摘要：分生孢子是青霉菌的無(wú)性繁殖細(xì)胞，其核型特征對(duì)青霉菌的生長(zhǎng)繁殖、遺傳育種等具有重要影響，用水瓊脂和察氏培養(yǎng)基在不同的培養(yǎng)天數(shù)中尋找單核分生孢子比例最高的條件。采用DAPI核染色法，熒光顯微觀(guān)察灰黃青霉Penicillium griseofulvum分生孢子在水瓊脂和察氏培養(yǎng)條件及不同天數(shù)的核型特征。結(jié)果表明：灰黃青霉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程分生孢子同時(shí)出現(xiàn)單核、雙核及多核現(xiàn)象，其核型具有多樣性。在不同培養(yǎng)基中的分生孢子各種核型的比例呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.001）；而在相同培養(yǎng)基，不同培養(yǎng)時(shí)間的特定核型的分生孢子占比相對(duì)穩(wěn)定，未呈現(xiàn)顯著差異（P＞0.05）。研究結(jié)果為更好地開(kāi)展灰黃青霉的遺傳操作提供理論參考。

關(guān)鍵詞：灰黃青霉；分生孢子核型；DAPI核染色法；核數(shù)

中圖分類(lèi)號(hào)：Q939.96文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：0253?2301（2024）12?0070?05

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.12.011

Analysis on Conidial Nuclear Number of Penicillium griseofulvum Under Different Culture Conditions

CAI Ya-ting1，ZHANG Jun-hang1，LI Jia-qi1，SHI Bi-hong1，2*

（1.College of Life Sciences，F(xiàn)ujian Normal University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350117，China;2.National EngineeringResearch Center of Industrial Microbiology and Fermentation Technology，F(xiàn)ujian Normal University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian350117，China）

Abstract：Conidia are asexual reproduction cells ofPenicillium，and their karyotype characteristics have an important influence on the growth，reproduction，genetic breeding of Penicillium.The conditions for achieving the highest proportion of haploconidium were found by using water agar and Czapek-Dox medium over different cultivated days.The karyotype characteristics of conidiospores of Penicillium griseofulvum were observed under fluorescence microscopy by using DAPI staining，with the observations being conducted under water agar and Czapek-Dox medium conditions over different time periods.The results showed that during the growth and development of Penicillium griseofulvumconidia，mononuclear，binucleate，and multinucleate phenomena were concurrently observed，with diverse karyotypes.The proportions of various karyotypes among conidia in different media exhibited significant differences（P＜0.001）.However，in the same medium，the proportion of conidia with specific karyotypes at different culture times remained relatively stable，showing no significant difference（P＞0.05）.These results provided a theoretical reference for better genetic manipulation of Penicillium griseofulvum.

Key words：Penicilliumgriseofulvum；Conidial karyotype；DAPI staining；Nuclear number

青霉菌是一類(lèi)具有重要用途的絲狀真菌，在工業(yè)和生物制藥領(lǐng)域，尤其是抗生素等次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)方面發(fā)揮著重要作用。與其他絲狀真菌一樣，青霉菌的基本結(jié)構(gòu)由菌絲和孢子組成，菌絲通常由孢子萌發(fā)形成芽管，再通過(guò)芽管不斷生長(zhǎng)成絲狀或管狀的菌體，并通過(guò)延伸和分枝形成復(fù)雜的菌絲體。青霉菌主要依靠無(wú)性繁殖，分生孢子是其無(wú)性繁殖的主要細(xì)胞類(lèi)型。近期研究顯示，一些青霉菌的分生孢子具有多核性，例如，俞沁如等[1]通過(guò)DAPI染色發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展青霉的分生孢子多為雙核或多核。分生孢子的核型特征對(duì)青霉菌的生長(zhǎng)發(fā)育及遺傳育種具有重要意義，多核分生孢子具有較強(qiáng)的生存和抗逆能力，但也可能影響基因操作和遺傳育種的穩(wěn)定性。然而，同源重組研究多集中于單核細(xì)胞，因?yàn)閱魏思?xì)胞的核型單一，便于基因操作，而多核分生孢子可能影響遺傳體系操作的結(jié)果，如同源重組后產(chǎn)生的異核真菌增加實(shí)驗(yàn)復(fù)雜性。因此，明確特定青霉菌分生孢子的核型特征對(duì)于更好地開(kāi)發(fā)和利用該物種資源具有理論和實(shí)踐雙重意義。

灰黃青霉是青霉屬常見(jiàn)物種，以其大帚狀枝、多分枝點(diǎn)和短瓶梗為特征，易于分離且是灰黃霉素的主要生產(chǎn)菌?；尹S青霉因其抗真菌和抗增殖活性在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域備受關(guān)注[2]。早期研究普遍認(rèn)為青霉菌的分生孢子為單核，例如，F(xiàn)letcher[3]最初描述灰黃青霉的分生孢子細(xì)胞核為單核。而Sekiguchi等[4]通過(guò)掃描電子顯微鏡研究發(fā)現(xiàn)，蕁麻青霉的分生孢子在出芽時(shí)有雙核特征，其中一個(gè)核位于胚管發(fā)育部位，并在發(fā)芽過(guò)程中遷移到新的芽管中。此前關(guān)于灰黃青霉的研究主要集中在其萌發(fā)過(guò)程中核行為的變化，缺乏關(guān)于不同培養(yǎng)時(shí)間下核型分析的報(bào)道。

真菌細(xì)胞核染色的方法多種多樣，較早的海登漢氏蘇木精法[5]（Hayden-Hamilton hematoxylin method）是一種用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的染色技術(shù)，主要用于細(xì)胞核的染色?？嫡裆萚6]提出改進(jìn)式海登漢氏蘇木精法。Giemsa染色法則包括：制定涂片、固定細(xì)胞、染色、洗滌、干燥和觀(guān)察[7]。但這些方法在染色程序方面相對(duì)煩瑣。目前細(xì)胞核染色常用的熒光染料有：DAPI（4′，6-二脒基-2-苯基吲哚）、雙苯丙咪唑Hosechst 33258和Mithraymcim，這幾個(gè)染料均能與核酸中的堿基相結(jié)合，作為染料有高特異性，染色過(guò)程中所需濃度相對(duì)較低，且染色程序便捷[8]。DAPI是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料[9]。和雙鏈DNA結(jié)合后可以產(chǎn)生比DAPI自身強(qiáng)20多倍的熒光，結(jié)合作用強(qiáng)，在與DNA小溝的AT豐富序列結(jié)合[10?12]后在顯微鏡紫外波段光（405 nm）的激發(fā)下可以觀(guān)察到藍(lán)色熒光的細(xì)胞核[13?14]。

灰黃青霉F-208是林琳等以Penicillumpatulum（灰黃青霉Penicillumgriseofulvum的異名）D-756為出發(fā)菌株經(jīng)復(fù)合誘變育種獲得的灰黃霉素高產(chǎn)突變菌株[15]。本試驗(yàn)旨在通過(guò)DAPI染色法分析灰黃青霉F-208分生孢子的核型及核數(shù)目，以明確其在不同條件下的核數(shù)變化，并結(jié)合已完成的基因組測(cè)序，為進(jìn)一步研究灰黃青霉遺傳體系的構(gòu)建和同核子篩選提供理論數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

灰黃青霉Penicillumgriseofulvum F-208菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存于?80℃冰箱中。

1.2試驗(yàn)培養(yǎng)基

（1）察氏培養(yǎng)基：蔗糖3 g、氯化鉀0.05 g、硝酸鈉0.3 g、磷酸二氫鉀0.1 g、硫酸亞鐵0.001 g、硫酸鎂0.05 g、瓊脂2 g，加蒸餾水至100 mL，pH自然。121℃、0.1 MPa，高壓滅菌20 min。（2）水瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂2 g；加蒸餾水至100 mL；pH自然。121℃，0.1 MPa，高壓滅菌20 min。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1灰黃青霉分生孢子懸液制備將從4℃冰箱中取出的灰黃青霉F-208接種到察氏斜面上，在28℃下培養(yǎng)9 d。用無(wú)菌水洗下孢子，轉(zhuǎn)移到離心管中并稀釋至濃度107個(gè)·mL?1。取100μL孢子懸液涂布于90 mm察氏和水瓊脂培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)。察氏培養(yǎng)基在5、7、9、11、15 d收集孢子；水瓊脂培養(yǎng)基在5、7、9、11、13、15、20、25 d收集孢子，每組3個(gè)重復(fù)，濕度保持＞70%。用0.9%生理鹽水刮取孢子并過(guò)濾，離心洗滌后重懸。

1.3.2灰黃青霉細(xì)胞核染色取20μL孢子懸液滴加在載玻片中央，加熱固定孢子懸液，4%多聚甲醛再次固定10 min，固定完成后，用0.9%的1×PBS緩沖液洗滌3次，每次3～5 min，用1%Triton-X-100的生理鹽水室溫下處理5 min，用0.9%的1×PBS緩沖液洗滌3次，每次3～5 min，加入DAPI染料于室溫暗環(huán)境下染色10 min，吸除DAPI染料，用0.9%的1×PBS緩沖液洗滌3次，每次3～5 min，加入DAPI封片液后于生物熒光顯微鏡下觀(guān)察[16]。

1.3.3生物熒光顯微鏡觀(guān)察及照相待染色完成后，采用OLYMPUS BX 53顯微鏡進(jìn)行觀(guān)察DAPI染色后的孢子核型，運(yùn)用cellSens Standard軟件對(duì)圖像進(jìn)行采集。每個(gè)培養(yǎng)條件的樣本觀(guān)察N大于500個(gè)分生孢子，并進(jìn)行核型分析及核數(shù)目統(tǒng)計(jì)（目鏡10×，物鏡100×的圖片進(jìn)行計(jì)數(shù)）。

2結(jié)果與分析

2.1灰黃青霉分生孢子細(xì)胞核染色結(jié)果

灰黃青霉分生孢子經(jīng)DAPI核染色后于熒光顯微鏡下進(jìn)行鏡檢，細(xì)胞核與DAPI染料結(jié)合之后在紫外光的激發(fā)下顯示出藍(lán)色熒光。由于在目鏡10×，物鏡40×條件下難以辨析分生孢子是否為多核，而于熒光場(chǎng)為100倍物鏡下可清晰觀(guān)察到灰黃青霉分生孢子不同數(shù)目的核型。單核、雙核以及多核核型于察氏培養(yǎng)基和水瓊脂培養(yǎng)基以及不同天數(shù)都有存在，見(jiàn)圖1。

2.2不同培養(yǎng)條件下灰黃青霉分生孢子的細(xì)胞核數(shù)分析

由表1可知，察氏培養(yǎng)基中灰黃青霉分生孢子的核型情況，其中單核和雙核占主要部分，由于三核及以上的數(shù)目不多，統(tǒng)稱(chēng)為多核。察氏培養(yǎng)基中不同培養(yǎng)時(shí)間采集的分生孢子單核平均占比約34.1%，雙核占比52.9%以及多核13.0%。方差分析表明，不同培養(yǎng)時(shí)間的特定核型分生孢子的百分比間未呈現(xiàn)顯著差異：?jiǎn)魏朔稚咦尤后w（T=0.783，DF=4，P=0.761 3）、雙核群體（T=0.384，DF=4，P=0.639 9）、多核群體（T=?0.190，DF=4，P=0.429 2）。說(shuō)明培養(yǎng)時(shí)間對(duì)特定環(huán)境（培養(yǎng)基）中灰黃青霉各分生孢子核型的占比無(wú)顯著影響。

由表2可知，灰黃青霉在水瓊脂培養(yǎng)基中的核型情況，其中單核占比為主要部分。水瓊脂培養(yǎng)基中不同培養(yǎng)時(shí)間采集的分生孢子單核平均占比約80.0%，雙核占比16.0%以及多核4.0%。方差分析結(jié)果表明，水瓊脂培養(yǎng)基中不同培養(yǎng)時(shí)間的特定核型分生孢子的占比未顯示顯著差異：?jiǎn)魏朔稚咦尤后w（T=0.018，DF=7，P=0.506 9）、雙核（T=?0.662，DF=7，P=0.264 4）、多核（T=0.517，DF=7，P=0.689 3）。情況與察氏培養(yǎng)基的類(lèi)似，即培養(yǎng)時(shí)間對(duì)灰黃青霉分生孢子的核型無(wú)明顯影響，說(shuō)明在特定營(yíng)養(yǎng)條件下，灰黃青霉分生孢子的各種核型比例相對(duì)穩(wěn)定。但水瓊脂培養(yǎng)基中灰黃青霉分生孢子的單核比例顯著高于察氏培養(yǎng)基（P＜0.001），而雙核與多核的比例則相反，即察氏培養(yǎng)基中雙核與多核分生孢子的比例都顯著高于水瓊脂培養(yǎng)基（P＜0.001）。說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)狀況對(duì)灰黃青霉的孢子核型有顯著影響。

3討論與結(jié)論

本試驗(yàn)采用DAPI染色法對(duì)灰黃青霉的分生孢子進(jìn)行核染色，發(fā)現(xiàn)灰黃青霉分生孢子核型在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有多樣性，單核、雙核與多核并存，這與目前發(fā)現(xiàn)的部分青霉及其他絲狀真菌相似。劉淼等[17]對(duì)粉擬青霉、環(huán)鏈擬青霉、玫煙色擬青霉用Hoechst 33 258染液進(jìn)行分生孢子核染色，用AO-120型落射熒光顯微鏡觀(guān)察到其分生孢子均出現(xiàn)多核。擴(kuò)展青霉在PDB平板上培養(yǎng)一定時(shí)間，經(jīng)過(guò)DAPI染色后于熒光顯微鏡觀(guān)察到分生孢子有單核和多核[18?19]。絲狀真菌中的曲霉菌也有很多被發(fā)現(xiàn)其分生孢子為多核[20]，如米曲霉分生孢子經(jīng)察氏培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，采用DAPI核染色法對(duì)其進(jìn)行染色，熒光顯微鏡觀(guān)察到分生孢子核呈現(xiàn)出不同核型[21]。本試驗(yàn)首次對(duì)灰黃青霉在不同培養(yǎng)基、不同培養(yǎng)時(shí)間的分生孢子核型變化進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在特定營(yíng)養(yǎng)條件下（培養(yǎng)基），培養(yǎng)時(shí)間對(duì)其核型變化無(wú)顯著影響（P＞0.1）；而營(yíng)養(yǎng)條件（培養(yǎng)基）的改變將顯著影響其分生孢子的核型分布（P＜0.001）。該結(jié)果對(duì)未來(lái)開(kāi)展灰黃青霉的相關(guān)遺傳操作如同核子篩選等具有重要的指導(dǎo)意義。

本研究采用DAPI核染色對(duì)灰黃青霉平板培養(yǎng)的孢子核數(shù)做了較系統(tǒng)研究，通過(guò)熒光染色觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)灰黃青霉分生孢子存在單核、雙核甚至是多核的現(xiàn)象。而Fletcher[3]通過(guò)液體振蕩培養(yǎng)的方式培養(yǎng)灰黃青霉，利用Giemsa染色觀(guān)察灰黃青霉分生孢子萌發(fā)過(guò)程中的形態(tài)以及核行為，發(fā)現(xiàn)單個(gè)孢子的細(xì)胞核最初為單核，萌發(fā)過(guò)程中核體積增加，隨之分裂為雙核，分裂后一個(gè)子核留在孢子中，另一個(gè)遷移到新形成的芽管中。該研究也提到一些分生孢子在萌發(fā)前細(xì)胞核有可能已經(jīng)發(fā)生分裂，但未提供詳細(xì)數(shù)據(jù)，這可能限于早期試驗(yàn)條件所致。本研究采用的DAPI染色可以穿透細(xì)胞膜與細(xì)胞核中的雙鏈DNA結(jié)合而發(fā)揮標(biāo)記作用，可以清晰觀(guān)察到灰黃青霉單核、雙核或多核分生孢子。類(lèi)似的結(jié)果在其他物種亦有發(fā)現(xiàn)，HU等[22]觀(guān)察冬蟲(chóng)夏草菌絲只有單個(gè)細(xì)胞核，但是Bushley等[23]和胡曉棣等[24]則發(fā)現(xiàn)其具有雙核甚至是多核的結(jié)果。染色方法的改進(jìn)，不同染色劑的使用等均可能導(dǎo)致結(jié)果的差異。可見(jiàn)技術(shù)的進(jìn)步推動(dòng)著科學(xué)的發(fā)展。

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（責(zé)任編輯：陳文靜）