戴玉潔，常 林，趙復(fù)慶

（中國科學(xué)院重慶綠色智能技術(shù)研究院，綜合分析測試中心，重慶 400714）

為了深入探索物質(zhì)規(guī)律，揭示科學(xué)問題的本質(zhì)，科研工作中通常會結(jié)合光學(xué)顯微鏡、掃描電子顯微鏡（SEM）、原子力顯微鏡（AFM）、顯微拉曼光譜儀等各種儀器對材料、芯片等目標(biāo)分析物進(jìn)行多維度的分析，以獲取更全面、準(zhǔn)確的特征.上述儀器已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于各個學(xué)科的研究中，然而當(dāng)前主流的技術(shù)手段對不同維度數(shù)據(jù)的分析呈現(xiàn)割裂狀態(tài)，對于同一微區(qū)目標(biāo)樣品的原位聯(lián)合分析仍缺乏有效手段.尤其是主流高端科學(xué)儀器處于國外壟斷狀態(tài)，市場成熟的聯(lián)用產(chǎn)品通常造價較高，也無法同時實(shí)現(xiàn)多種科學(xué)儀器的聯(lián)用.

光電關(guān)聯(lián)顯微鏡技術(shù)（correlative light and electron microscopy，CLEM）可將樣品同一區(qū)域的光學(xué)顯微圖像和電子顯微圖像聯(lián)動，從而實(shí)現(xiàn)樣品表面跨尺度（毫米尺度光學(xué)成像到微納尺度電子成像）形貌研究，以及同一區(qū)域電子圖像與光學(xué)圖像的嵌合，以更全面的獲取樣品表面形貌特征.這種技術(shù)同時結(jié)合了光學(xué)顯微鏡大視野和電子顯微鏡高分辨大景深的技術(shù)優(yōu)勢，能實(shí)現(xiàn)諸多光學(xué)顯微鏡下工作儀器（如AFM、顯微拉曼光譜等）的聯(lián)用，因而在眾多學(xué)科領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1-5].

拉曼光譜廣泛應(yīng)用于二維材料層數(shù)的表征及半導(dǎo)體器件及材料性能的研究.目標(biāo)區(qū)域半導(dǎo)體材料的快速定位對于半導(dǎo)體器件的表征及制備有重要意義，目前工作流程仍停留在肉眼判定和大范圍篩查上.研究人員在拉曼光譜下定位到目標(biāo)樣品后，較難在SEM、激光直寫、AFM 等儀器中定位至同一位置，大大影響了樣品表征的效率以及半導(dǎo)體器件電極的制備效率.此外，表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）可以快速、無損地檢測目標(biāo)分析物[6]，但在實(shí)際應(yīng)用中仍面臨重復(fù)性差、靈敏度低等問題.常見的SERS 基底包括芯片型[7-9]、納米顆粒溶膠[10-14]型，其中芯片型基底具有較高的一致性和穩(wěn)定性，表面增強(qiáng)區(qū)域分布均一，但其靈敏度仍有一定限制.納米顆粒溶膠型基底具有強(qiáng)烈的局域表面等離激元共振效應(yīng)和密集的熱點(diǎn)，靈敏度較高，但由于納米顆粒溶膠的團(tuán)聚過程不可控，該類型的基底穩(wěn)定性和一致性較低.為實(shí)現(xiàn)高性能的SERS 分析，納米顆粒溶膠在基底設(shè)計中不可或缺，但如何提升其穩(wěn)定性和一致性，以及如何選取合適的區(qū)域進(jìn)行SERS 檢測至關(guān)重要.對于該區(qū)域的光學(xué)圖像、電子圖像、元素分布圖像的原位嵌合以及跨尺度形貌表征是探明其增強(qiáng)機(jī)制和優(yōu)化基底設(shè)計策略的前提.

為此，本文開發(fā)了分區(qū)帶標(biāo)記的光學(xué)標(biāo)尺及配套定制樣品臺，將其坐標(biāo)與電子顯微鏡坐標(biāo)相對應(yīng)，通過掃描電子顯微鏡-能譜儀大面積拼接功能獲得樣品不同區(qū)域元素分布情況，實(shí)現(xiàn)了大面積電子圖像及能譜圖像的拼接及與光學(xué)圖像的同步，從而實(shí)現(xiàn)SERS 基底目標(biāo)區(qū)域的多維度、跨尺度信息獲取，為相關(guān)機(jī)制研究提供有力支撐.

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

定制樣品臺、標(biāo)尺制備所需儀器與材料：石英玻璃（定制，4 cm ×4 cm ×2 mm）；CNC 定制鋁合金（6061 型）；S1805 光刻膠（Microchem，美國）；顯影液（Microchem，美國）；勻膠機(jī)（EZ4，江蘇雷博，中國）；激光直寫機(jī)（DWL 66Fs，Heidelberg，德國）；濺射鍍膜機(jī)（DP650，Alliance concept，法國）；異丙醇（百靈威，中國）；丙酮（科隆試劑，中國）.分析測試設(shè)備包括：場發(fā)射掃描電子顯微鏡（JSM-7800F，JEOL，日本），光學(xué)顯微鏡（Primostar1，Zeiss，德國），高拍儀（GP1500AF，廣州科密，中國），原子力顯微鏡（Dimension EDGE，Bruker，德國），激光共聚焦拉曼光譜儀（InVia Reflex，Renishaw，英國）.試驗(yàn)所用試劑均為分析純，沒有進(jìn)一步純化處理，去離子水由實(shí)驗(yàn)室純水機(jī)制得.

1.2 CLEM 定位樣品臺的設(shè)計與制作

1.2.1 樣品臺的設(shè)計與制作

本文定制的CLEM 樣品臺分為上下兩個部分，其設(shè)計如圖1（a）（c）所示，下方紅色部分為樣品臺底座，上方灰色部分為標(biāo)尺邊框，其中下方紅色部分主要起樣品承載作用以及與SEM 標(biāo)準(zhǔn)樣品臺的固定連接，上方灰色部分為鏤空框架，用以搭載定位標(biāo)尺，上下兩部分通過卡扣結(jié)合.使用50 mm×50 mm× 5 mm 的鋁合金板，通過數(shù)控車床CNC 按設(shè)計圖紙進(jìn)行切割加工，得到試驗(yàn)所需定制樣品臺，如圖1（b）所示.

圖1 定制樣品臺（a）（c）設(shè)計圖及（b）實(shí)物圖Fig. 1 (a) (c) Design drawings and (b) physical drawing of customized sample stage

1.2.2 定位標(biāo)尺的制作

選擇2 mm 厚的透明石英片作為定位標(biāo)尺的基底，通過微納加工的方式在石英片的一面標(biāo)記坐標(biāo)，具體加工流程如圖2（a）所示.

圖2 （a）標(biāo)尺加工流程圖，（b）標(biāo)尺實(shí)物圖Fig. 2 (a) Flow chart of ruler processing, (b) physical drawing of ruler

首先，在石英片上旋涂一層S1805 光刻膠并進(jìn)行前烘程序，使用激光直寫機(jī)將預(yù)先設(shè)計好的標(biāo)尺圖形曝光到涂有光刻膠的石英片上，之后對曝光的基片進(jìn)行顯影處理，并用N2槍吹干.顯影后的基片采用濺射鍍膜儀先后進(jìn)行Cr 20 nm 及Au 100 nm濺射，之后用丙酮超聲清洗5 min 剝離剩余光刻膠.最后以異丙醇、去離子水分別清洗石英片并用N2槍吹干，即可獲得覆有坐標(biāo)的標(biāo)尺，如圖2（b）所示.其中標(biāo)尺的尺寸為4 cm × 4 cm，每個微區(qū)大小為2 mm ×2 mm，每個微區(qū)分別以字母A 至T 代表行數(shù)，以數(shù)字1 至20 代表列數(shù)進(jìn)行標(biāo)記.

1.3 CLEM 樣品臺的快速定位分析流程

使用CLEM 標(biāo)尺進(jìn)行定位時，首先采用標(biāo)尺上的微區(qū)對目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行粗定位，之后以目視判斷的方法對微區(qū)內(nèi)的光學(xué)特征與電子顯微特征進(jìn)行對照，以實(shí)現(xiàn)原位圖像嵌合.具體流程如圖3（a）所示：

圖3 CLEM 樣品臺用于快速定位分析Fig. 3 Correlative light and electron microscopy sample stage for rapid localization analysis

（1）將負(fù)載有目標(biāo)分析物（實(shí)驗(yàn)室制備的WS2[15]）的硅片用碳導(dǎo)電膠帶固定在定制的樣品臺底座上，并將定制樣品臺用導(dǎo)電膠帶固定到SEM 標(biāo)準(zhǔn)樣品臺上.

（2）將帶有標(biāo)尺的石英片覆蓋在上述第一步固定有目標(biāo)分析物的定制樣品臺中，并用高拍儀從俯視視角拍攝樣品臺（從上至下包含樣品臺標(biāo)尺，硅片，樣品臺底座和SEM 標(biāo)準(zhǔn)樣品臺）.

（3）將上述高拍儀拍攝的圖像導(dǎo)入能譜儀軟件AZtec，然后去掉帶標(biāo)尺的石英片，將第一步固定好的樣品送入SEM 樣品倉內(nèi).

（4）利用第三步導(dǎo)入的樣品圖像，使用能譜儀軟件AZtec 圖像配準(zhǔn)功能，實(shí)現(xiàn)能譜儀軟件控制樣品臺定位和導(dǎo)航.在SEM 觀察模式下進(jìn)行微區(qū)形貌分析，確定目標(biāo)分析位點(diǎn)，并拍攝相應(yīng)的SEM 形貌圖[如圖3（b）所示].此時，在能譜儀軟件AZtec 圖像配準(zhǔn)模式下讀出該處目標(biāo)區(qū)域標(biāo)尺坐標(biāo).

（5）將第一步固定好樣品的定制樣品臺取下，根據(jù)樣品表征需要放入拉曼光譜儀、光學(xué)顯微鏡和AFM，根據(jù)第四步所得標(biāo)尺坐標(biāo)值，分別快速定位至檢測區(qū)域，在目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行拉曼檢測[圖3（c）]、光學(xué)圖像拍攝[圖3（d）]、AFM 表征[圖3（e）]，獲得相應(yīng)表征數(shù)據(jù).

2 結(jié)果與討論

2.1 利用CLEM 樣品臺表征二維材料

按照1.3 項(xiàng)下的快速定位分析流程表征實(shí)驗(yàn)室制備的WS2二維材料.圖4 為同一WS2樣品點(diǎn)在光學(xué)顯微鏡、SEM、拉曼光譜、AFM 下獲得的材料信息.使用CLEM 樣品臺快速定位后，能夠?qū)崿F(xiàn)樣品的粗定位和導(dǎo)航，在進(jìn)行SEM 拍攝時，其對應(yīng)區(qū)域的圖像信息可與光學(xué)顯微鏡圖像進(jìn)行對照，實(shí)現(xiàn)原位圖像嵌合.如圖4（a）所示，WS2片層結(jié)構(gòu)粗定位于標(biāo)尺A1 區(qū)域，其對應(yīng)的光學(xué)圖像如圖4（a1）（a2）所示.根據(jù)其粗定位坐標(biāo)可快速在SEM 中定位單個WS2材料的位置，對應(yīng)的SEM 圖像如圖4（a3）（a4）所示，對照光學(xué)和對應(yīng)的SEM 圖像確定嵌合，其嵌套精度可達(dá)微米尺度.同時利用光學(xué)導(dǎo)航定位，實(shí)現(xiàn)了相同位置拉曼光譜儀中單個WS2材料的快速定位與mapping 分析，如圖4（b）所示，其特征結(jié)構(gòu)與光學(xué)顯微圖像及SEM 圖像吻合，證實(shí)所制備的快速定位樣品臺的優(yōu)越性.并且利用該樣品臺快速定位至單個WS2材料對其成分[圖4（c）]及層厚進(jìn)行分析[圖4（d）].表明所設(shè)計的CLEM 樣品臺可實(shí)現(xiàn)快速定位，并聯(lián)合高分辨電子顯微圖像、AFM、拉曼光譜對同一位置、同一WS2樣品點(diǎn)實(shí)現(xiàn)成分、形貌、厚度等多種信息的原位表征.

圖4 （a1）（a2）A1 區(qū)域左側(cè)WS2 樣品光學(xué)顯微圖像及（a3）（a4）電子顯微圖像，（b）同一位置的拉曼mapping 圖，（c）WS2樣品拉曼譜圖，（d）WS2 樣品AFM 厚度測定Fig. 4 (a1) (a2) Optical microscopy images and (a3) (a4) electron microscopy images of WS2 at left of region A1, (b) Raman mapping results of same location, (c) Raman spectrum of WS2, (d) AFM image of WS2

2.2 利用CLEM 樣品臺解析雙咖啡環(huán)增強(qiáng)機(jī)制

本課題組已通過耦合金納米棒和陷光結(jié)構(gòu)石英片，制備了一種基于雙咖啡環(huán)效應(yīng)的新型基底，所制備的新型基底為疏水陷光結(jié)構(gòu).陷光結(jié)構(gòu)由刻蝕石英片后形成，呈凹凸結(jié)構(gòu)，陣列排布，該結(jié)構(gòu)能保護(hù)金納米棒不被解吸并提高基底穩(wěn)定性（如圖5所示）.金納米棒與陷光結(jié)構(gòu)組裝后，聚集在陷光結(jié)構(gòu)凹面上.陷光結(jié)構(gòu)還進(jìn)行了疏水化處理，避免下一個液滴與金納米棒接觸[16].不同于傳統(tǒng)SERS 基底，該基底能夠?qū)崿F(xiàn)高靈敏、高一致性檢測的區(qū)域僅位于雙咖啡環(huán)交叉處.在試驗(yàn)過程中，需要反復(fù)定位同一位置咖啡環(huán)，并對其進(jìn)行分析，利用現(xiàn)有的光學(xué)顯微鏡及SEM 很難實(shí)現(xiàn)定位嵌合，但所設(shè)計的CLEM 樣品臺可以在不同分析儀器（如SEM、SERS 等）間實(shí)現(xiàn)同一位置咖啡環(huán)的重復(fù)定位.通過能譜大面積拼接元素分布分析驗(yàn)證了目標(biāo)分析物以及金納米顆粒溶膠在咖啡環(huán)上的富集，聯(lián)合拉曼光譜技術(shù)驗(yàn)證了基于雙咖啡環(huán)效應(yīng)下SERS 檢測性能的提升.通過高分辨掃描電子圖像進(jìn)一步揭示了雙咖啡環(huán)效應(yīng)的底層原理，最終實(shí)現(xiàn)了三苯基錫的快速檢測.

圖5 陷光結(jié)構(gòu)微觀形貌[16]Fig. 5 SEM of light-confining structures[16]

使用定制的CLEM 樣品臺以及大面積拼接能譜功能對單、雙咖啡環(huán)區(qū)域進(jìn)行大面積成像[圖6（a）]和元素分布[圖6（b）（c）]分析，證實(shí)了金納米棒在第一咖啡環(huán)形成時同步組裝在陷光結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，金納米棒在咖啡環(huán)效應(yīng)的作用下大部分分布到液滴邊沿，在毛細(xì)力作用下進(jìn)行組裝，該結(jié)果由能譜大面積拼接決定[圖6（c）].目標(biāo)分析物三苯基錫在第二咖啡環(huán)形成時，在其與第一咖啡環(huán)交叉處與金納米棒充分混合、吸附，待液滴完全揮發(fā)后，待測物完全吸附在金納米棒的表面，形成共混的自組裝體系，使待測物充分的分布在熱點(diǎn)區(qū)域，目標(biāo)分析物的分布由能譜大面積拼接決定[圖6（b）].由于咖啡環(huán)效應(yīng)，該體系位于陷光結(jié)構(gòu)的作用區(qū)域內(nèi)，在陷光效應(yīng)下其電場強(qiáng)度得到進(jìn)一步的增強(qiáng)，提高了SERS檢測的穩(wěn)定性和一致性，并且在咖啡環(huán)效應(yīng)和超疏水的雙重作用下，納米溶膠和待測物三苯基錫均會在咖啡環(huán)上充分富集，進(jìn)一步提高基底的靈敏度.

圖6 （a）雙咖啡環(huán)的大面積拼接掃描電子圖像，（b）雙咖啡環(huán)中第二咖啡環(huán)的分析物分布，（c）雙咖啡環(huán)中第一咖啡環(huán)的金納米顆粒分布，（d）陷光結(jié)構(gòu)耦合雙咖啡環(huán)基底與單獨(dú)陷光結(jié)構(gòu)及納米顆?；椎男阅軐Ρ?，（e）三苯基錫SERS 梯度檢測[16]Fig. 6 (a) Large area SEM image of inter coffee ring, (b) analyte distribution of second coffee ring, (c) gold nanorods distribution of first coffee ring, (d) SERS performance comparison of different structures, (e) triphenyltin SERS assay[16]

使用定制的CLEM 樣品臺對比了目標(biāo)分析物在陷光結(jié)構(gòu)內(nèi)、目標(biāo)分析物與金納米顆粒混合滴加在硅片上，以及雙咖啡環(huán)效應(yīng)下的基底SERS 性能[圖6（d）]，結(jié)果表明雙咖啡環(huán)效應(yīng)下的SERS 性能大幅提升.通過CLEM 聯(lián)用手段在顯微拉曼光譜儀下對目標(biāo)檢測區(qū)域快速定位，最終實(shí)現(xiàn)了高靈敏度、高一致性的三苯基錫檢測，檢測下限達(dá)到10-12mol/L[圖6（e）].

3 結(jié)論與展望

本研究設(shè)計制作了一種通過光學(xué)導(dǎo)航、目視粗定位以及顯微圖像定位結(jié)合的樣品臺及配套標(biāo)尺.快速實(shí)現(xiàn)了SEM 與光學(xué)顯微鏡及其他具有顯微光學(xué)系統(tǒng)的儀器（AFM、顯微拉曼光譜儀）聯(lián)用，大大增強(qiáng)了儀器聯(lián)用程度以及平臺的樣品原位數(shù)據(jù)分析能力.成功實(shí)現(xiàn)了二維材料SEM、拉曼以及AFM 聯(lián)合表征，聯(lián)合拉曼、SEM 以及大面積拼接功能，解析了SERS 基底的增強(qiáng)機(jī)制.該樣品臺及標(biāo)尺廣泛兼容了材料制備、分析過程中需使用到的多數(shù)儀器，大大提升了相關(guān)學(xué)科數(shù)據(jù)獲取能力，對其科研工作具有重要意義.由于當(dāng)前樣品臺的定位仍然需要目視嵌合，無法實(shí)現(xiàn)自動化微納米尺度的套準(zhǔn)，未來還可搭載電動位移臺、電驅(qū)系統(tǒng)以及與各儀器廠商的樣品臺適配等，集成原位拉伸、原位電化學(xué)等系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)更為全面的樣品分析.