周云鑫 劉 柯 丁軍穎

近年來(lái),部分地區(qū)抗生素使用不規(guī)范,加之抗生素的應(yīng)用與多重耐藥和泛耐藥細(xì)菌的傳播之間存在時(shí)間差,導(dǎo)致抗生素耐藥性逐年升高[1,2]。其中,耐藥菌感染所致肺炎主要表現(xiàn)為獲得性肺炎,在臨床獲得性感染疾病中占第1位,治療頗具挑戰(zhàn),給患者和社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。

中醫(yī)藥治療耐藥菌感染因不易引起耐藥而備受關(guān)注,耐藥菌屬風(fēng)熱之邪,侵襲機(jī)體首先犯肺,其所致肺炎核心病機(jī)為正氣不足,邪毒內(nèi)伏[4]。芪歸銀方由黃芪、當(dāng)歸、金銀花、青蒿和虎杖五味藥合理配伍而成,為扶正透邪治則經(jīng)典方,契合耐藥菌所致肺炎病機(jī),且前期研究證實(shí)芪歸銀方治療耐藥菌所致肺炎臨床療效肯定[5]。綠原酸為芪歸銀方中金銀花和青蒿共同藥理成分且在芪歸銀方中含量較高,此外,在動(dòng)物模型中綠原酸已被證明可以減少炎癥并調(diào)節(jié)炎癥和神經(jīng)性疼痛[6]。

在機(jī)體免疫應(yīng)答的諸多細(xì)胞中,巨噬細(xì)胞以其對(duì)非特異免疫應(yīng)答不可替代的作用而受到廣泛關(guān)注[7]。在炎性疾病中,巨噬細(xì)胞在病程的不同階段表型發(fā)生相應(yīng)的改變,以維持、加劇或者抑制、終止炎性反應(yīng)[8]。芪歸銀方治療耐藥菌所致肺炎療效肯定,但其機(jī)制尚不完全明確。為此,本研究以脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥,探討芪歸銀方重要成分綠原酸對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎癥的抑制作用及可能的機(jī)制,以期為耐藥菌所致肺炎的中醫(yī)藥防治提供可能的治療策略。

材料與方法

1.細(xì)胞與試劑:小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(上海);DMEM購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;胎牛血清、0.25%胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;LPS(純度≥98%)、綠原酸(純度≥98%)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所;小鼠白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1beta, IL-1β)、精氨酸酶-1(arginase-1, Arg-1)及單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)的ELISA試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;DMSO購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;SG高純總RNA提取試劑盒、Thermo First cDNA Synthesis Kit及One-Step miRNA RT Kit購(gòu)自北京信諾金達(dá)生物科技有限公司。

2.RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)與分組:巨噬細(xì)胞以含15% FBS的DMEM進(jìn)行復(fù)蘇,于恒溫培養(yǎng)箱(37℃,5%CO2)中培養(yǎng),倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況。生長(zhǎng)密度達(dá)到85%,按1∶2以含10% FBS的DMEM進(jìn)行傳代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板(5×105/ml,每孔2ml),各組分別進(jìn)行不同干預(yù):模型對(duì)照組(L組),以LPS刺激RAW264.7,使LPS終濃度達(dá)到1μg/ml;實(shí)驗(yàn)組(S組),以LPS刺激RAW264.7,使LPS終濃度達(dá)到1μg/ml,加入以不含F(xiàn)BS的DMEM為溶劑的綠原酸,使綠原酸終濃度達(dá)到50μg/ml;空白對(duì)照組(K組),加入同等體積的不含F(xiàn)BS的DMEM。

3.細(xì)胞活性檢測(cè):將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW462.7細(xì)胞接種于96孔板(1×105/ml,每孔100μl)。參考文獻(xiàn)[9]并結(jié)合前期實(shí)驗(yàn),設(shè)置校正組、空白對(duì)照組(K′,0μg/ml)、不同濃度綠原酸組(S12.5、S25、S50、S100及S200,即12.5、25、50、100及200μg/ml)。校正組中只含有等體積不含F(xiàn)BS的DMEM,空白對(duì)照組中含細(xì)胞及不含F(xiàn)BS的DMEM,綠原酸組中含細(xì)胞及不同濃度的綠原酸,每組3個(gè)樣本,每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,于恒溫培養(yǎng)箱中(37℃,5%CO2)培養(yǎng)24h。檢測(cè)前2h每孔加入10%的CCK-8溶液,避光孵育2h,酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處的吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以細(xì)胞活性表示,細(xì)胞活性(%)=(綠原酸組A450-校正組A450)/(空白對(duì)照組A450-校正組A450)×100%。

4.ELISA檢測(cè)炎性細(xì)胞因子濃度:培養(yǎng)48h后獲取上清及沉淀。根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,終止顯色后,立即檢測(cè)各組A450,分別繪制ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),依據(jù)曲線(xiàn)公式,結(jié)合稀釋倍數(shù)求得IL-1β、Arg-1及MCP-1的濃度。

5.qPCR檢測(cè)mRNA表達(dá):采用Trizol直接裂解法分別提取不同組別樣本的總RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo First cDNA Synthesis Kit)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)cDNA,再以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10min,95℃變性30s,60℃退火,40個(gè)循環(huán)。引物序列詳見(jiàn)表1。所有樣本進(jìn)行3個(gè)重復(fù),取循環(huán)閾值(CT)平均值,反應(yīng)內(nèi)參均為Actin。采用2-△△Ct相對(duì)定量法進(jìn)行分析。

表1 引物序列

結(jié) 果

1. 不同濃度綠原酸干預(yù)下RAW264.7的細(xì)胞活性:經(jīng)不同濃度綠原酸處理的RAW264.7細(xì)胞活性,說(shuō)明12.5～200.0μg/ml的綠原酸對(duì)RAW264.7細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用(P>0.05),其中50μg/ml的綠原酸對(duì)RAW264.7細(xì)胞有顯著的提高細(xì)胞活性的作用,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度綠原酸預(yù)處理后RAW264.7的細(xì)胞活性*P<0.05,**P<0.01

圖2 不同干預(yù)方式及時(shí)間點(diǎn)RAW264.7的細(xì)胞形態(tài)(×100)

圖3 LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子的mRNA水平

圖4 細(xì)胞上清中炎性細(xì)胞因子及極化標(biāo)志物的含量

圖5 細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子及通路因子的mRNA水平

2.最佳濃度綠原酸干預(yù)下不同時(shí)間點(diǎn)RAW264.7的細(xì)胞形態(tài):以1μg/ml的LPS刺激巨噬細(xì)胞,倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài),在24h及48h時(shí),K組細(xì)胞呈圓形或橢圓形,與K組比較,L組增殖狀態(tài)無(wú)明顯區(qū)別,而細(xì)胞形態(tài)變化明顯,表現(xiàn)為L(zhǎng)組巨噬細(xì)胞偽足明顯,長(zhǎng)梭形細(xì)胞增多;相較于L組,S組細(xì)胞增殖明顯,此外,從形態(tài)上看,S組偽足減少,梭形細(xì)胞減少(圖2)。

3.LPS預(yù)制RAW264.7的細(xì)胞炎性狀態(tài):以qPCR法檢測(cè)1μg/ml濃度的LPS刺激RAW264.7后24、48h時(shí)的炎性細(xì)胞因子核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-kappaB, NF-κB)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-beta1, TGF-β1)及高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1, HMGB1)的mRNA表達(dá),與K組比較,L組除24h時(shí)HMGB1、TGF-β1的mRNA表達(dá)水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P>0.05),24h時(shí)NF-κB的mRNA表達(dá)顯著升高并且48h時(shí)NF-κB、HMGB1及TGF-β1表達(dá)均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),此外,各炎性因子mRNA表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見(jiàn)圖3。

4. 細(xì)胞上清中炎性細(xì)胞因子及極化標(biāo)志物的水平:與K組比較,L組炎性細(xì)胞因子IL-1β及MCP-1的含量明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且M2極化標(biāo)志物Arg-1的含量明顯下降;S組中,IL-1β含量明顯降低,而Arg-1含量明顯上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見(jiàn)圖4。

5.綠原酸處理后炎性細(xì)胞因子及通路因子的mRNA表達(dá)結(jié)果:RAW264.7巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后產(chǎn)生炎癥,引起相應(yīng)的炎性細(xì)胞因子的表達(dá)改變。S組中綠原酸顯著抑制LPS誘導(dǎo)24h及48h的RAW264.7細(xì)胞中的NF-κB、TGF-β1及前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2, PTGS2)的mRNA水平。此外,S組可降低LPS刺激24h時(shí)炎性通路關(guān)鍵因子HMGB1的mRNA水平,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),并且顯著降低LPS刺激48h時(shí)HMGB1的mRNA水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見(jiàn)圖5。

討 論

耐藥菌所致肺炎,究其核心病機(jī),當(dāng)屬正氣不足,邪毒內(nèi)伏,故而以扶正透邪為組方原則的芪歸銀方契合耐藥菌所致肺炎的病機(jī),且有研究報(bào)道芪歸銀方可明顯延緩耐藥菌對(duì)抗生素的耐藥性,有效提高抗生素療效,探究其機(jī)制發(fā)現(xiàn),可能是通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答,影響T、B等細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子實(shí)現(xiàn)的[10]。綠原酸是芪歸銀方重要活性藥理成分,是一種具有生物活性的酚酸類(lèi)物質(zhì),具有抗氧化活性、抗菌、抗炎、解熱、抗病毒等作用[11～13]。有研究顯示,小鼠感染肺炎克雷伯桿菌后,綠原酸治療組,尤其是綠原酸+抗生素治療組顯著降低了血清中炎性細(xì)胞因子的水平,改善了小鼠存活率和肺病理變化,證實(shí)綠原酸可有效減輕肺炎克雷伯桿菌感染小鼠的肺部感染,與抗生素合用可增強(qiáng)其抗菌作用[14]。本研究以LPS預(yù)制RAW264.7炎癥,同樣發(fā)現(xiàn)綠原酸可降低炎性相關(guān)通路因子水平及炎性細(xì)胞因子水平,發(fā)揮抑制巨噬細(xì)胞炎癥的作用。

HMGB1是免疫網(wǎng)絡(luò)的核心調(diào)控分子,可通過(guò)促進(jìn)對(duì)無(wú)菌或感染性刺激的免疫反應(yīng)在調(diào)節(jié)先天性免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。HMGB1參與免疫反應(yīng)的方式多樣,經(jīng)研究證實(shí),通過(guò)遞送LPS和促進(jìn)內(nèi)吞作用,HMGB1可激活非經(jīng)典抗炎途徑并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,揭示HMGB1是調(diào)節(jié)炎癥的重要靶點(diǎn)[16]。NF-κB是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族,因它能夠調(diào)節(jié)參與建立免疫和炎性反應(yīng)的基因的轉(zhuǎn)錄,因此被認(rèn)為是炎性反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[17]。炎癥會(huì)誘導(dǎo)HMGB1激活NF-κB信號(hào)通路,繼而維持炎性微環(huán)境[18]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)通路相關(guān)因子mRNA水平的檢測(cè),提示綠原酸抑制炎性反應(yīng)的作用可能是通過(guò)HMGB1調(diào)控NF-κB通路實(shí)現(xiàn)的。

IL-1β及MCP-1是炎性反應(yīng)中的標(biāo)志性因子,MCP-1又稱(chēng)趨化因子(CC基序)配體2(C-C motif chemokine ligand 2, CCL2),來(lái)自CC趨化因子家族,可吸引或增強(qiáng)其他炎性細(xì)胞因子/細(xì)胞的表達(dá),在炎癥應(yīng)答過(guò)程中起重要作用,近年來(lái)研究顯示,在人類(lèi)多種肺部疾病中均有表達(dá)異常升高的現(xiàn)象[19,20]。本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)各組上清中IL-1β及MCP-1蛋白濃度結(jié)果顯示,與模型對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組顯著降低了IL-1β的水平。PTGS2是參與前列腺素生物合成的關(guān)鍵酶,有研究提示PTGS2在炎癥期間水平升高,此外,慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)異常炎癥與PTGS2密切相關(guān),提示PTGS2可作為潛在的炎癥標(biāo)志物[21]。同樣,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)可通過(guò)抑制T、B細(xì)胞的增殖分化,降低NK細(xì)胞的殺傷作用及補(bǔ)體系統(tǒng)的溶菌作用,調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的吞噬能力及對(duì)抗病原微生物的反應(yīng)能力,來(lái)達(dá)到調(diào)節(jié)免疫炎性反應(yīng)的作用[22]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組mRNA水平發(fā)現(xiàn),綠原酸組明顯降低各炎癥標(biāo)志物的mRNA水平,這表明綠原酸具有明確降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎性反應(yīng)的作用。

巨噬細(xì)胞在免疫反應(yīng)中有著不可替代的作用,通過(guò)吞噬、遞呈抗原和分泌細(xì)胞因子參與免疫反應(yīng)[23]。由于不同的刺激,巨噬細(xì)胞可以極化成幾個(gè)不同的亞群,其中交替激活或抗炎M2型巨噬細(xì)胞主要由一些細(xì)胞因子(IL-4、IL-10和IL-13)、糖皮質(zhì)激素、免疫球蛋白復(fù)合物或Toll樣受體等刺激分化而來(lái)[24]。M2型巨噬細(xì)胞可控制炎癥和適應(yīng)性Th2免疫,支持血管生成,修復(fù)受損組織,清除碎屑,還可引起過(guò)敏性炎癥、幫助腫瘤組織生長(zhǎng)[25]。Arg-1是經(jīng)典的M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記因子[26,27]。本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)M2型巨噬細(xì)胞的活化狀態(tài),結(jié)果顯示經(jīng)LPS干預(yù)后,上清中Arg-1水平明顯下降,而經(jīng)過(guò)綠原酸處理后顯著升高,提示綠原酸調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化可能是綠原酸發(fā)揮抗炎作用的一種途徑。

綜上所述,綠原酸對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥具有明確的抑制作用,其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控HMGB1介導(dǎo)的NF-κB通路,進(jìn)而抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá),從而發(fā)揮抗炎作用,這為耐藥菌肺炎的中醫(yī)藥防治提供了潛在的靶點(diǎn)及可能的策略。