馮 睿, 徐全忠, 王春偉, 王樂群, 馮 爽, 張海龍, 張 立, 張立果, 蘇小虎

(1. 內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院省部共建草原家畜生殖調(diào)控與繁育國家重點實驗室, 呼和浩特 010020;2. 內(nèi)蒙古烏蘭察布市涼城縣農(nóng)牧和科技局涼城縣畜牧工作站, 烏蘭察布 013750;3. 內(nèi)蒙古烏蘭察布市農(nóng)牧和科技局烏蘭察布市畜牧工作站, 烏蘭察布 012000)

超數(shù)排卵是利用外源性促性腺激素在一個發(fā)情周期內(nèi)誘導(dǎo)多個卵泡同時發(fā)育,結(jié)合胚胎移植技術(shù)實現(xiàn)優(yōu)良家畜個體快速繁殖。然而在生產(chǎn)應(yīng)用中,供體生產(chǎn)胚胎的效率受多方面影響。尋求合適的表征指標以進行供體篩選是提高超數(shù)排卵效率的可行手段之一。除了促卵泡激素(FSH)和促黃體生成素(LH)外,一些小分子代謝物也可以影響卵泡發(fā)育。已有研究表明,卵泡液中的一些代謝物不僅影響卵母細胞和顆粒細胞的質(zhì)量,還可以用來表征卵泡發(fā)育[1]。卵泡液中的脂肪酸濃度、氨基酸濃度、葡萄糖類代謝產(chǎn)物均可對卵子成熟產(chǎn)生影響,可用于卵泡發(fā)育狀態(tài)表征[2-4]。有研究表明,卵泡液的一些小分子物質(zhì)來自血液[5]。因此,血液中的某些代謝物將是反映卵泡發(fā)育狀況的可行指標。

本實驗選取年齡和體重相近的東佛里生綿羊作為供體,分別于卵泡刺激素(FSH)注射前(1st)和人工授精前(2nd)采集血液。外源FSH注射前,卵泡優(yōu)勢化成熟尚未啟動,此時應(yīng)全部為小卵泡。人工授精前,此時已確認供體發(fā)情,卵泡已成熟,卵母細胞進入成熟階段。采用LC-MS/MS進行非靶向代謝組學(xué)分析,研究超數(shù)排卵時血清代謝物與胚胎產(chǎn)生的關(guān)系,可以為胚胎生產(chǎn)中提供飼喂方面的理論依據(jù),也為卵子體外成熟培養(yǎng)體系的優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗地點與供體母羊管理

供體母羊飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古烏蘭察布市豐東知盈牧業(yè)科技有限公司。本研究選用的超數(shù)排卵供體為1～3歲身體健康、體重65～70 kg的經(jīng)產(chǎn)東佛里生綿羊。以母羊的營養(yǎng)需求為基礎(chǔ),在畜舍飼養(yǎng)中統(tǒng)一管理。飼料配比:13.60%苜蓿干草、27.30%羊草、4.60%玉米草、15.20%全株玉米青貯、15.20%玉米粒、24.10%母羊精料,粗精比為70∶30。

1.2 方法

1.2.1 超數(shù)排卵方法

試驗開始前首先進行發(fā)情檢測,選取未發(fā)情供體同期發(fā)情及超數(shù)排卵流程如下:隨機一天將CIDR(Zoetis, New Zealand)插入未發(fā)情期母羊陰道內(nèi),記為D0;在第10～12天,共250 μg FSH(Stimufol?,Belgium)以10%的遞減劑量注射6次;第一次注射FSH時,同步注射250 IU PMSG(Reprobiol,New Zealand);第5次FSH注射時,同步注射PG(Reprobiol,New Zealand)150 μg;最后一次注射FSH時去除CIDR;第13天,檢測發(fā)情,若母羊已發(fā)情,則人工授精2次(間隔12 h);第一次人工授精注射100 IU LH (Reprobiol,New Zealand);第19天,用鹽酸利多卡因麻醉后,通過手術(shù)沖洗子宮收集胚胎(圖1)。

圖1 綿羊超數(shù)排卵示意圖Figure 1 Schedule of ovine superovulation

1.2.2 血液樣品采集

卵泡刺激素(FSH)注射前(1st,D10)和人工授精前(2nd,D13)采血,保存在真空采血管中。然后12 000 r/min離心10 min,獲得血清。所有血清樣本均保存在液氮中,并立即運送到實驗室進行進一步分析。

1.2.3 代謝物的提取

首先,將樣品和預(yù)冷的甲醇通過渦旋混合。混合后的樣品在冰上孵化5 min,然后在15000 r/min,4 ℃下離心20 min。用LC-MS級別的水將部分上清液稀釋到含有53%甲醇的最終濃度。然后將樣品轉(zhuǎn)移到一個帶有0.22 μm過濾器的新離心管中,在15000 r/min、4 ℃下離心20 min。最后,將濾液注入LC-MS/MS系統(tǒng)處理。

1.2.4 LC-MS/MS分析

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Liquid Chromatograph Mass Spectrometer,LC-MS/MS)分析由諾禾致源公司處理。

LC-MS/MS分析使用Vanquish UHPLC系統(tǒng)(ThermoFisher)和Orbitrap Q Exactive系列質(zhì)譜儀(ThermoFishe)進行。樣品被注入Hyperil Gold柱(100×2.1 mm,1.9 μm),使用17 min的線性梯度,流速為0.2 mL/min。正極性模式的洗脫液為洗脫液A(水中0.1%FA)和洗脫液B(甲醇)。負極性模式的洗脫液為洗脫液A(5 mmol/L乙酸銨,pH 9.0)和洗脫液B(甲醇)。溶劑梯度設(shè)置:2%B,1.5 min;2%～85%B,3 min;100%B,10 min;100%～2%B,10 min;2%B,12 min。Q Exactive質(zhì)譜儀在正/負極性模式下運行,噴霧電壓為3.5 kV,毛細管溫度為320 ℃,鞘內(nèi)氣體流速為35 arb,輔助氣體流速為10 arb。

1.2.5 原始數(shù)據(jù)分析

使用Compound Discoverer 3.1(CD3.1,Thermo Fisher)對LC-MS/MS產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)文件進行處理。將峰與mzCloud(https:∥www.mzcloud.org/)和ChemSpider(http:∥www.chemspider.com/)數(shù)據(jù)庫進行匹配。使用統(tǒng)計軟件R(R-3.4.3版本)、Python(Python 2.7.6版本)和CentOS(CentOS 6.6版本)進行統(tǒng)計分析。

1.2.6 代謝物數(shù)據(jù)分析

使用HMDB(人類代謝組數(shù)據(jù)庫,http:∥www.hmdb.ca/)、KEGG(京都基因與基因組百科全書,http:∥www.genome.jp/kegg/)和Lipidmaps(脂質(zhì)代謝途徑研究計劃,https:∥lipidmaps.org/)數(shù)據(jù)庫對代謝物進行注釋。利用metaX進行主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)和偏最小二乘法判別分析(Partial Least Squares Discriminant Analysis,PLS-DA),單變量分析(t檢驗)來計算統(tǒng)計學(xué)意義(P值)。根據(jù)VIP(Variable important in projection,一般變量權(quán)重值)>1且P值<0.05,FC(Fold Change,差異倍數(shù))>1.2或FC<0.83條件篩選出的代謝物被認為是差異代謝物。

2 結(jié)果與分析

2.1 超數(shù)排卵供體黃體及胚胎形態(tài)觀察

超數(shù)排卵后第19天供體黃體形態(tài)如圖2(a)所示,為紅體狀態(tài)。E6.5胚胎大部分為桑葚胚,如圖2(b)所示。

(a)超數(shù)排卵后第19天供體黃體形態(tài);(b)E6.5胚胎。圖2 超數(shù)排卵供體黃體及胚胎形態(tài)Figure 2 Donor corpus luteum and embryonic morphology in sheep during multiple ovulation

2.2 代謝物總覽

研究共發(fā)現(xiàn)1 158種代謝物,其中,正離子模式下發(fā)現(xiàn)721種,負離子模式下437種。使用HMDB和KEGG對其進行注釋分析,共有617種被注釋,其中,正離子模式下350種,負離子模式下267種。正離子模式注釋顯示,代謝種類最多的是脂類和脂類分子(91個代謝物),其次是有機酸及其衍生物(63個代謝物)和有機雜環(huán)化合物(22個代謝物)。負離子模式注釋顯示,代謝種類最多的是脂類和脂類分子(81種),其次是有機酸及其衍生物(41種)和苯類(21種)。

2.3 多元統(tǒng)計分析

本研究應(yīng)用主成分分析(PCA)來確定綿羊超數(shù)排卵過程中血清代謝物之間的樣品分離和聚集程度。聚集的點表示觀察到的變量高度相似,離散的點代表觀察到的變量的顯著差異。結(jié)果顯示,在正離子模式下,PC1、PC2分別為20.55%和14.04%[圖3(a)];在負離子模式下,PC1、PC2分別為24.02%和16.09%[圖3(b)]。結(jié)果表明,綿羊超數(shù)排卵前后血清代謝物有明顯的分離,具有不同的代謝物特征。

(a)正離子模式;(b)負離子模式。圖3 綿羊超數(shù)排卵中血清代謝物主成分分析(PCA)Figure 3 Principal component analysis of the metabolites in sheep during multiple ovulation

研究采用偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)來確定各組之間的具體差異。在綿羊超數(shù)排卵前后血清代謝物的比較中,正離子模式下PLS-DA模型的R2Y為0.94,Q2Y為0.68[圖4(a)];負離子模式下PLS-DA模型的R2Y為0.92,Q2Y為0.70[圖4(b)]。這些結(jié)果表明,后續(xù)分析可信。

(a)正離子模式;(b)負離子模式。圖4 綿羊超數(shù)排卵中血清代謝物偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)Figure 4 PLS-DA score map of the metabolites in sheep duringmultiple ovulation

2.4 差異代謝物分析

根據(jù)VIP>1和FC>1.2或FC<0.83和P<0.05篩選,在兩次分析中鑒定出295個差異代謝物(175個為正離子模式,120個為負離子模式)。與1st相比,2nd上調(diào)代謝物186種(其中,正離子模式85種,負離子模式101種),下調(diào)代謝物共109種(其中,正離子模式90種,負離子模式19種)(圖5)。

(a)正離子模式;(b)負離子模式。圖5 綿羊超數(shù)排卵中血清代謝物熱圖Figure 5 Volcano plot results of the metabolites in sheep during multiple ovulation

第一次分析中優(yōu)勢代謝物含量最高的10種代謝物是2-Oxindole、Dihydroroseoside、4′-(Imidazol-1-yl)acetophenone、Ethyl-D-glucuronide、HQH、Progesterone、N-{4-[(2R,3R)-3-(Hydroxymethyl)-5-oxo-2-morpholinyl]phenyl}acetamide、DNH、2-Furoylglycine和4-decyl-3-hydroxy-5-oxooxolane-2,3-dicarboxylic acid(表1);第二次分析中優(yōu)勢代謝物含量最高的10種代謝物是11,12-Epoxy-(5Z,8Z,11Z)-icosatrienoic acid、11-Deoxy prostaglandin F2、2-methoxy-3,5-dimethyl-6-[(E)-3-methylundec-2-enyl]pyran-4-one、2-hydroxy-6-[(8Z,11Z)-pentadeca-8,11,14-trien-1-yl]benzoic acid、Eicosapentaenoic acid、SKK、Anacardic acid、FAHFA (17:0/19:2)、FAHFA (17:0/20:3)和16(R)-HETE(表2)。

表1 綿羊超數(shù)排卵中外源FSH注射前的血清前10優(yōu)勢代謝物Table 1 Top 10 dominant metabolites before FSH injection in sheep during multiple ovulation

表2 綿羊超數(shù)排卵中人工輸精前的血清前10優(yōu)勢代謝物Table 2 Top 10 dominant metabolites before artificial insemination in sheep during multiple ovulation

2.5 差異代謝物功能富集分析

KEGG途徑富集顯示,綿羊超數(shù)排卵過程中的優(yōu)勢代謝物分別在正負離子模式下富集到39和49條功能通路(圖6)。正離子模式下富集的途徑包括類固醇激素生物合成、花生四烯酸代謝、膽汁分泌、皮質(zhì)醇合成和分泌等。負離子模式下的富集途徑包括不飽和脂肪酸生物合成、卟啉和葉綠素代謝、花生四烯酸代謝、脂肪酸生物合成等。

(a)正離子模式;(b)負離子模式。圖6 綿羊超數(shù)排卵中血清代謝物富集 KEGG pathwayFigure 6 Metabolites enriched KEGG pathway in sheep during multiple ovulation

3 討論

除生殖激素外,血液中的一些代謝物也與超數(shù)排卵過程中卵泡發(fā)育和卵子成熟有關(guān)。本研究通過FSH注射前與人工授精前的血清代謝組比較,發(fā)現(xiàn)295種代謝物在超數(shù)排卵過程中發(fā)生變化。對其進行功能分析表明,一些代謝物與卵泡成熟相關(guān),具有明顯的生物學(xué)功能。

3.1 促進卵泡發(fā)育的代謝物

一些代謝物在人工授精前含量較高,可能有助于卵泡的成熟,如類固醇類脫氧皮質(zhì)酮(Deoxycorticosterone)和皮甾酮(Cortodoxone);磷脂酰膽堿類PC (16∶1E/10∶0)和PC(19∶2/18∶4);不飽和脂肪酸類硬脂炔酸(Octadec-9-ynoic acid)、十八碳烯酸(反-6)(trans-Petroselinic acid)和花生四烯酸(Arachidonic acid)。脫氧皮質(zhì)酮和皮甾酮主要參與甾體激素的生物合成和皮質(zhì)醇的合成及分泌。脫氧皮質(zhì)酮既是一種有效的礦物皮質(zhì)激素,也是一種糖皮質(zhì)激素。它能刺激某些魚類[6]和母雞[7]的卵母細胞成熟。對獼猴的研究也發(fā)現(xiàn),在排卵刺激前和受精后6 h,脫氧皮質(zhì)酮的含量存在差異[8]。而且,顆粒細胞可能在體內(nèi)從含膽固醇的脂質(zhì)合成21-羥化酶衍生的礦物皮質(zhì)激素,通過礦物皮質(zhì)激素受體介導(dǎo)的事件促進排卵后黃體的形成[9]。在受精時添加脫氧皮質(zhì)酮或皮甾酮會改變皮質(zhì)類固醇受體的調(diào)節(jié),并加快孵化[10]。與其他研究相似,本研究表明血清中脫氧皮質(zhì)酮和皮甾酮可能有助于綿羊超數(shù)排卵中卵泡的發(fā)育。

磷脂酰膽堿(PC)是兩性分子,是生物膜的重要組成部分,在細胞膜的通透性、物質(zhì)交換、信號傳遞等功能中起重要作用。磷脂酰膽堿的內(nèi)穩(wěn)態(tài)對細胞的生存和生長很重要。研究發(fā)現(xiàn),細胞內(nèi)磷脂酰膽堿總量與細胞生長和凋亡相關(guān),與生長呈正相關(guān),與凋亡呈負相關(guān)[11]。在磷脂酶的作用下,磷脂酰膽堿可以增加亞油酸的產(chǎn)生。亞油酸氧化代謝產(chǎn)生13-過氧羥基-9,11-十八碳二烯酸(13-HPODE)(13-Hydroperoxy-9,11-octadecadienoic acid),通過參與EGF受體去磷酸化增強表皮生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[12]。EGF是一種表皮細胞生長因子,可誘導(dǎo)哺乳動物卵巢積云的擴大[13]。此外,復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者卵泡液中油酸水平降低。油酸可減輕飽和脂肪酸對卵母細胞發(fā)育的不良影響[14]。它不僅能調(diào)節(jié)脂肪酸代謝和細胞內(nèi)信號,還能降低氧化應(yīng)激,從而促進卵母細胞和著床前胚胎的發(fā)育[15]。硬脂炔酸和十八碳烯酸(反-6)是油酸的重要異構(gòu)體[16-17]。超數(shù)排卵時血清磷脂酰膽堿含量和亞油酸合成增加,提示在此過程中脂質(zhì)代謝增強。因此,可以利用磷脂酰膽堿、硬脂炔酸和十八碳烯酸(反-6)作為綿羊超數(shù)排卵卵泡成熟的血清標志代謝物。

目前已有大量體外實驗表明,不飽和脂肪酸的含量會影響哺乳動物的生殖性狀。飼喂不飽和脂肪酸(油酸和亞油酸)比例較高的飼糧,圍產(chǎn)期奶牛卵泡平均直徑增大;排卵前卵泡內(nèi)雌激素、雄激素等甾體激素濃度升高[18]。Robinson等[19]發(fā)現(xiàn),當(dāng)飼喂富含亞油酸(C18:2,ω-6 PUFA)或亞麻酸(C18:3,ω-3 PUFA)的飼糧時,卵巢中卵泡的數(shù)量增加。因此,飼糧中添加不飽和脂肪酸[如硬脂炔酸和十八碳烯酸(反-6)]可提高綿羊的超數(shù)排卵水平,這可能是提高綿羊繁殖力的一種潛在策略。

花生四烯酸是一種長鏈多不飽和脂肪酸,通過影響類固醇激素和前列腺素的生物合成來調(diào)節(jié)動物生殖過程[20]。花生四烯酸及其代謝物是類固醇激素生產(chǎn)調(diào)節(jié)的限速步驟[21]。膽固醇通過類固醇激素合成的急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)從線粒體外膜運輸?shù)絻?nèi)膜[22],進一步對StAR啟動子DNA序列的研究表明,5-HPETE增強了StAR啟動子的活性,促進了StAR蛋白的表達,增加了類固醇合成的量[23]。此外,花生四烯酸在一系列酶的作用下可合成多種具有生物活性的PGH 2[22]。這些合成的前列腺素作為內(nèi)部分泌物從細胞中釋放,并與分布在鄰近靶細胞上的g蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合,以調(diào)節(jié)基本的生殖過程,包括排卵、卵泡發(fā)育、葉黃素溶解和分娩[24-25]。因此,本研究結(jié)果提示花生四烯酸和8(R) -羥基二十碳四烯酸[8(R) -hydroxy-eicosatetraenoic acid]是預(yù)測卵泡成熟的潛在標志代謝物。

3.2 抑制卵泡發(fā)育的代謝物

本研究結(jié)果表明,黃體酮在超數(shù)排卵中下調(diào)。黃體酮在綿羊未成熟卵泡中含量較高,可作為綿羊未成熟卵泡的標記代謝物。黃體酮的主要生理作用是由孕激素受體(PGR)介導(dǎo)的。研究結(jié)果表明,黃體酮抑制卵泡生長,至少部分作用是在卵巢內(nèi)發(fā)揮的。卵巢黃體可提高大鼠、猴子[26]和人[1]體內(nèi)黃體酮的循環(huán)水平,進而抑制大卵泡的生長發(fā)育。在大鼠中,黃體酮通過抑制垂體分泌的促性腺激素而起作用,促性腺激素是卵泡生長所必需的。在人類和猴子的卵巢中,黃體酮的部分抑制作用可能直接在卵巢內(nèi)發(fā)揮。當(dāng)黃體酮水平很低且穩(wěn)定時,黃體生成素的積累和孕激素受體變得敏感。因此,黃體化前黃體酮增加可引起LH和FSH含量迅速增加,繼而排卵[27-28]。相反,如果黃體酮活性持續(xù)高于生理觸發(fā)水平,則會導(dǎo)致促性腺激素釋放激素受體脫敏,進一步使促性腺激素?zé)o法積聚或激增,從而阻礙排卵[29]。此外,黃體酮還能抑制卵巢顆粒細胞有絲分裂和卵巢顆粒細胞的凋亡[30]。這表明黃體酮在維持卵泡數(shù)量平衡中起著重要作用,可能會抑制卵泡成熟。

4 結(jié)論

研究通過LC-MS/MS非靶向代謝組技術(shù)對綿羊超數(shù)排卵中血清代謝物進行全面對比分析,結(jié)果表明血清中高含量的脫氧皮質(zhì)酮、磷脂酰膽堿和花生四烯酸可能有助于綿羊超數(shù)排卵卵泡的發(fā)育。研究結(jié)果為超數(shù)排卵中卵泡發(fā)育調(diào)控機制解析提供一定幫助,為超數(shù)排卵過程中的營養(yǎng)調(diào)控和供體選擇提供參考。