段興帆，亢 昕，趙毅彪，陳小華，沈根祥，趙曉祥

(1.東華大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 上海;2.上海市環(huán)境科學(xué)研究院, 上海)

自進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)以來(lái),人們生活水平顯著提高,但由于各種工農(nóng)業(yè)污水的過(guò)度排放,致使水體含氮量超標(biāo),生態(tài)環(huán)境惡化,不利于人體健康及環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展[1],如何高效、環(huán)保地處理含氮廢水一直是水處理研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

常見(jiàn)的廢水脫氮工藝有物理法、化學(xué)法及生物法。與物理法和化學(xué)法相比,生物法成本低、對(duì)環(huán)境友好,被廣泛應(yīng)用于污水處理廠、人工濕地等領(lǐng)域[2]。傳統(tǒng)生物脫氮工藝通常包括兩個(gè)過(guò)程,首先由自養(yǎng)硝化菌在好氧條件下將氨氮轉(zhuǎn)化為硝氮或亞硝氮,然后再由異養(yǎng)反硝化菌在厭氧條件下將硝氮或亞硝氮轉(zhuǎn)化為含氮?dú)怏w以達(dá)到脫氮目的[3]。因此,傳統(tǒng)生物脫氮過(guò)程不能在同一反應(yīng)器內(nèi)完成,往往需要大型設(shè)備或較長(zhǎng)的水力停留時(shí)間(hydraulic retention time, HRT)[4]。

好氧反硝化菌是一類能夠在有氧條件下進(jìn)行反硝化作用的微生物,生長(zhǎng)周期短,無(wú)需額外設(shè)置厭氧反應(yīng)器,設(shè)備維護(hù)簡(jiǎn)單[5]。目前,關(guān)于好氧反硝化菌的研究多集中于常規(guī)環(huán)境[6-7],而對(duì)極端環(huán)境下菌株脫氮特性的關(guān)注較少[8]。實(shí)際上,好氧反硝化菌對(duì)pH的變化敏感,其最適pH值范圍一般為6.5～8.0,當(dāng)pH值超過(guò)此范圍,好氧反硝化菌的活性就會(huì)受到抑制,進(jìn)而影響菌株的反硝化作用[9]。如在處理化工、制藥等含堿廢水中,還需添加酸來(lái)保障反應(yīng)的正常進(jìn)行[10]。此外,鹽質(zhì)量濃度也是影響細(xì)菌活性的重要因素,含鹽量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞失水甚至裂解。盡管近年來(lái)陸續(xù)有科學(xué)家篩選出能夠適應(yīng)強(qiáng)堿、高鹽環(huán)境的好氧反硝化菌,但大部分局限于單一耐受性的研究[11]。如王兆陽(yáng)等[12]雖然分離出一株嗜堿好氧反硝化菌,但并未對(duì)其耐鹽性做進(jìn)一步研究;唐婧等[13]篩選出的耐鹽好氧反硝化菌在pH值為8.0時(shí)反硝化效果最佳。因此,急需篩選能耐受強(qiáng)堿環(huán)境及一定鹽質(zhì)量濃度的好氧反硝化菌用以簡(jiǎn)化處理流程,降低處理成本,以期應(yīng)用于更廣泛的處理領(lǐng)域。

從土壤中分離出一株耐堿好氧反硝化瓊氏不動(dòng)桿菌5-2,通過(guò)考察其在不同環(huán)境因素下的脫氮特性,發(fā)現(xiàn)該菌株不僅能夠高效去除環(huán)境中的硝氮,還能適應(yīng)強(qiáng)堿環(huán)境(pH=10.0～12.0)及一定鹽質(zhì)量濃度(10～30 g/L)。此外,還對(duì)此菌的好氧反硝化相關(guān)酶活性及功能基因進(jìn)行了檢測(cè),有望為好氧反硝化菌處理復(fù)雜含氮廢水的實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來(lái)源

采集距地面深約10 cm的稻田土壤300 g,將收集到的新鮮土壤立即低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室并保存在4 ℃的冰箱中,用于后續(xù)細(xì)菌的篩選分離。

1.1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基具體配方如下所述。富集培養(yǎng)基：魚(yú)粉蛋白胨質(zhì)量濃度為5.00 g/L,酵母提取物質(zhì)量濃度為5.00 g/L,NaCl質(zhì)量濃度為10.00 g/L。馴化培養(yǎng)基：CH3COONa質(zhì)量濃度為 1.30 g/L,KH2PO4質(zhì)量濃度為0.09 g/L,MgSO4·7H2O 質(zhì)量濃度為0.20 g/L,KNO3質(zhì)量濃度為 0.72 g/L。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨質(zhì)量濃度為10.00 g/L,酵母提取物質(zhì)量濃度為5.00 g/L,NaCl質(zhì)量濃度為10.00 g/L。微量元素溶液：EDTA質(zhì)量濃度為15.00 g/L,ZnSO4質(zhì)量濃度為0.20 g/L,MnCl質(zhì)量濃度為1.50 g/L,FeSO4·7H2O質(zhì)量濃度為0.50 g/L,CuSO4·7H2O 質(zhì)量濃度為0.50 g/L,CoCl·6H2O質(zhì)量濃度為0.30 g/L,Na2MO4·2H2O質(zhì)量濃度為0.20 g/L,CaCl2質(zhì)量濃度為0.10 g/L。好氧反硝化培養(yǎng)基(ADM)：CH3COONa質(zhì)量濃度為 0.62 g/L,KH2PO4質(zhì)量濃度為0.09 g/L,MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度為0.20 g/L,KNO3質(zhì)量濃度為0.29 g/L,微量元素溶液體積為2 mL。溴百里酚藍(lán)培養(yǎng)基(BTB)：在ADM培養(yǎng)基配方中加入體積為1 mL的1% BTB酒精溶液(0.10 g溴百里酚藍(lán)溶于10 mL酒精)。

在上述培養(yǎng)基配方中加入質(zhì)量濃度為20.00 g/L的瓊脂即可得到相應(yīng)固體培養(yǎng)基,試驗(yàn)試劑為分析純,培養(yǎng)基在121 ℃下滅菌15 min后使用。

1.1.3 試驗(yàn)儀器

JA-SERIES型分析天平;UV-1800PC型紫外分光光度計(jì);DSX-280KB24型手提式壓力蒸汽滅菌鍋;SPH-2102C型立式雙層搖床;TECHCOMP CT15RT型離心機(jī);VS-840-1型超凈工作臺(tái);SU8010型掃描電子顯微鏡;JY92-II型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)。

1.2 試驗(yàn)方法

檢測(cè)指標(biāo)與方法如表1所示。硝氮或總氮的去除率(η)計(jì)算式為：η=(ρ1-ρ2)/ρ1×100%,其中ρ1和ρ2分別為試驗(yàn)前后培養(yǎng)基中硝氮或總氮的質(zhì)量濃度,分析圖表采用Excel及Origin 8.6軟件進(jìn)行繪制。

表1 檢測(cè)指標(biāo)與方法Table 1 Detection indicators and methods

1.3 菌株的分離鑒定

1.3.1 菌株的富集及分離

稱取5 g土樣置于盛有100 mL滅菌生理鹽水的錐形瓶中,在30 ℃、100 r/min的搖床中振蕩20 min后,吸取5 mL懸浮液于富集培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后,再?gòu)闹形? mL菌液至馴化培養(yǎng)基中培養(yǎng),重復(fù)此操作6次后即可得到好氧反硝化細(xì)菌富集液。將富集液按照10倍稀釋法梯度稀釋,吸取0.1 mL稀釋倍數(shù)為108的菌液涂布于BTB固體培養(yǎng)基上,于30 ℃培養(yǎng)24 h,挑取使培養(yǎng)基變藍(lán)的單菌作為初篩菌株。將純化后的單菌株分別接種在ADM培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h,選取硝氮去除率最高的菌株作為后續(xù)試驗(yàn)對(duì)象。

1.3.2 菌株形態(tài)學(xué)及掃描電子顯微鏡觀察

1)形態(tài)學(xué)觀察及革蘭染色。將菌株挑取至LB固體培養(yǎng)基上,于30 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落狀態(tài)。同時(shí),對(duì)菌株進(jìn)行革蘭染色并觀察其在光學(xué)顯微鏡下的染色情況。

2)掃描電子顯微鏡觀察。取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液5 mL 在8 000 r/min條件下離心10 min(離心半徑為30 mm),用體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛溶液固定12 h,使用掃描電子顯微鏡放大5 000倍觀察。

1.3.3 菌株鑒定及功能基因的擴(kuò)增

使用上海派森諾生物公司提供的正向引物27F(5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)及反向引物1492R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)進(jìn)行16 S rDNA測(cè)序,同時(shí)以基因組 DNA 為模板,擴(kuò)增好氧反硝化相關(guān)基因(napA、nirK、nirS)[14],引物序列見(jiàn)表2。將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的其他微生物16 S rDNA序列進(jìn)行BLAST比對(duì),并使用MEGA 11.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

表2 好氧反硝化相關(guān)基因序列Table 2 Aerobic denitrification-related gene sequence

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)體系(50.00 μL)： 1.00 μL基因組DNA,5.00 μL 10×Buffer(含 2.50 mmol/L Mg2+),1.00 μL dNTP,1.00 μL Taq聚合酶,1.50 μL 27F,1.50 μL1492R,39.00 μL ddH2O。PCR反應(yīng)溫度條件： 95 ℃ 預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃ 延伸120 s,35個(gè)循環(huán)。

1.3.4 好氧反硝化酶活性測(cè)定

將在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌株,于10 000 r/min離心10 min后(離心半徑為30 mm),用濃度為10 mmol/L磷酸緩沖鹽(phosphate buffered saline, PBS)(pH=7.4)溶液清洗3次后重懸菌體于離心管中。使用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎15 min,再次離心后收集上清液即為細(xì)胞粗酶液。將適量細(xì)胞粗酶液分別加入相應(yīng)酶反應(yīng)體系,在35 ℃、90 r/min條件下反應(yīng)30 min,通過(guò)各體系中硝氮及亞硝氮的消耗量來(lái)計(jì)算酶活力及酶比活力。超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)具體工作條件及酶反應(yīng)體系的構(gòu)建參照文獻(xiàn)[15]。

酶活性單位(U)定義為1 min能轉(zhuǎn)化1 μmol反應(yīng)物的酶量。酶活力(U/mL)是指1 mL粗酶液中含有的酶活性單位,酶比活力(U/mg)是指1 mg蛋白質(zhì)中含有的酶活性單位。蛋白質(zhì)濃度使用Solarbio BCA法試劑盒測(cè)定。

1.4 菌株脫氮能力研究

1.4.1 脫氮條件優(yōu)化

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液以體積分?jǐn)?shù)為2%的接種量分別接種于單一因素變量的ADM培養(yǎng)基中以優(yōu)化其脫氮條件。具體試驗(yàn)條件如下：

1)在m(C)/m(N)值為12、初始pH值為10.0、轉(zhuǎn)速為90 r/min、溫度為35 ℃、鹽質(zhì)量濃度為0 g/L的條件下,優(yōu)化碳源(甲醇、葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、乙酸鈉);

2)以乙酸鈉為碳源、初始pH值為10.0、轉(zhuǎn)速為90 r/min、溫度為35 ℃、鹽質(zhì)量濃度為0 g/L的條件下,優(yōu)化m(C)/m(N)值(8、10、12、14、16);

3)以乙酸鈉為碳源、m(C)/m(N) 值為12、轉(zhuǎn)速為90 r/min、溫度為35 ℃、鹽質(zhì)量濃度為0 g/L的條件下,優(yōu)化初始pH值(6.0、7.0、8.0、10.0、12.0);

4)以乙酸鈉為碳源、m(C)/m(N) 值為12、初始pH值為10.0、溫度為35 ℃、鹽質(zhì)量濃度為0 g/L的條件下,優(yōu)化轉(zhuǎn)速(30、60、90、120、150 r/min);

5)以乙酸鈉為碳源、m(C)/m(N) 值為12、初始pH值為10.0、轉(zhuǎn)速為90 r/min、鹽質(zhì)量濃度為0 g/L的條件下,優(yōu)化溫度(20、25、30、35、40 ℃);

6)以乙酸鈉為碳源、m(C)/m(N)值為12、初始pH值為10.0、轉(zhuǎn)速為90 r/min、溫度為35 ℃的條件下,優(yōu)化鹽質(zhì)量濃度(10、20、30、40、50 g/L)。

培養(yǎng)72 h后測(cè)定細(xì)菌生物量(OD600)并計(jì)算硝氮及總氮的去除率,所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.2 脫氮特性研究

在最優(yōu)條件下,將菌株接種于ADM培養(yǎng)基中,每隔24 h測(cè)定其硝氮、亞硝氮、氨氮、總氮質(zhì)量濃度及OD600值,進(jìn)一步評(píng)價(jià)菌株反硝化能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 好氧反硝化菌的分離

在篩選試驗(yàn)中共得到5個(gè)具有好氧反硝化能力的單菌,計(jì)算其在24、48 h的硝氮去除率,結(jié)果如圖1所示。其中菌株5-2在48 h的硝氮去除率最高(91.64%),故選擇菌株5-2用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 不同菌株的硝氮去除情況Fig.1 Nitrate removal effect of different strains of bacteria

2.2 形態(tài)學(xué)觀察

菌株5-2的外觀形態(tài)和染色結(jié)果如圖2所示。

圖2 菌株5-2的外觀形態(tài)和染色結(jié)果Fig.2 Morphological appearance and staining results of the bacteria strain 5-2

由圖2(a)可知,菌株單菌落呈米黃色且形狀規(guī)則,邊緣光滑。由圖2(b)可知,在光學(xué)顯微鏡下可觀察到菌株的細(xì)胞呈藍(lán)色,結(jié)合《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》(第8版),初步鑒定為革蘭陽(yáng)性菌。由圖2(c)可觀察到細(xì)菌呈桿狀,排列緊密無(wú)鞭毛。

2.3 菌株鑒定結(jié)果

將菌株5-2的16 S r DNA測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),發(fā)現(xiàn)其與瓊氏不動(dòng)桿菌ATCC 17908存在親緣關(guān)系,相似性為99.93%。采用MEGA 11軟件構(gòu)建的菌株5-2系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖3所示,結(jié)果表明該菌為瓊氏不動(dòng)桿菌。

圖3 根據(jù)16S rDNA同源性基因序列構(gòu)建的菌株5-2系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain 5-2 based on the sequence homology of 16S rDNA gene

2.4 菌株脫氮條件的優(yōu)化

1)碳源。碳源會(huì)影響細(xì)菌的代謝及電子傳遞過(guò)程,繼而影響細(xì)菌對(duì)氮的利用[16]。不同碳源下培養(yǎng)72 h后菌株生長(zhǎng)及脫氮情況如圖4所示。由圖4可知：以甲醇為碳源時(shí),菌株生長(zhǎng)受到抑制(OD600=0.095),硝氮及總氮去除率較低,這可能與甲醇本身具有毒性有關(guān);以檸檬酸為碳源時(shí),OD600值為0.130,硝氮及總氮去除率分別為8.87%及2.25%;以蔗糖為碳源時(shí),OD600值為0.255,硝氮及總氮去除率分別為31.57%及15.78%;以葡萄糖為碳源時(shí),OD600值為0.433,硝氮及總氮去除率分別為68.06%及35.31%;以乙酸鈉為碳源時(shí),菌株OD600值最大為0.561,此時(shí),硝氮及總氮的去除率也達(dá)到最高,分別為94.64%及53.27%。這說(shuō)明瓊氏不動(dòng)桿菌5-2可利用葡萄糖、蔗糖及乙酸鈉為碳源。相較于葡萄糖與蔗糖,乙酸鈉分子結(jié)構(gòu)更為簡(jiǎn)單,無(wú)需經(jīng)過(guò)酶的轉(zhuǎn)化即可直接參與反硝化過(guò)程[17]。綜上,選擇乙酸鈉作為后續(xù)試驗(yàn)的碳源。

圖4 碳源對(duì)脫氮性能的影響Fig.4 Effect of carbon source on denitrification performance

2)m(C)/m(N)值。m(C)/m(N)值是影響細(xì)菌生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素,過(guò)低或過(guò)高的m(C)/m(N)值會(huì)影響菌株的脫氮效果[18]。培養(yǎng)72 h后,不同m(C)/m(N)值下菌株生長(zhǎng)及脫氮情況如圖5所示。

圖5 m(C)/m(N)值對(duì)脫氮性能的影響Fig.5 Effect of m(C)/m(N) value on denitrification performance

由圖5可知,在一定范圍內(nèi)菌株脫氮能力隨著m(C)/m(N)值的增加而增強(qiáng),當(dāng)超過(guò)該范圍,m(C)/m(N)值不再是影響菌株脫氮的關(guān)鍵因素。當(dāng)m(C)/m(N)值由8提高到12時(shí),菌株OD600值由0.415升至0.575,硝氮去除率由73.53%增加到95.71%,總氮去除率由37.24%增加到51.88%;但當(dāng)m(C)/m(N)值為14和16時(shí),硝氮去除率分別為95.97%及96.47%,總氮去除率分別為52.24%及53.33%,并無(wú)明顯增加。在An等[19]的研究中也觀察到相似現(xiàn)象。綜上,瓊氏不動(dòng)桿菌5-2能夠適應(yīng)廣泛的m(C)/m(N)值范圍,考慮成本及避免不必要的浪費(fèi),確定最佳m(C)/m(N)值為12。

3)初始pH值。pH對(duì)細(xì)菌活性有顯著影響。培養(yǎng)72 h后,不同初始pH值下菌株生長(zhǎng)及脫氮情況如圖6所示。由圖6可知,菌株的脫氮能力隨著初始pH值的升高而增強(qiáng),并始終保持著較高的脫氮率。當(dāng)初始pH值為10.0時(shí),OD600值為0.592,硝氮及總氮去除率最高,分別為98.75%及58.54%;當(dāng)初始pH值為12.0時(shí),菌株的脫氮能力下降,硝氮與總氮去除率分別為93.08%及53.78%,高于已有報(bào)道[20-21]的耐堿好氧反硝化菌。由此可知,瓊氏不動(dòng)桿菌5-2能夠很好地適應(yīng)強(qiáng)堿環(huán)境,并表現(xiàn)出優(yōu)異的反硝化能力。綜上,確定最佳初始pH值為10.0。

圖6 初始pH值對(duì)脫氮性能的影響Fig.6 Effect of initial pH value on denitrification performance

4)轉(zhuǎn)速。溶解氧濃度對(duì)菌株的生長(zhǎng)速率和傳質(zhì)速率有重要的影響[22],試驗(yàn)中通常通過(guò)轉(zhuǎn)速來(lái)控制溶解氧的濃度。培養(yǎng)72 h后,不同轉(zhuǎn)速下菌株生長(zhǎng)及脫氮情況如圖7所示。

圖7 轉(zhuǎn)速對(duì)脫氮性能的影響Fig.7 Effect of rotation rate on denitrification performance

由圖7可知,在一定范圍內(nèi)轉(zhuǎn)速的增加有利于菌株進(jìn)行反硝化作用,當(dāng)超過(guò)該范圍,轉(zhuǎn)速的增加反而會(huì)有相反效果。在轉(zhuǎn)速由30 r/min升至90 r/min時(shí),菌株生長(zhǎng)良好(OD600值為0.615),其脫氮能力增強(qiáng),硝氮與總氮的去除率分別可達(dá)97.05%及58.58%;但當(dāng)轉(zhuǎn)速升高至120及 150 r/min時(shí),菌株反硝化能力明顯下降,其中轉(zhuǎn)速為150 r/min時(shí),脫氮效果最差,此時(shí)OD600值為0.425,硝氮與總氮的去除率分別為73.37%及41.28%。這說(shuō)明瓊氏不動(dòng)桿菌5-2可能存在溶解氧閾值,當(dāng)超過(guò)閾值,提高轉(zhuǎn)速反而不利于菌株進(jìn)行反硝化[23]。綜上,確定最適轉(zhuǎn)速為90 r/min。

5)溫度。已有報(bào)道[24]的大多數(shù)好氧反硝化菌最適溫度為30～37 ℃。培養(yǎng)72 h后,不同溫度下菌株生長(zhǎng)及脫氮情況如圖8所示。由圖8可知,過(guò)低或過(guò)高的溫度不利于菌株的生長(zhǎng)及氮的去除。當(dāng)溫度為20 ℃,菌株生長(zhǎng)不佳,脫氮率最低;當(dāng)溫度為30～35 ℃時(shí),菌株的OD600值和脫氮率明顯上升,其中溫度為35 ℃時(shí),硝氮及總氮去除率最高分別為97.27%及56.34%;但是當(dāng)溫度繼續(xù)升高至40 ℃時(shí),菌株OD600值和脫氮率又有所下降。由此可見(jiàn),當(dāng)溫度低于30 ℃或高于35 ℃時(shí)不利于菌株反硝化作用的進(jìn)行。因此,確定最適宜反硝化溫度為35 ℃。

圖8 溫度對(duì)脫氮性能的影響Fig.8 Effect of temperature on denitrification performance

6)鹽質(zhì)量濃度。鹽質(zhì)量濃度的增加對(duì)細(xì)菌的影響顯著。培養(yǎng)72 h后,不同鹽質(zhì)量濃度下菌株生長(zhǎng)及脫氮情況如圖9所示。由圖9可知,隨著鹽質(zhì)量濃度的增加,菌株的脫氮能力逐漸下降。在鹽質(zhì)量濃度為10 ～30 g/L時(shí),鹽質(zhì)量濃度對(duì)菌株的生長(zhǎng)和反硝化速率影響較小,硝氮去除率均大于90%,這與菌株TJPU04[25]在鹽質(zhì)量濃度試驗(yàn)中的表現(xiàn)相似;當(dāng)鹽質(zhì)量濃度升至為40和50 g/L時(shí),細(xì)菌OD600值及脫氮率出現(xiàn)明顯下降,鹽質(zhì)量濃度為50 g/L時(shí)降至最低,此時(shí)OD600值為0.119,硝氮去除率降至8.98%,總氮去除率降至2.12%?？傮w而言,瓊氏不動(dòng)桿菌5-2的耐鹽能力要強(qiáng)于一般好氧反硝化菌[26],這可能是由于該菌株能夠產(chǎn)生一些代謝物質(zhì)使其在一定鹽質(zhì)量濃度下保持滲透平衡[27]。由此證明瓊氏不動(dòng)桿菌5-2具有處理一定濃度含鹽廢水的潛力。

圖9 鹽質(zhì)量濃度對(duì)脫氮性能的影響Fig.9 Effect of salt mass concentration on denitrification performance

2.5 脫氮特性研究

在上述各個(gè)因素最佳條件下瓊氏不動(dòng)桿菌5-2培養(yǎng)120 h后硝氮、亞硝氮、氨氮、總氮的質(zhì)量濃度及OD600值變化情況如圖10所示。

圖10 瓊氏不動(dòng)桿菌5-2的反硝化過(guò)程Fig.10 Process of denitrification of Acinetobacter junii strain 5-2

由圖10可知：在培養(yǎng)24 h后,菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600值為0.557),硝氮質(zhì)量濃度下降至4.05 mg/L,總氮質(zhì)量濃度下降為27.22 mg/L,出現(xiàn)明顯的亞硝氮積累(18.92 mg/L)及少量氨氮(5.96 mg/L),其中氨氮的少量積累可能與菌株的生長(zhǎng)有關(guān)[28];培養(yǎng)48 h后,菌株硝氮質(zhì)量濃度為2.82 mg/L,亞硝氮質(zhì)量濃度開(kāi)始下降(15.24 mg/L),氨氮質(zhì)量濃度為7.16 mg/L;培養(yǎng)72 h后,菌株的硝氮質(zhì)量濃度及亞硝氮質(zhì)量濃度分別下降為1.03及10.55 mg/L,氨氮質(zhì)量濃度則上升為8.41 mg/L,這可能與部分細(xì)菌的衰亡有關(guān);當(dāng)繼續(xù)培養(yǎng)至120 h后,菌株OD600值降為0.566,此時(shí)硝氮質(zhì)量濃度(0.89 mg/L)及總氮質(zhì)量濃度(14.45 mg/L)均降至最低。結(jié)果表明,氮的去除與細(xì)菌的生長(zhǎng)呈現(xiàn)良好的一致性,并且在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中,可觀察到亞硝氮先積累后下降及氨氮的少量積累,Yang等[29]、Zou等[30]報(bào)道的好氧反硝化菌也被觀察到類似情況。

2.6 酶活性及脫氮基因的檢測(cè)

理論上,好氧反硝化菌主要利用硝酸鹽還原酶(nitrate reductase, NAR)和亞硝酸鹽還原酶(nitrite reductase, NIR)進(jìn)行反硝化作用。其中NAR常見(jiàn)編碼基因?yàn)閚apA,NIR常見(jiàn)編碼基因?yàn)閚irK及nirS[31]。因此,可通過(guò)檢測(cè)相關(guān)酶活性及基因來(lái)驗(yàn)證瓊氏不動(dòng)桿菌5-2的好氧反硝化能力。

表3 瓊氏不動(dòng)桿菌5-2的關(guān)鍵酶活力

瓊氏不動(dòng)桿菌5-2的基因檢測(cè)結(jié)果如圖11所示,可以看出只有nirK基因被成功擴(kuò)增。

圖11 瓊氏不動(dòng)桿菌5-2反硝化基因的擴(kuò)增Fig.11 The amplification of denitrification genes of Acinetobacter junii strain 5-2

類似地,在王賀等[32]的研究中也未能檢測(cè)出napA基因。據(jù)此推測(cè)可能有以下3個(gè)原因：(1)瓊氏不動(dòng)桿菌5-2為革蘭陽(yáng)性菌,而目前篩選得到的好氧反硝化菌大都為革蘭陰性菌,革蘭陽(yáng)性菌代謝復(fù)雜,可能存在其他代謝途徑[33];(2)好氧反硝化機(jī)理尚缺乏系統(tǒng)性研究,可能存在未被鑒定出的反硝化酶基因[34];(3)硝氮異化為銨或發(fā)生同化作用[35]。此外,nirK基因的成功擴(kuò)增則表明瓊氏不動(dòng)桿菌5-2具有將亞硝氮還原為一氧化氮的能力,也符合之前的研究[36]中nirS與nirK基因不能同時(shí)表達(dá)的觀點(diǎn)。因此,雖然napA基因未能被檢測(cè)出來(lái),但是不能否認(rèn)瓊氏不動(dòng)桿菌5-2具備好氧反硝化能力。

3 結(jié) 論

1)從上海市稻田土壤中分離出一株耐堿好氧反硝化瓊氏不動(dòng)桿菌5-2,并通過(guò)單因素影響試驗(yàn)確定其最佳脫氮條件。在此條件下,培養(yǎng)120 h后菌株對(duì)硝氮及總氮的去除率分別為97.83%及65.85%。

2)瓊氏不動(dòng)桿菌5-2能適應(yīng)強(qiáng)堿環(huán)境及一定鹽質(zhì)量濃度范圍。當(dāng)pH值為10.0～12.0時(shí),鹽質(zhì)量濃度范圍為10～30 g/L時(shí),菌株均能正常生長(zhǎng)并表現(xiàn)出良好的脫氮效率。此外,相關(guān)酶活性及基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證明瓊氏不動(dòng)桿菌5-2具有將硝氮及亞硝氮還原為氣體產(chǎn)物的能力,為處理實(shí)際復(fù)雜廢水提供了理論依據(jù)。