黑 玉 梅 子 陳 陽(yáng) 滕彬宏

血-腦脊液屏障(blood brain barrier, BBB),是由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascular endothelial cells, BMVEC)及其細(xì)胞間緊密連接(tight junction, TJ)、毛細(xì)血管基膜以及嵌入其中的周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和狹小的細(xì)胞外間隙共同組成的一個(gè)嚴(yán)密結(jié)構(gòu)[1]。BBB作為一個(gè)生理性屏障,對(duì)物質(zhì)的進(jìn)入具有選擇性,能夠阻止大部分有害物質(zhì)進(jìn)入腦部,維持腦部?jī)?nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。但是同時(shí)BBB也限制了藥物進(jìn)入腦部發(fā)揮對(duì)于腦部疾病的治療作用[2]。如何提高藥物的BBB滲透率是腦部疾病治療中有待于解決的關(guān)鍵問(wèn)題。設(shè)計(jì)研發(fā)具有高BBB滲透率的新的藥物分子十分困難。而高效的腦靶向藥物遞送系統(tǒng),為提高現(xiàn)有治療藥物的BBB滲透率提供了可能[3]。

阿霉素(doxorubicin, DOX)是一種廣譜的抗腫瘤治療藥物,目前在多種腫瘤的治療中使用,包括乳腺癌、肺癌、急性粒細(xì)胞性白血病、前列腺癌等[4]。但是由于DOX的BBB滲透率較低,難以進(jìn)入腦部,極大的限制了其在腦部腫瘤例如腦膠質(zhì)瘤等治療中發(fā)揮作用[5]。如何提高DOX的BBB滲透率,是其在腦部腫瘤治療中所需要解決的重要問(wèn)題。前期筆者利用腦靶向多肽RVGP以及細(xì)胞穿透肽(G2R9, R9)修飾空間穩(wěn)定脂質(zhì)體(sterically stabilized liposome, SSL),構(gòu)建了雙重介導(dǎo)(配體介導(dǎo)與吸附介導(dǎo))的腦靶向脂質(zhì)體(RVGPR9-SSL)[6～9]。RVGPR9-SSL有望通過(guò)雙重介導(dǎo)作用,顯著增強(qiáng)所荷載的藥物的BBB滲透率,是非常有前景的腦部藥物遞送載體。為了探究RVGPR9-SSL對(duì)于DOX的遞送能力,本研究將DOX包載在RVGPR9-SSL中(DOX@RVGPR9-SSL),在體外水平,初步考察了DOX@RVGPR9-SSL的BBB滲透率。此外,本研究創(chuàng)新性地采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence a resonance energy transfer, FRET)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了跨越BBB后RVGPR9-SSL的完整性,并且對(duì)比研究了給藥前后BBB的完整性,通過(guò)這兩方面的研究對(duì)RVGPR9-SSL的安全性進(jìn)行了充分考察。本研究通過(guò)體外BBB滲透率的考察以及安全性評(píng)價(jià),為RVGPR9-SSL在腦靶向藥物遞送方面的應(yīng)用提供了有力的數(shù)據(jù)支持,有望為腦部疾病的治療提供創(chuàng)新性的策略。

材料與方法

1.試劑與儀器:高糖DMEM培養(yǎng)基與0.25%胰酶-EDTA均購(gòu)自中科邁晨(北京)科技有限公司;胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;激光共聚焦小皿(35mm/20mm)購(gòu)自北京華力德科技有限公司;Hoechst33342、DiO、DiI均購(gòu)自北京中科科奧生物科技有限公司;BMVEC細(xì)胞由中日友好醫(yī)院友情提供;Millicell-ERS EVOM2細(xì)胞電阻儀購(gòu)自美國(guó)Millipore公司;熒光分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)瓦里安公司;細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自上海力申科技有限公司;渦旋振蕩器購(gòu)自海門其林貝爾儀器有限公司;超聲波細(xì)胞破碎儀購(gòu)自寧波新芝生物科技有限公司;流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司;SW-CJ-1B超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;TD4-WS離心機(jī)購(gòu)自上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司;激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司。

2.DOX@RVGPR9-SSL制備:精密稱取適量的 SPC、Chol、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-RVGPR9, 按照一定比例加入茄形瓶中(SPC∶Chol∶DSPE-PEG2000∶DSPE-PEG2000-RVGPR9=100∶50∶6∶2,mol/mol),用氯仿溶解,渦旋混勻,置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上,于37℃水浴下旋干有機(jī)溶劑,直至在茄形瓶底部形成均勻的脂質(zhì)薄膜,再持續(xù)抽真空30min,除去殘存的有機(jī)溶劑。然后向茄形瓶中加入2ml pH 4.0的檸檬酸緩沖液(300mmol/L),置于渦旋振蕩器上渦旋震蕩,后置37℃的水浴中超聲30min直至水化完全,獲得載體RVGPR9-SSL脂質(zhì)體。隨后用0.5mol/L碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)脂質(zhì)體pH至7.5～7.8。在50℃水浴預(yù)熱下,加入DOX水溶液(DOX/SPC=1/20, w/w)攪拌30min,使脂質(zhì)體充分包載DOX,即得到DOX@RVGPR9-SSL。之后柱分離法檢測(cè)其包封率。

3.體外BBB模型構(gòu)建與評(píng)價(jià):體外培養(yǎng)BMVEC細(xì)胞,將培養(yǎng)瓶中融合至90%的BMVEC細(xì)胞,用專用培養(yǎng)基消化后,將BMVEC細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種到Transwell上室中,之后將Transwell培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移到5% CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)3～7天,直至BBB模型建立。培養(yǎng)過(guò)程中每?jī)商旄鼡Q1次培養(yǎng)基。通過(guò)掃描透射電鏡(scanning transmission electron microscope, SEM)觀察細(xì)胞間是否形成緊密連接,利用EVOM電阻測(cè)定儀檢測(cè)Transwell上下室間的電阻值即TEER,并通過(guò)4h滲漏試驗(yàn)共同判斷BBB模型是否建立成功。

4.RVGPR9-SSL完整性考察:為了方便考察跨越BBB后RVGPR9-SSL的完整性,在RVGPR9-SSL中包載了FRET對(duì)(DiO+DiI),分別制備了3種熒光脂質(zhì)體DiO@RVGPR9-SSL、DiI@RVGPR9-SSL、(DiO+DiI)@RVGPR9-SSL。向已經(jīng)成功構(gòu)建體外BBB模型的Transwell培養(yǎng)板中各孔中加入這3種熒光脂質(zhì)體,然后將Transwell培養(yǎng)板放于5% CO2、37℃孵箱中孵育4h。孵育結(jié)束后收集Transwell下室中的液體,利用激光共聚焦顯微鏡與熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。

5.DOX@RVGPR9-SSL給藥后BBB完整性考察:在DOX@RVGPR9-SSL給藥后,再次測(cè)量各孔跨膜電阻(transmembrane resistance value, TEER)值,觀察孵育4h后藥液的滲漏情況,并利用SEM觀察細(xì)胞間的緊密連接,確定孵育4h后BBB的完整性。

結(jié) 果

1.DOX@RVGPR9-SSL的包封率:通過(guò)柱分離法檢測(cè)DOX@RVGPR9-SSL(97.25%±0.60%)以及對(duì)照組DOX@SSL(96.79%±0.53%)的包封率。結(jié)果表明,脂質(zhì)體的包封率均>95%,說(shuō)明通過(guò)上述方法DOX可以成功地包載在脂質(zhì)體中。

2.體外BBB模型評(píng)價(jià):4h滲漏實(shí)驗(yàn)表明Transwell中液面差可維持0.5cm;利用EVOM電阻測(cè)定儀測(cè)定的TEER值>200Ω·cm2。通過(guò)SEM觀察細(xì)胞狀態(tài)(圖1)可見(jiàn)BMVEC細(xì)胞排列致密,細(xì)胞間存在著明顯的緊密連接。說(shuō)明本研究中體外BBB模型成功建立,可用于后續(xù)研究考察。

3.RVGPR9-SSL完整性:為了方便檢測(cè)RVGPR9-SSL跨越BBB后的完整性,筆者在RVGPR9-SSL中包載了FRET對(duì)(熒光探針DiO與DiI)。包載熒光探針的RVGPR9-SSL稀釋至合適濃度后,與BMVEC細(xì)胞共孵育。BMVEC細(xì)胞對(duì)RVGPR-SSL的攝取的結(jié)果,如圖2所示,DiO@RVGPR9-SSL攝取進(jìn)入BMVEC細(xì)胞后呈現(xiàn)清晰的綠色熒光,DiI@RVGPR9-SSL攝取進(jìn)入BMVEC細(xì)胞后呈現(xiàn)紅色熒光,而混合包載兩種熒光探針的脂質(zhì)體(DiO+DiI)@RVGPR9-SSL攝取進(jìn)入BMVEC細(xì)胞后呈現(xiàn)紅色熒光增強(qiáng),而綠色熒光幾乎消失的現(xiàn)象,即FRET效應(yīng),這說(shuō)明兩種熒光探針共包載在RVGPR9-SSL中時(shí)距離<10nm[10]。將包載熒光探針的3種脂質(zhì)體分別與構(gòu)建的BBB模型進(jìn)行孵育,孵育4h后,收集Transwell下室液體與BMVEC細(xì)胞共孵育,BMVEC細(xì)胞的攝取結(jié)果如圖2所示,混合包載兩種熒光探針的RVGPR9-SSL,仍然存在FRET現(xiàn)象,兩種熒光探針的距離<10nm,說(shuō)明脂質(zhì)體在跨越BBB后仍然保持著較好的完整性。因此,以RVGPR9-SSL作為載體包載DOX,可以有效避免跨越BBB時(shí)因載體破裂而造成的DOX泄露,從而降低毒性不良反應(yīng)。

在3種包載熒光探針的脂質(zhì)體與BBB共孵育4h后,收集Transwell下室液體,用熒光分光光度計(jì)在相應(yīng)的激發(fā)波長(zhǎng)下進(jìn)行熒光光譜掃描,結(jié)果如圖3所示:共包載DiO與DiI的RVGPR9-SSL,存在著FRET效應(yīng),即供體DiO的熒光幾乎消失,受體DiI的熒光增強(qiáng),與激光共聚焦顯微鏡結(jié)果一致,說(shuō)明兩種雙重介導(dǎo)脂質(zhì)體跨BBB模型轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中,脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)保持完整,未發(fā)生熒光探針的泄露。

圖3 3種包載熒光探針的脂質(zhì)體跨BBB后Transwell下室液體的熒光圖譜

4.DOX@RVGPR9-SSL給藥后BBB完整性:給藥前BBB的形態(tài)如圖1所示,BMVEC細(xì)胞間存在著明顯的緊密連接。DOX@RVGPR9-SSL與BBB共孵育4h后,BBB的形態(tài)如圖4所示。結(jié)果表明,在DOX@RVGPR9-SSL與BBB共孵育4h后,體外BBB模型仍然保持著較好的完整性,細(xì)胞間仍然存在著明顯的緊密連接。4h滲漏實(shí)驗(yàn)表明,DOX@RVGPR9-SSL給藥后,Transwell上下室可以維持0.5cm的液面差,同時(shí)TEER值>200Ω·cm2,也表明DOX@RVGPR9-SSL與BBB共孵育后,并未破壞BBB的結(jié)構(gòu),體外BBB模型在孵育過(guò)程中始終保持著較好的完整結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果說(shuō)明DOX@RVGPR9-SSL具有較好的安全性,給藥后不會(huì)影響B(tài)BB的完整性。

圖4 DOX@RVGPR9-SSL孵育4h后BBB的形態(tài)圖(×1500)

5. DOX@RVGPR9-SSL的 BBB滲透率:給藥后0、1、2、3、4h分別取Transwell下室液體,按照上述實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定DOX@RVGPR9-SSL的 BBB滲透率。以游離DOX以及普通脂質(zhì)體組(DOX@SSL)作為對(duì)照組,結(jié)果如圖5所示。游離DOX的4h累積BBB通透率僅為2.7%,DOX@SSL的4h累積BBB通透率僅為5.9%,而DOX@RVGPR9-SSL的4h累積BBB通透率為10.3%,較DOX組提高了3.8倍,DOX@SSL提高了1.7倍,表明該雙重介導(dǎo)的脂質(zhì)體作為載體,可以顯著提高所包載DOX的BBB滲透率,并且DOX@RVGPR9-SSL的BBB滲透率顯著高于DOX@SSL,說(shuō)明雙重介導(dǎo)的配體修飾可以顯著增強(qiáng)脂質(zhì)體跨BBB效率。綜合上述結(jié)果,RVGPR9-SSL作為載體能夠顯著增強(qiáng)所包載藥物的BBB滲透率,是極具前景的腦部藥物遞送載體。

圖5 脂質(zhì)體跨體外BBB模型的累積滲透率

討 論

目前世界人口老齡化問(wèn)題日趨嚴(yán)重,中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性病變、腦部腫瘤以及腦部炎癥等疾病嚴(yán)重威脅著人類的健康[11]。DOX是一種廣譜的抗腫瘤治療藥物,但是由于其BBB滲透率較低,難以進(jìn)入腦部,極大限制了其在腦部腫瘤例如腦膠質(zhì)瘤等治療中發(fā)揮作用[5]。如何提高DOX的BBB滲透率,是其在腦部腫瘤治療中所需要解決的重要問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn),普通長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體雖然可以增加DOX的BBB滲透率,但是效果并不理想[8]。針對(duì)這一問(wèn)題,前期筆者利用腦靶向多肽RVGP以及細(xì)胞穿透肽(R9)修飾脂質(zhì)體,構(gòu)建了雙重介導(dǎo)(配體介導(dǎo)與吸附介導(dǎo))的腦靶向脂質(zhì)體(RVGPR9-SSL)[6～8]。為了考察RVGPR9-SSL能否有效向腦部遞送DOX,本研究在體外水平,初步對(duì)DOX@RVGPR9-SSL的BBB滲透率進(jìn)行了考察。

在體外成功分離培養(yǎng)BMVEC的基礎(chǔ)上,研究者構(gòu)建了體外BBB模型,并不斷發(fā)展和完善,為研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程以及藥物治療提供了有力工具[12]。目前BBB模型包括BMVEC單層細(xì)胞模型、BMVEC與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)模型、BMVEC、星形膠質(zhì)細(xì)胞與周細(xì)胞共培養(yǎng)模型以及原代培養(yǎng)BMVEC細(xì)胞與周細(xì)胞共培養(yǎng)模型[13～16]。其中,BMVEC細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)模型,基本具備BBB的屏障功能,并且該模型構(gòu)建方法比較簡(jiǎn)單,需要時(shí)間短,操作過(guò)程可重復(fù),目前得到了廣泛應(yīng)用[17]。本研究構(gòu)建了由BMVEC細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)而構(gòu)建的BBB模型,并通過(guò)4h滲漏實(shí)驗(yàn)、SEM觀察細(xì)胞間的緊密連接以及TEER的檢測(cè),確證了體外BBB模型成功構(gòu)建,可以用于DOX@RVGPR9-SSL的BBB滲透率考察。

本研究發(fā)現(xiàn),DOX@RVGPR9-SSL的BBB累積滲透率是游離DOX的3.8倍,是DOX@SSL的1.7倍,表明RVGPR9-SSL可以顯著提高所包載DOX的BBB滲透率,是非常具有研究前景的腦靶向藥物遞送載體,并且通過(guò)FRET實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)該腦靶向脂質(zhì)體RVGPR9-SSL在跨越BBB后,可以保持較好的完整性,不會(huì)產(chǎn)生藥物的泄露,具有較好的安全性。在DOX@RVGPR9-SSL跨越BBB后,BBB模型仍然可以保持較好的完整性,表明DOX@RVGPR9-SSL給藥后不會(huì)破壞BBB的結(jié)構(gòu),也預(yù)示著其具有較好的安全性。

綜上所述,本研究表明,前期構(gòu)建的RVGPR9-SSL可以顯著提高DOX的BBB滲透率,并且具有較好安全性,是非常具有前景的腦靶向藥物遞送載體,為DOX的腦部遞送提供了新的策略。今后可以在體內(nèi)水平上進(jìn)一步研究其BBB滲透率以及腦內(nèi)病灶部位的藥物濃度,從而廣泛應(yīng)用于臨床中。