遞以及抗原特異性T 細(xì)胞的反應(yīng)，具有良好的抗腫瘤治療效果。

4 總結(jié)與展望

鑒于上述OMVs 疫苗區(qū)別于其他疫苗的優(yōu)點(diǎn)，以及已開(kāi)發(fā)的OMVs 疫苗平臺(tái)，我們可以看出OMVs 疫苗應(yīng)用領(lǐng)域廣泛且擁有良好的發(fā)展前景。OMVs 疫苗的應(yīng)用研究已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，但是，目前有關(guān)OMVs 疫苗的研究和應(yīng)用主要是針對(duì)細(xì)菌引起的相關(guān)疾病，而針對(duì)病毒研發(fā)的OMVs疫苗卻少之又少。

2019 年末新型冠狀病毒肺炎肆虐中國(guó)，開(kāi)發(fā)擁有長(zhǎng)效免疫能力且能夠應(yīng)對(duì)不同變種新型冠狀病毒的疫苗是預(yù)防疾病、增強(qiáng)機(jī)體抵抗力的一種高效方法。目前市場(chǎng)上常見(jiàn)的針對(duì)新冠病毒的疫苗主要分為三種，一是新冠滅活疫苗，二是新冠腺病毒載體疫苗，三是新冠重組蛋白疫苗。雖然這三種病毒均對(duì)抑制新冠肺炎具有一定的有效性，但都各有缺點(diǎn)，并且在注入人體后均會(huì)引發(fā)一系列不良反應(yīng)，而有研究證明百日咳菌的OMVs 疫苗在使機(jī)體產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)更少的情況下，可以起到相同的保護(hù)作用[2]，由此可推斷新冠病毒的OMVs 疫苗也可能擁有相同的防護(hù)效果。因此，研制針對(duì)新冠病毒的OMVs 疫苗具有重要的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。