盧保德 龍 賢 黃勇平

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,復(fù)發(fā)率高[1]。手術(shù)切除是膀胱癌治療的主要手段,但大部分患者5年內(nèi)會復(fù)發(fā)和進一步發(fā)展,最終發(fā)生轉(zhuǎn)移,發(fā)生轉(zhuǎn)移患者大部分在2年內(nèi)死亡,病死率高[2,3]。因此,研究膀胱癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的原因及機制對膀胱癌防治有重要意義。驅(qū)動蛋白家族成員26B(kinesin family member 26B, KIF26B)是驅(qū)動蛋白超家族成員之一,在細胞運輸和有絲分裂中有重要作用。驅(qū)動蛋白一類可沿微管軌道運動的分子馬達蛋白,在紡錘體形成、染色體凝聚分離、細胞分裂等方面具有重要作用,目前在人類中發(fā)現(xiàn)有45個功能不同的成員[4]。

近年來,越來越多的驅(qū)動蛋白成員被報道與癌癥的發(fā)生、發(fā)展有關(guān),如KIF4A在肝癌中高表達,高表達KIF4A可促進肝癌細胞的增殖[5]。KIFC1與前列腺癌預(yù)后不良有關(guān)[6]。KIF2A與骨肉瘤分期和預(yù)后相關(guān),敲除KIF2A可抑制骨肉瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移[7]。KIF23可通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控結(jié)直腸癌細胞的增殖和侵襲[8]。KIF26B在多種惡性腫瘤中異常表達,參與癌癥的增殖和轉(zhuǎn)移過程,高表達KIF26B可通過激活FGF2/ERK信號通路促進乳腺癌細胞增殖和遷移,KIF26B表達水平與乳腺癌腫瘤直徑、TNM分期、分化有關(guān)[9]。但KIF26B在膀胱癌中的作用尚未明確。本研究將利用公共數(shù)據(jù)庫分析KIF26B在膀胱癌組織中的表達及與患者生存預(yù)后的關(guān)系,同時沉默KIF26B后,觀察膀胱癌T24細胞增殖、侵襲、遷移能力的變化,并初步探討其分子機制。

材料與方法

1.主要材料:膀胱癌細胞系(T24、J82)和膀胱正常細胞SV-HUV-1購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所;Trizol購自天根生化科技(北京)有限公司;胎牛血清購自美國Gibco公司;1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司;MTT試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司;轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司;KIF26B siRNA由湖州河馬生物科技有限公司設(shè)計與合成;p-MEK、MEK、ERK、p-ERK抗體購自安諾倫(北京)生物科技有限公司。

2.生物信息學(xué)分析KIF26B在膀胱癌組織中的表達及預(yù)后:在GEO數(shù)據(jù)庫中下載數(shù)據(jù)集GSE13507“Series Matrix file”文件,數(shù)據(jù)集中含有膀胱癌組織165例,癌旁正常組織68例,數(shù)據(jù)集內(nèi)容包含患者性別、年齡、基因表達量等信息,KIF26B對應(yīng)的探針為ILMN_1673620。以KIF26B表達中位數(shù)為界,分為KIF26B高表達組和KIF26B低表達組,用UaLcan數(shù)據(jù)庫在線分析KIF26B表達與膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系[10]。

3.細胞培養(yǎng):T24、J82和SV-HUV-1細胞用含10%胎牛血清、1%雙抗的1640培養(yǎng)基,在37℃飽和濕度、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4.實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測細胞KIF26B mRNA表達:Trizol法提取細胞中的總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,用primer6進行引物設(shè)計,合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。引物序列如下:KIF26B上游引物:5′-GCTTCTCAGGCTGAAGTGTG-3′,下游引物:5′-GTAGGATTTTCCAGTTTGGCGTGG-3′;GAPDH上游引物:5′-CCAGGTGGTCTCCTCTGA-3′,下游引物:5′-GCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3′。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性10min,95℃變性5s,60℃退火15s,72℃延伸10s,40個循環(huán)。記錄CT值,計算基因相對表達量。采用ImageJ軟件進行分析,以GAPDH為內(nèi)參,觀察結(jié)果。

圖1 KIF26B在膀胱癌組織中的表達及生存分析

圖2 KIF26B在膀胱癌細胞T24、J82、SV-HUV-1中的表達量

圖3 轉(zhuǎn)染后T24細胞中KIF26B的表達量

5.Western blot法檢測KIF26B蛋白表達水平:收集對數(shù)生長期的各組細胞(T24、BIU-87、SV-HUV-1),用放射免疫沉淀緩沖液(radioimmunoprecipitation assay buffer,RIPA)裂解細胞,提取KIF26B蛋白,用BCA蛋白濃度測定試劑盒(BCA Protein Assay Kit)測定蛋白濃度。取各組蛋白樣品40μg,經(jīng)凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride,PVDF)膜上,用濃度為5%的脫脂奶粉封閉2h,加入抗KIF26B抗體孵育,4℃過夜。洗膜3次,加入二抗,室溫孵育2h后,化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白表達水平。

6.細胞轉(zhuǎn)染:將T24細胞分為對照組(si-NC組)和沉默組(si-KIF26B組),轉(zhuǎn)染前1天,在無抗培養(yǎng)基中接種(0.5～2.0)×105個細胞,轉(zhuǎn)染時細胞融合度為50%,分別稀釋siRNA和轉(zhuǎn)染試劑并混勻后加入到24孔板中,輕搖細胞板混合均勻,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h。用RT-qPCR和Western blot法檢測轉(zhuǎn)染效率。

7.噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法檢測:細胞轉(zhuǎn)染48h后,將細胞接種到96孔板中,待細胞貼壁后,按實驗要求進行藥物處理,于0、24、48、72h后進行MTT法檢測。各組細胞在檢測時間點時,每孔加1/10體積MTT溶液,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。在酶標儀上波長為490nm處測定各孔吸光度(A)值,以時間為橫坐標,A490nm為縱坐標,繪制細胞生長曲線。

8.Transwell實驗:將Matrigel基質(zhì)膠稀釋,小室各加100μl(20～30微克/孔),放入培養(yǎng)箱中待其凝固,出現(xiàn)“白色層”取出小室;取出小室后,加入無血清培養(yǎng)基,放入培養(yǎng)箱水化30min;吸掉培養(yǎng)基后用胰酶消化收集狀態(tài)良好的目的細胞,制成單細胞懸液(無血清培養(yǎng)基配置);上室加300μl調(diào)好密度的細胞懸液(3×104個);下室加500μl全培養(yǎng)基(侵襲小室外);于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)相應(yīng)時間;用4%多聚甲醛室溫固定20min,用棉簽擦拭去除侵襲小室內(nèi)未穿過基底層膜的細胞,新24孔板中加入結(jié)晶紫染色,將侵襲小室浸入染色10min后用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗去多余的染料,置于空氣中晾干;顯微鏡拍照,計算各孔穿過膜的細胞數(shù)量。

9.劃痕實驗:將已轉(zhuǎn)染的T24細胞用胰酶消化后,將細胞接種到6孔板中,待細胞鋪滿單層后用移液器槍頭比著直尺,盡量垂至于背后的橫線劃痕;PBS清洗細胞,去除劃下的細胞;加入含2%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),于相應(yīng)時間在100倍鏡下進行拍照。

10.Western blot法檢測沉默KIF26B表達對T24細胞MEK、p-MEK、ERK、p-ERK蛋白表達的影響:將KIF26B 對照組細胞株(si-NC)和KIF26B沉默細胞株(si-KIF26B)進行擴大培養(yǎng),以抗p-MEK、抗MEK、抗ERK、抗p-ERK為一抗,其余方法同材料與方法5。

結(jié) 果

1.生物信息學(xué)分析KIF26B在膀胱癌組織中的表達及預(yù)后:GEO數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示,KIF26B在膀胱癌組織中相對表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.05),詳見圖1A。Kaplan-Meier生存分析顯示,KIF26B高表達組的膀胱癌患者總體生存期明顯低于低表達組(P<0.05),詳見圖1B。

2.KIF26B在膀胱癌細胞中的表達:RT-qPCR檢測結(jié)果顯示,KIF26B mRNA在J82、T24、SV-HUV-1中的表達量分別為1.76±0.02、1.83±0.03、1.08±0.04,與SV-HUV-1比較,膀胱癌細胞系J82及T24中KIF26B mRNA的相對表達量明顯升高(P<0.05,圖2A)。Western blot法檢測結(jié)果顯示,KIF26B蛋白在膀胱癌細胞T24、J82中的相對表達量均高于正常膀胱上皮細胞SV-HUV-1,(P<0.05,圖2中B、C)。因KIF26B在T24細胞中表達最高,選擇T24細胞進行下一步實驗。

3.轉(zhuǎn)染后T24細胞中KIF26B mRNA和蛋白的表達情況:RT-qPCR檢測結(jié)果顯示,si-KIF26B組中KIF26B mRNA的表達水平顯著低si-NC組(P<0.05,圖3A)。Western blot法檢測結(jié)果顯示,si-KIF26B組中KIF26B蛋白的表達水平低于si-NC組(P<0.05,圖3中B、C)。表明T24細胞中KIF26B表達被有效抑制,可用于下一步功能研究。

4.沉默KIF26B對膀胱癌細胞增殖的影響:采用MTT法檢測沉默KIF26B表達對T24細胞增殖的影響,結(jié)果顯示,si-NC組在48h的A值為0.788±0.003,si-KIF26B組為0.596±0.003,兩組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=40.29,P<0.05)。si-KIF26B組在72h的A值為1.274±0.139,si-NC組為0.891±0.033,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.81,P<0.05),詳見圖4。表明沉默KIF26B后,膀胱癌T24細胞的增殖能力明顯下降。

圖4 兩組細胞MTT增殖曲線圖

5.沉默KIF26B后對膀胱癌細胞侵襲的影響:通過Transwell實驗檢測細胞侵襲能力的變化,結(jié)果顯示,si-KIF26B組穿過小室膜的細胞數(shù)為90.67±6.33,si-NC組為201.71±7.69,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.14,P<0.05),詳見圖5。表明沉默KIF26B后細胞侵襲能力減弱。

圖5 KIF26B基因沉默對膀胱癌T24細胞侵襲能力的影響

6.沉默KIF26B后對膀胱癌細胞遷移的影響:劃痕實驗檢測T24細胞轉(zhuǎn)染KIF26B siRNA后細胞遷移的變化,結(jié)果顯示,si-KIF26B細胞24h的愈合率為60.19%±2.43%,si-NC組為96.67%±3.33%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.85,P<0.05),詳見圖6。表明沉默KIF26B后,T24細胞遷移能力下降。

圖6 沉默KIF26B對膀胱癌T24細胞遷移的影響

7.沉默KIF26B對MEK/ERK信號通路蛋白表達的影響:沉默KIF26B表達后,si-NC組和si-KIF26B組中MEK、ERK蛋白的相對表達量未見明顯差異;而在si-KIF26B組中,p-ERK、p-MEK蛋白的相對表達量明顯低于si-NC組(P<0.05),詳見圖7。

圖7 沉默KIF26B后p-ERK、ERK、p-MEK、MEK蛋白表達變化

討 論

膀胱癌病因未明,其發(fā)生率高,易復(fù)發(fā)。世界范圍內(nèi)膀胱癌的發(fā)生率在男性惡性腫瘤中排第7位[11]。我國膀胱癌發(fā)生率為5.8/10萬,病死率為1.31/10萬,城市發(fā)生率高于農(nóng)村[12]。膀胱癌病理類型以尿路上皮癌最常見,大約占90%,手術(shù)為主要治療方式,但復(fù)發(fā)率和進展率高,在5年內(nèi)復(fù)發(fā)的患者比例占到70%,有10%～30%的患者進展為肌層浸潤性尿路上皮癌[13]。浸潤性膀胱癌易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,為膀胱癌死亡的主要因素,研究膀胱癌侵襲、轉(zhuǎn)移的特征及分子機制,對膀胱癌的診治有重要意義。

KIF26B為驅(qū)動蛋白家族成員之一,驅(qū)動蛋白可沿微管定向運動,主要參與細胞內(nèi)mRNA、囊泡、生長因子、轉(zhuǎn)錄因子等物質(zhì)轉(zhuǎn)運,與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、有絲分裂、免疫反應(yīng)、細胞分化和凋亡等病理生理過程密切相關(guān),驅(qū)動蛋白突變可引起細胞有絲分裂停止和凋亡[14～16]。此外,KIF26B對間充質(zhì)細胞的黏附和極化具有重要作用,其機制可能是通過Wnt5a/Ror信號通路調(diào)節(jié)細胞骨架,影響細胞的遷移、極化和黏附[17,18]。有研究表明,干擾KIF26B的表達可抑制乳腺癌細胞的增殖、侵襲及遷移能力。

本研究先通過GEO數(shù)據(jù)庫分析KIF26B在膀胱癌組織中的表達水平,結(jié)果顯示,KIF26B在膀胱癌組織中的表達高于癌旁組織,同時在細胞水平上進行檢測,發(fā)現(xiàn)KIF26B在膀胱癌細胞中的表達亦明顯高于正常膀胱上皮細胞。進一步在UaLcan數(shù)據(jù)庫中進行生存分析發(fā)現(xiàn),KIF26B高表達的膀胱癌患者生存預(yù)后更差,提示KIF26B可能是膀胱癌診斷和預(yù)后的標志物。為進一步揭示KIF26B在膀胱癌中的作用,本研究在沉默KIF26B后,檢測膀胱癌細胞增殖能力的變化,結(jié)果顯示,膀胱癌細胞的增殖能力明顯下降。進一步檢測膀胱癌細胞侵襲和遷移能力的變化,發(fā)現(xiàn)沉默KIF26B基因后,膀胱癌細胞的侵襲和遷移能力明顯下降,說明KIF26B表達異?？捎绊懓螂装┘毎鲋场⑶忠u、遷移的能力,但KIF26B是如何影響癌細胞的增殖、侵襲,目前尚不明確。

有研究對KIF26B基因進行富集分析發(fā)現(xiàn),KIF26B在腫瘤中的作用機制與PI3K/Akt信號通路、細胞凋亡、細胞周期通路關(guān)系密切。Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn),KIF26B在胃癌中通過激活VEGF信號通路促進癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移。而Liu等[20]在髓母細胞瘤中研究發(fā)現(xiàn),沉默KIF26B后,癌細胞增殖、遷移能力明顯下降,其機制為通過激活PI3K/Akt通路促進腫瘤的惡性進展。MEK/ERK信號通路為經(jīng)典的激酶通路,也是被研究最多的通路之一,參與細胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移等調(diào)控過程。本研究發(fā)現(xiàn),在沉默KIF26B后,膀胱癌T24細胞中MEK、ERK蛋白表達水平無明顯變化,而p-MEK、p-ERK蛋白的表達明顯下調(diào),提示沉默KIF26B可能通過抑制MEK/ERK通路活性調(diào)控膀胱癌細胞的增殖、侵襲。

綜上所述,KIF26B在膀胱癌組織和細胞中表達水平升高,與患者的預(yù)后不良有關(guān),沉默KIF26B后,膀胱癌細胞增殖、侵襲、遷移能力下降,其機制可能是通過影響MEK/ERK信號通路而發(fā)揮作用。但本研究僅在體外探索KIF26B對膀胱癌的作用,缺乏體內(nèi)動物實驗及直接機制探索,因此KIF26B在膀胱癌中的具體作用機制仍有待于進一步研究。